JPH02180892A

JPH02180892A - 新規リン酸誘導体及びそれを用いた酸性ホスファターゼ活性測定法

Info

Publication number: JPH02180892A
Application number: JP12843189A
Authority: JP
Inventors: Katsumasa Kuroiwa; 黒岩　勝昌; Katsuhiro Katayama; 勝博片山; Shunei Miura; 俊英三浦; Takeshi Nagasawa; 長澤　健
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 1988-09-19
Filing date: 1989-05-22
Publication date: 1990-07-13
Anticipated expiration: 2010-01-25
Also published as: JPH075616B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】３．１　　産業上の利用分野本発明は一般式（Ｉ）Ｌ式中Ｘはハロ（ｎ＝０〜３）である。

又はその塩。

（２）一般式（Ｉ）ゲン原子、Ｒは−（ＣＨ２）ｎＣＨ３］で表わされる新規リン酸誘導体［式中Ｘはハロゲン原子、Ｒは−（ＣＨ２）ｎＣＨ３Ｅ
式中Ｘはハロゲン原子、Ｒは−（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎ
＝θ〜３）である。】で表わされる新規リン酸誘導体又
はその塩、及びそれを基質として用いることを特徴とす
る酸性ホスファターゼ活性の測定法に関する。

本発明は、新規リン酸誘導体及びそれを用いる測定法で
あり、本発明によれば酸性ホスファターゼ活性を正確か
つ簡便に測定することができ、酸性ホスファターゼを測
定するための臨床検査用測定法として医学的治療や臨床
検査の分野において極めて有用である。

３．２　　従来の技術酸性ホスファターゼ（以下Ａｃｐと記す）は、酸性条件
下（ｐＨ４〜６）において、リン酸モノエステルを加水
分解する酵素で、前立腺癌、骨転移をもつ乳癌や骨疾患
、肝および腎疾患患者では血清又尿中のＡｃｐの上昇が
みられ、特に前立腺癌において著しく上昇し、腫瘍マー
カーとしてＡｃｐ活性測定は注目されている。

従来、酸性ホスファターゼ活性測定法については、以下
に示すように種々の合成基質を使用する方法が報告され
ており、また日常の臨床検査に実用化されているものも
ある。

（ａ）　　ｐ−グリ七ロリン酸を基質とする方法［Ｂｏ
ｄａｎｓｋｙ、Ａ、　：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
、、　１０１９３．　（１９３３）　］　：］ｐ−グリ
セロリンは、Ａｃｐによって加水分解され、グリセリン
と無機リンを生じ、この無機リンを発色させ測定する。

（ｂ）　　ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とする方法
［Ｈｕｄｓｏｎ、　Ｐ、Ｂ−：　Ｊ−Ｕｒｏｌ、ｔ　５
Ａ、８９ｐ　（１９４７）　］　：Ａｃｐによる加水分
解で生じたｐ−ニトロフェノールをアルカリによって発
色させ測定する。

（ｅ）　　フェニルリン酸を基質とする方法：Ａｃｐに
よる加水分解で生じたフェノールをＦｏｌｉｎ−Ｃ１ｏ
ｃａｌｔｅｎ試薬で発色させる方法［Ｋｉｎｇ。

Ｅ、　Ｊ、、　Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ、　Ａ、　Ｒ，：　
Ｃａｎａｄ　、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、　Ｊ、。

３Ｘ、３７６、　（１９３４月、犀び生じたフェノール
を４−アミノアンチピリンを用いて酸化縮合させ生成す
る赤色キノンを測定する方法［Ｋｉｎｄ、　Ｐ、　Ｒ，
Ｎ。

Ｋｉｎｇ、　Ｅ、Ｊ、：　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈ
、、ヱ、　３２２．　（１９５４）　］がある。

（ｄ）　　ナフチルリン酸を基質とする方法［Ｈｉｌｌ
ｍａｎ。

Ｇ、　：　Ｚ、　Ｋ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、　Ｋ１１ｎ
、Ｕ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　９　、２３７゜（１９７
１）］　：Ａｃｐによる加水分解で生じたナフトールにＦａｓｔ　
Ｒｅｄ　ＴＲを反応させてアゾ色素とし比色測定を行う
。

（ｅ）　　２．６−ジクロロ−４−二トロフェニルリン
酸を基質とする方法［Ｔｅｓｈｉｍａ、　Ｓ、　Ｈａｙ
ａｓｈｉ、　Ｙ、　Ａｎｄｏ。

Ｍ、　：　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、、　１
６８２３１．　（１９８７）　］　：Ａｃｐによる加水
分解で生じた２、６−ジクロロ−４−二トロフェノール
の黄色の色調を４００　ｎｍで比色測定する方法である
。

３．３　　発明が解決しようとする課題これらの測定法
には種々問題点があり、測定値の不正確さの原因になっ
ている。例えば（ａ）では正常血清中に無機リンが含ま
れているため、あらかじめ被検血清中の無機リンを測定
しておかなければならずまた繁雑な操作を必要とし実用
上の問題がある。（ｂ）はＡｃｐの至適ｐＨである酸性
域で酵素反応した後、カセイソーダ水溶液等でアルカリ
性にしないと色原体であるｐ−ニトロフェノールが呈色
せず、それ故にレートアッセイが出来ない。また測定波
長である４０５　ｎｍでは、色原体のＵ、　Ｖ、スペク
トルのスロープであり、また血清中のビリルビンの影響
を強く受け、測定値の誤差原因になっている。（Ｃ）は
（ｂ）と同様にＡｃｐによる加水分解で生じたフェノー
ルを呈色する反応が必要となりレートアッセイが出来な
い。またフェノールと４−アミノアンチピリンとの呈色
も不安定であり測定値の誤差原因になっている。（ｄ）
は、遊離したナフトールと反応させるＦａｓｔ　Ｒｅｄ
　ＴＲが不安定である。また、この方法はレートアッセ
イも出来、自動分析装置に適用可能だが、反応に大きな
ラグタイムがあり測定値の誤差原因になっている。

（ｅ）は、呈色反応を必要とせずレートアッセイが出来
、自動分析装置にも適用可能であるが、測定波長が４０
０ｎｍ近傍であるため血清中のビリルビンやヘモグロビ
ンの影響を受は易すくさらに基質そのものが水溶液中で
不安定であり、自然加水分解が起る。

以上、述べたごとく、従来のＡｃｐ活性測定法は種々の
欠点を有し、測定値の誤差原因になるなど実用上問題が
ある。

３．４　　課題を解決するための手段状々は従来法の欠点を解決すべく鋭意研究し本発明に到
達した。即ち、一般式（Ｉ）で示される新規化合物を合
成し、かかる化合物を基質として用いるＵＶ法によるＡ
ｃｐ活性測定について検討したところ、この方法は測定
波長として約３２０〜３７０　ｎｍの波長を使用するこ
とが出来、非酵素的加水分解に対して極めて安定であり
、血清中のＡｃｐと特異的に反応するなどの知見を得た
。

従って、本基質を用いることにより極めて正確に再現性
よ＜　Ａｃｐ活性を測定することが可能になり、その他
種々の利点を有する測定が可能になった。

即ち、本発明は一般式（Ｉ）酸誘導体の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウ
ム塩などのアルカリ金属塩；トリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン塩、シクロヘキシルアミン塩、ジシクロ
ヘキシルアミン塩などのアミン塩等が挙げられる。

新規リン酸誘導体は、例えば以下に示す反応スキームに
より合成することができる。

［式中Ｘはハロゲンであり、Ｒは−（ＣＨ２八Ｃへ３（
ｎ＝０〜３）である。Ｊで表わされる新規リン酸誘導体
又はその塩、及びこの新規リン酸誘導体又はその塩を基
質として用いること特徴とする酸性ホスファターゼ活性
の測定法である。

上記式（Ｉ）のＲはメチル、エチル、プロピル又はブチ
ルである。Ｘは、例えば塩素、臭素、フッ素などのハロ
ゲン原子である。上記式（Ｉ）の新規リン（Ｖ）即ち、２，６−ジハロフエノール（ＩＩ）を酸無水物と
反応させてエステル化して２，６−ジハロフエノールエ
ステル（１■）とし、次いで塩化アルミニウム、塩化亜
鉛などの触媒の存在下にＦｒ１ｅｓ転位を行い２゜６−
シハロー４−アシルフェノール（ＩＶ）を得、水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物
［ＭｅｔＯＨ（ＶＩ月と反応させて対応する塩（Ｖ）と
した後、オキシ塩化リン（ｐｏｃｅ３）と反応し加水分
解することにより式（Ｉ）の新規リン酸誘導体が得られ
る。これらの反応はいずれもそれ自体公知の反応であり
、反応条件は公知の反応と同様である。

新規リン酸誘導体の塩は、式（Ｉ）の化合物と、水酸化
ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化
物；又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、シ
クロヘキシルアミンなどのアミンとを公知の方法で処理
することにより得られる。

次に、新規リン酸誘導体を用いる本発明のＡｃｐ活性測
定法について２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニル
リン酸（以下、ＤＣＡＰ−Ｐと記す）を例にとつて説明
する。

第１図にＤＣＡＰ−Ｐ（ａ）と２，６−ジクロロ−４−
アセチルフェノール（ｂ）のＵ、Ｖスペクトルを示した
。ＤＣＡＰ−ＰがＡｃｐの作用で加水分解するとリン酸
と２，６−ジクロロ−４−アセチルフェノールを生成す
る。リン酸とＤＣＡＰ−Ｐは３００ｎｍ以上ではＵ。

■、吸収はほとんどない。２，６−ジクロロ−４−アセ
チルフェノールは３７０　ｎｍ以下でＵ、Ｖ吸収する。

したがって、Ｕ、Ｖ法によりＡｃｐ活性を測定する方法
においてＤＣＡＰ−Ｐを基質として使用し、測定波長３
００〜３７０　ｎｍで反応を追跡することができ、この
場合他の血清成分の干渉を受けることが少ない。従って
２，６−ジクロロ−４−アセチルフェノールの増加を正
確に追跡することができ、Ａｃｐ活性を正確に測定する
ことが可能である。また、後述する如く、ＤＣＡＰ−Ｐ
は多くの優れた利点を有する。

従って、一般式（Ｉ）の新規リン酸誘導体を用いたＡｃ
ｐ活性測定法として、具体的には例えば次の測定法が提
供される。即ち、Ａｃｐを含む検体と一般式（Ｉ）で表
わされる新規リン酸誘導体又はその塩とを混合し、次い
で吸光度、特に３００〜３７０　ｎｍでの吸光度を測定
することによりＡｃｐ活性を測定する方法である。

前述の２，６−ジクロロ−４−二トロフェニルリン酸を
基質として用いる方法では、Ａｃｐの至適ｐＨである酸
性域でレートアッセイできるが、測定波長が４００ｎｍ
であるので血清成分であるビリルビンやヘモグロビンの
干渉を強く受ける。これに対し、本発明の測定波長約３
００〜３７０ｎｍではあまり干渉を受けないので至適な
測定条件が容易である。また本発明の新規リン酸誘導体
、例えばＤＣＡＰ−Ｐが加水分解されて生じる２、６−
ジクロロ−４−アセチルフェノールは３００ｎｍ附近に
極大吸収をもち、従って測定波長をピークに設定する事
ができる。この事は分析装置の波長精度の問題から発生
する分子吸光係数の違いなどが非常に小さくなり測定値
の分析装置機種間差などが非常に小さくなることを示し
ている。

更に、本発明の新規基質、例えばＤＣＡＰ−Ｐは非酵素
的加水分解に対して非常に安定である。たとえばｐＨが
５．４の１００ｍＭクエン酸緩衝液中３７°Ｃの条件下
で１０分間ではほとんど加水分解は起きなかった（第５
図）。この結果は測定中非酵素的加水分解は無視でき、
正確にＡｃｐ活性を測定することができることを示して
いる。

また、本発明の新規基質リン酸誘導体はＡｃｐに対して
高い親和性を有しており、Ａｃｐの活性測定に適してい
る。

Ａｃｐの活性測定を行うに際してｐＨを一定に保持する
ための緩衝剤として、クエン酸、酢酸、コハク酸、フタ
ル酸などが使用できる。上記以外の緩衝剤でもＰＨ４，
０〜６．０の間において緩衝能を維持できるものであれ
ば用いることが可能である。

例えばＤＣＡＰ−Ｐを基質として用いた場合、１００ｍ
Ｍクエン酸緩衝液ではＡｃｐの至適ｐＨは５．４附近で
あった（第４図参照）。前述のごとく、ＤＣＡＰ−Ｐは
ｐＨ５，４で非酵素的加水分解安定性があるので、本発
明の測定法はＡｃｐの至適ｐＨで反応を行うことができ
る。

３．５　発明の効果本発明のＡｃｐ活性測定法は種々の点で従来法の問題点
が解決されている。本発明の利点を記すと次のごとくで
ある。

（１）測定系の反応機構が単純明快で、測定値の誤差原
因が非常に少ない。

（２）ピークの波長（３３０ｎｍ）で測定可能である。

（３）基質に用いる本発明の新規リン酸誘導体、例えば
ＤＣＡＰ−Ｐが非酵素的加水分解に対し非常に安定なの
で、測定値の再現性が良い。

（４）検体ごとに検体ブランクをたてる必要がないので
簡易かつ迅速に測定でき、多数の検体を処理する事が可
能である。

（５）本発明の新規リン酸誘導体、例えばＤＣＡＰ−Ｐ
が安定であるので、至適ｐＨ（５，４）で反応が可能で
ある。

（６）本発明の新規リン酸誘導体、例えばＤＣＡＰ−Ｐ
が加水分解して生じる２、６−ジクロロ−４−アセチル
フェノールが、Ａｃｐの至適ｐＨ：（５，４）で測定波
長における分子吸光係数が充分大きいので、ｐ−ニトロ
フェノールの様に、−度反応を停止しアルカリ性にして
比色測定するなどの操作をせず、連続的に反応追跡する
事ができる。

（７）自動分析装置に簡単に適用できる。

（８）本発明の新規リン酸誘導体はＡｃｐに対して高い
親和性を有しており、Ａｃｐの活性測定に適している。

以上のごとく、本発明のＡｃｐ活性測定法は従来法の有
する問題点を解決し、多くの利点や特徴を有し、正確か
つ簡便にＡｃｐ活性を測定でき、日常の臨床検査のＡｃ
ｐ活性測定に充分貢献できるものである。

３．６　実施例以下に実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明はこれによって限定されるものではない。

実施例１゜２６−ジクロロ−４−アセチルフェニルリン酸の合久（１）　　２．６−ジクロロフェノール５０．０ｇを無
水酢酸２８ｍｅに溶解し、濃硫酸１，２滴を加え、１３
０°Ｃ１１０分間、反応させ、アセチル化を行い反応後
反応液を氷水３００ｍ（に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、
酢酸エチル相を無水硫酸マグネシウムで一晩乾燥後、酢
酸エチルを濃縮し無色の油状物５８．２ｇを得た。次に
、その油状物をニトロベンゼン１５０ｍ４’に溶解し、
それに粉末状の塩化アルミニウム５６．８　ｇを徐々に
加え、６０〜７０°Ｃで２７時間反応させ、Ｆｒ１ｅｓ
転位を行なった。反応終了後、反応液を冷希塩酸１ｅに
注ぎ、有機相と水相とを分離し、有機相を２Ｎ水酸化ナ
トリウム水溶液で抽出した。抽出後、溶液を５Ｎ塩酸を
加え酸性とし、さらに、酢酸エチルで抽出し、無水硫酸
マグネシウムで乾燥後、濃縮し、２，６−ジクロロ−４
−アセチルフェノールの粗結晶３８．５　ｇを得た。こ
の結晶を熱酢酸エチルで再結晶し、純粋な白色の２，６
−ジクロロ−４−アセチルフェノールの結晶、１９．９
　ｇを得た。

２．６−ジクロロ−４−アセチルフェノール（３，５−
ジクロロ−４−ヒドロキシアセトフェノン）Ｃ９Ｈ６Ｃ
６２ｏ□ ｍ、ｐ、　１６０〜１６２°Ｃ元素分析値Ｅ％］　　Ｆｏｕｎｄ、　　Ｃａ１ｃｄ。

Ｃ・４７．０５　４６．８６Ｈ；２．７８　２．９５（２）　　２．６−ジクロロ−４−アセチルフェノール
８．９ｇをアセトンに溶解し、水冷下、２Ｎ水酸化ナト
リウム水溶液１０．８　ｍ（を加える。

この溶液に再びアセトン及びエーテルを加え結晶を析出
させる。ろ取した結晶を減圧乾燥する。

淡黄色の２，６−ジクロロ−４−アセチルフェノールの
ナトリウム塩８．０４ｇを得た。次にこのナトリウム塩
２．６１　ｇを、約１０°Ｃに冷やしなオキシ塩化リン
１０．４　ｍｅ中に徐々に加える。添加後、１２〜１５
°Ｃで３０分間反応させる。析出した塩化ナトリウムを
ろ別技、ろ液を濃縮しかつ色の油状物を得た。この油状
物に、約１００ｍ？の冷水を加え、４５分間０°Ｃから
室温で加水分解反応を行なった。不溶物をろ別した後、
そのろ液を酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウム
で乾燥後、酢酸エチルを濃縮すると、２，６−ジクロロ
−４−アセチルフェニルリン酸の粗結晶１．２２ｇを得
る。この粗結晶を熱酢酸エチルｌｎ−ヘキサンで再結晶
し、６８２　ｍｇの結晶を得た。さらに、この結晶をカ
ラムクロマトグラフィ（固定相；５ｅｐｈａｄｅｘ＠Ｌ
Ｈ−２０、溶媒：メタノール）で精製し、２．６−ジク
ロロ−４−アセチルフェニルリン酸の白色結晶５２１ｍ
ｇを得た。

２．６−ジクロロ−４−アセチルフェニルリン酸ｃｓ　
Ｈ７Ｃｅρ５　Ｐ　　　ｍ、　ｐ、　　１６５〜１７０
°Ｃ（ｄｅｃ）元素分析値Ｅ％］　　Ｆｏｕｎｄ　、　
Ｃａ１ｃｄ。

Ｃ３３，３８３３，７１Ｈ２，５３２，４８ＵＶスペクトルおよびＩＲスペクトルをそれぞれ第１図
、２図に示した。

実施例２瓜えΔ組皿１鳳定汰（１）　　１００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ５，４（２５
°Ｃ）（２）検体（３）７．８ｍＭ１質（ＤＣＡＰ−Ｐ）液（１）の緩衝
液２．０　ｍｔ’に検体０．１　ｍｆｆを加え２〜１０
分間程度３７°Ｃで予加温し、それに（３）の基質液０
．５ｍｅを加え、同時にストップウォッチをスタートさ
せ正確に１分、２分の３３０　ｎｍにおける吸光度を測
定し１分間当りの吸光度変化を求める。第３図にタイム
コースを示した。

検体は、ヒト前立腺由来Ａｃｐ（シグマ社製）を使用し
た。Ａｃｐ活性値は下記の式により計算される。

１）ΔＯＤ　／　ｍｉｎは測定波長３３０　ｎｍにおけ
る１分間当りの吸光度の変化量。

２）波長３３０ｎｍにおける２、６−ジクロロ−４−ア
セチルフェノールの分子吸光係数は、１８５００である
。

上式より、使用した検体のＡｃｐ活性は２０５　（ＩＵ
／ｅ　）であった。第３図に示したごとく、１０分分間
時的に直線性を示した。これは自動分析装置が使用可能
なことを示している。

実施例３実施例２の（１）の緩衝液のｐＨを４．８から６．２ま
で変化させ、この方法におけるＡｃｐの至適ｐＨを求め
た。緩衝液のｐＨ以外は全て実施例２に従った。その結
果を第４図に示した。この条件下では至適ｐＨは５．４
であった。

実施例４実施例２の（１）の緩衝液２．０ｍぞに（３）の基質液
０．５ｍ４’を加え、３７°Ｃの保温セルに入れ、波長
３３０ｎｍにおける吸光度の変化を経時的に追跡し、基
質の非酵素的加水分解安定性を調べた。その結果は第５
図に示したごとく、１０分まではほとんど安定であった
。基質ＤＣＡＰ−Ｐは至適ｐＨ５，４において安定であ
るので、検体ごとの試薬ブランクを測定する必要はない
。

実施例５実施例２に従い、ヒト前立腺由来Ａｃｐの希釈率と酵素
活性の関係を調べた（第６図）。検体希釈は実施例２の
（１）を用いて行った。第６図に示したごとく、検体希
釈と酵素活性は原点を通過する直線的な比例関係にあり
Ａｃｐ活性が低単位から高単位まで幅広く測定できるこ
とが明らかになった。

実施例６実施例２の（３）の基質液を適宜希釈して用い、Ｌｉｎ
ｅｗｅａｖｅｒ　−Ｂｕｒｋプロットより、本基質に対
するＫｍ値を求めたところ０．１４　ｍＭ　／　ｅであ
った（第７図）。このことから基質のＡｃｐに対する親
和性は高く、この反応系に十分な適応性を備えているこ
とが明らかになった。

実施例７２６−ジプロモー４−アセチルフェニルリン酸の合久（１）　　２．６−ジプロモフエノール５．０ｇを無水
酢酸５ｍ（に溶解し、濃硫酸１滴を加える。時々手で振
り撹拌し発熱がおさまったら、氷水５０ｍｅにその溶液
を注ぎ、析出した酢酸−２，６−ジブロモフェニルの結
晶をろ取し、冷水で洗浄し、減圧乾燥を行なった。

次にこの酢酸−２，６−ジブロモフェニルをニトロベン
ゼン２０ｍ１に溶解し、それに粉末状の無水塩化アルミ
ニウム４．０ｇを徐々に加え、６０〜７０°Ｃで５０時
間反応させ、Ｆｒ１ｅｓ転位を行なった。反応終了後、
反応液を冷希塩酸１００ｍ（に注ぎ一晩５°Ｃに放置後
、析出結晶をろ取し、ｎ−ヘキサンで洗浄し、減圧乾燥
を行ない、２，６−ジプロモー４−アセチルフェノール
の粗結晶３．８７　ｇを得た。この結晶を熱酢酸エチル
で再結晶し、純粋な薄かつ色の２，６−ジプロモー４−
アセチルフェノールの結晶２．４２　ｇを得た。

２．６−ジプロモー４−アセチルフェノール（３，５−
ジブロモ−４−ヒドロキシアセトフェノン）ＣＢＨ６Ｃ
６２０２ｍ、　ｐ、　１８０〜１８３°Ｃ元素分析値［
％］　　　Ｆｏｕｎｄ、　　　Ｃａ１ｃｄ。

Ｃ・　　３２．７１　　　３２．６９Ｈ；　　　　１．９０　　　　２．０６（２）　　２．
６−ジプロモー４−アセチルフェノール２．２１ｇをア
セトンに溶解し水冷下２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液３．
７５　ｍ（を加える。この溶液に再びアセトン及びエー
テルを加え、析出した結晶をろ取し減圧乾燥する。淡黄
色の２，６−ジブロモアセチルフェノールのナトリウム
塩１．８８ｇを得た。次にこのナトリウム塩０．９０ｇ
を１０ｍ（のｎ−ヘキサンに懸濁させ、−１０°Ｃに冷
却したところですキシ塩化リン２ｍ？を滴下する。滴下
後、反応液の温度を室温に戻し、２０時間反応させる。

析出した塩化ナトリウムをろ別技、ろ液を濃縮し、かつ
色の油状物を得た。この油状物に氷水５０ｍｅｆを加え
、０〜１５°Ｃで１時間、３０〜４５°Ｃで１時間加水
分解反応を行なう。不溶物をろ別し、ろ液に塩化ナトリ
ウムを加え飽和とした後、酢酸エチルで抽出し、無水硫
酸マグネ、シウムで乾燥後酢酸エチルを留去すると、２
，６−ジプロモー４−アセチルフェノールの粗結晶３２
３　ｍｇが得られた。この粗結晶をジメチルスルホキ゛
シトな淡かつ色の結晶２３４ｍｇを得た。

ＣＢＨ７Ｂｒ２０５Ｐ　−＋Ｃ３Ｈ７Ｎ０ｍ、ｐ、　１
４９〜１５４°Ｃ元素分析値［％］　　　Ｆｏｕｎｄ、　　　Ｃａ１ｃｄ
。

Ｃ；　　　２８．０３　　　２７．８０Ｈ；　　　　２
．８２　　　２．５６Ｎ　；　　　　１．７５　　　１．７１実施例８２６−ジクロロ−４−ｎ−ブチリル　フェニルリン醒立
念広（１）　　２．６−ジクロロフェノール１０．０ｇを無
水ｎ−酪酸１０ｍ（に溶解し、濃硫酸１滴を加える。時
々手で容器を振り撹拌し、発熱がおさまったら、氷水１
００ｍｅに溶液を注ぐ。この溶液を、ｎ−ヘキサンで抽
出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで一
晩乾燥後、ｎ−ヘキサンを留去し、無色油状のｎ−酪酸
−２，６−ジクロロフェニル１３．２２ｇを得た。次に
、この酪酸−２，６−ジクロロフェニルをニトロベンゼ
ン２５ｍｅに溶解し、それに粉末状の無水塩化アルミニ
ウム１３．８ｇを徐々に加え、５５〜６５℃で４００時
間反応せＦｒ１ｅｓ転位を行なった。反応終了後、反応
液を冷希塩酸５００ｍｆｆに注ぎ、−晩５℃に放置後、
水相を分離し、有機相を２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で
抽出した。抽出後、溶液に５Ｎ塩酸を加え酸性とし、析
出した結晶を酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄後
、無水硫酸マグネシウムで一晩乾燥後酢酸エチルを留去
し、２，６−ジクロロ−４−（ｎ−ブチリル）フェノー
ルの粗結晶２．０９ｇを得た。この結晶をエーテル及び
ｎ−ヘキサンを用いて再結晶し、淡かつ色の純粋な２，
６−ジクロロ−４−（ｎ−ブチリル）フェノールの結晶
１．９５　ｇを得た。

２．６−ジクロロ−４−（ｎ−ブチリル）フェノールＣ
Ｃ１０Ｈ１００２Ｃｅ２．　ｐ、　９３〜９６℃ 元素分析値Ｅ％］　　　Ｆｏｕｎｄ、　　　Ｃａ１ｃｄ
。

Ｃ・　　５１．５８　　　５１．５３Ｈ；　　　　４．３５　　　４，３２（２）　　２．６−ジクロロ−４−（ｎ−ブチリル）フ
ェノール２．３３ｇをアセトンに溶解し、水冷下４Ｎ水
酸化ナトリウム水溶液２．５ｍｔ’を加える。この溶液
に再びアセトン及びエーテルを加え、析出した結晶をろ
取、減圧乾燥し淡かっ色の２，６−ジクロロ−４−（ｎ
−ブチリル）フェノールのナトリウム塩２．１４ｇを得
た。次にこのナトリウム塩２．１４　ｇを２０　ｍｅの
ｎ−ヘキサンに懸濁させ、−１０’Ｃに冷却し、オキシ
塩化リンフ、２５ｍ？を滴下する。滴下後、反応液の温
度を室温に戻し２４時間反応させる。析出した塩化ナト
リウムをろ別技、ろ液を濃縮しがっ色の油状物を得た。

これに氷水７５ｍｅ加え、ｏ℃〜１５°０１時間、４０
〜５０°Ｃで１時間加水分解反応を行なった。

反応後、不溶物をろ別し、ろ液に塩化ナトリウムを加え
飽和とし酢酸エチルで抽出した。無水硫酸マグネシウム
で乾燥後、酢酸エチルを留去し２．６−ジクロロ−（ｎ
−ブチリル）フェニルリン酸の粗結晶２．０６　ｇを得
た。この粗結晶をＤＭＦエーテルで再結晶し、２，６−
ジクロロ−４−（ｎ−ブチリル）フェニルリン酸・ＤＭ
Ｆの純粋な白色結晶１．７９　ｇを得た。

２．６−ジクロロ−４−（ｎ−ブチリル）フェニルリン
酸ｍ、　ｐ、　７８〜８０°ＣｃｌＯＩ（１１ｃｒ２ｏ５　Ｐ　−Ｃ３Ｈ９ＮＯ元素分
析値［％ｌ　　　Ｆｏｕｎｄ、　　　Ｃａ１ｃｄ。

Ｃ；　　　４０．３９　　　４０．４３Ｈ；　　　　５
．１８　　　　４．７ＯＮ　；　　　　３．６１　　　
　３．６３実施例９実施例２の（３）の基質（ＤＣＡＰ−Ｐ）の代わりとし
て、２，６−ジブロモアセチルフェニルリン酸（ＤＢＡ
Ｐ−Ｐ）及び２，６−ジクロロ（ｎ−ブチリル）フェニ
ルリン酸（ＤＣＢＰ−Ｐ）を用いてＡｃｐ活性の測定を
行なった。試薬及び操作は実施例２に準拠した。

第８図及び第９図にその時のタイムコースを示した。ま
た、検体のＡｃｐ活性は、ＤＢＡＰ　−Ｐで１０３ＩＵ
ｌｅ、　ＤＣＢＰ−Ｐで１０９ＩＵ／（であった。分子
吸光係数はそれぞれ１８９００．１１２００である。第
８図及び第９図に示したごとく、１０分分間時的に直線
性を示した。これは、これらの基質においても自動分析
装置が使用可能なことを示している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、（ａ）　ＤＣＡＰ−Ｐ　（濃度５０ｎＭ）お
よびｂ）２゜６−ジクロロ−４−アセチルフェノール（
濃度５０ｎＭ）の１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ５，４（２５’Ｃ）　中のＵ、Ｖスペクトルを示す
。第２図はＤＣＡＰ−Ｐの１．Ｒスペクトルを示す。第３図はＤＣＡＰ−Ｐを基質とした場合の反応タイムコ
ースを示す。第４図はＡｃｐの至適ｐＨを示す。第５図はＤＣＡＰ−Ｐの非酵素的加水分解安定性を示す
。第６図はＡｃｐ希釈と酵素活性との関係を示す。第７図はＳ−ＶカーブとＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒ
ｋプロットを示す。第８図はＤＢＡＰ−Ｐを基質とした場合の反応タイムコ
ースを示す。第９図はＤＣＢＰ−Ｐを基質とした場合の反応タイムコ
ースを示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）［式中Ｘはハロゲン原子、Ｒは−（ＣＨ＿２）＿ｎＣＨ
＿３（ｎ＝０〜３）である。］で表わされる新規リン酸
誘導体又はその塩。
（２）一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）［式中Ｘはハロゲン原子、Ｒは−（ＣＨ＿２）＿ｎＣＨ
＿３（ｎ＝０〜３）である。］で表わされる新規リン酸
誘導体又はその塩を基質として用いることを特徴とする
酸性ホスファターゼ活性の測定法。