DK161028B

DK161028B - Middel, testmateriale og fremgangsmaade til bestemmelse af tilstedevaerelsen af leukocyter, esterase eller protease

Info

Publication number: DK161028B
Application number: DK153885A
Authority: DK
Inventors: A Christopher Skjold; Herbert Hugl; Gerhard Wolfrum
Original assignee: Miles Inc
Priority date: 1984-04-06
Filing date: 1985-04-03
Publication date: 1991-05-21
Also published as: DK153885A; EP0158204B1; NO164201C; IL74303A; DK161028C; US4637979A; DK153885D0; AU4032285A; IE850870L; ES8607565A1; ES541778A0; FI851354L; CA1228001A; AU554830B2; ATE48157T1; JPH0550278B2; FI851354A0; EP0158204A3; EP0158204A2; NO851169L

Description

DK 161028 B

Den foreliggende opfindelse angår et nyt middel, et nyt testmateriale og en fremgangsmåde til analyse af en testprøve for tilstedeværelsen af en analyt valgt blandt leukocyter, esterase og protease. Opfindelsen er særlig 5 nyttig til detektering af leukocyt-niveauer i legemsvæsker, f.eks. urin, og reducerer laboratorieproceduren for en sådan bestemmelse fra en besværlig optællingsprocedure, der kræver mikroskopisk iagttagelse, til en hurtig og let "dyp-og— aflæs"-operation.

10 Tilstedeværelsen af et unormalt højt niveau af leuko cyter i en patients urin er en mulig indikation på sådanne patologiske tilstande som nyre- eller urogenital-infektion eller anden sygelig funktion. En nøjagtig information om leukocytniveauet i urinen kan således være et uvurderligt 15 værktøj for lægen ved diagnosen og behandlingen af sådanne patologiske tilstande.

Traditionelt har man inden for den medicinske profession forladt sig på visuel bestemmelsesteknik til optælling af leukocytpopulationer i urinsediment eller ikke-centrifuge-20 ret urin, en metode, der kræver dyrt udstyr, f.eks. en centrifuge og et mikroskop, samt et uforholdsmæssigt stort tidsforbrug for klinikerens vedkommende. Endvidere lider den traditionelle teknik af den ulempe, at der kun bestemmes intakte celler. Leukocyter, der forekommer i urinsystemet, 25 er udsat for betingelser, der kan favorisere udstrakt cellelyse. Det er eksempelvis kendt, at i urin med unormal høj pH-værdi kan leukocyt-halveringslevetiden være så kort som • 60 minutter. Eftersom lyserede celler unddrager sig detektering ved visuelle bestemmelsesmetoder, kan resultatet blive 30 fejlagtige lave bestemmelser og falske negative resultater.

Af de to metoder til mikroskopisk leukocytanalyse - urinsediment og ikke-centrifugeret homogeniseret urin -er den førstnævnte klart den mest ønskelige. Skønt der kan opnås pålidelige resultater ved den sidstnævnte metode, an-35

O

2

DK 161028 B

vendes der urinsediment-iagttagelse i det overvældende flertal af tilfældene. Dette kræver, at urinprøven centrifugeres, og at sedimentet isoleres og underkastes mikroskopisk undersøgelse. Den person, der foretager analysen, optæller 5 derpå antallet af leukocyter, der viser sig i synsfeltet.

Denne opgave kompliceres yderligere ved tilstedeværelsen af andre urinbestanddele i sedimentet, f.eks. epitelceller og saltpartikler. Det varierende indhold af sedimentbestandde-le, i forbindelse med andre komplicerende faktorer, herunder 10 ikke-homogenitet af prøven og afvigende optiske styrker i det mikroskopiske udstyr, kan føre til enorme fejl ved den endelige bestemmelse.

Det er således åbenbart, at en hurtig og enkel metode til leukocytbestemmelse, en metode, der vil eliminere be-15 hovet for tidsrøvende metoder og omkostningsforøgende udstyr, og som vil give nøjagtigt respons på esterase, protease eller leukocytceller, hvadenten cellerne er intakte eller lyserede, ville udgøre et særdeles væsentligt fremskridt i forhold til teknikkens stade. Et sådant fremskridt tilveje-20 bringes med den foreliggende opfindelse. Endvidere er opfindelsen ikke baseret på evnen til at se leukocyter, men på den enzymatiske aktivitet, som de udviser, og den foreliggende metode er derfor i det væsentlige fri for de ovenfor beskrevne unøjagtigheder.

25 Forud for den foreliggende opfindelse omfattede meto der til bestemmelse af hydrolytiske analytter chromogene estere som, når de hydrolyseres af esterase eller protease, frembringer et farvet, alkoholisk produkt, idet den intakte ester er af en anden farve end den fri alkohol. Mange 30 af disse systemer omfatter acceleratorforbindelser og dia-zoniumsalt-koblingsmidler.

Chromogene estere

Der findes således i den kendte teknik en række re-35 ferencer, der beskriver anvendelsen af. visse estere, som,

O

3

DK 161028 B

når de spaltes ved indflydelse af enzymatisk aktivitet, resulterer i dannelsen af farve eller et andet detekterbart respons. I britisk patentskrift nr. 1.128.371 beskrives anvendelsen af indoxyl- og thioindoxyl-estere som nyttige chro-5 mogener til detektering af hydrolytiske enzymer i legemsvæsker. Enzymerne spalter esteren til dannelse af frit indoxyl, som dernæst oxideres til dannelse af det dimere produkt indigo, et let iagttageligt blåt farvestof. Denne aktivitet menes at skyldes cholinesterase blandt andre enzymer. I det nævnte 10 patentskrift beskrives det også, at udover indoxyIdelen af estersubstratet vælges syreradikalet med særlig reference til det enzym, der skal detekteres. Det angives eksempelvis, at syreradikalet kan være acetat, laurat eller stearat til detektering af henholdsvis esterase eller lipase. Til detek-15 tering af enzymer såsom phosphatase eller sulfatase kan acyl-radikalet være uorganisk. Det britiske patentskrift beskriver således anvendelsen af chromogene estere som substrater til bestemmelse af esterolytiske enzymer, idet sådanne estere omfatter indoxyl eller thioindoxyl som den alkoholiske 20 del af esteren, idet acyldelen er tilpasset til det bestemte enzym, der skal bestemmes.

Virkningen af omhyggelig acylradikal-udvælgelse er intetsteds eksemplicificeret mere tydeligt end i to referencer, der beskriver esterasespecificitet for estere, hvori 25 acylradikalet indeholder en N-beskyttet aminosyre eller et N-beskyttet peptid. Janoff et al., Proc. Soc. Exper. Biol.

Med., 136, 1045-1049 (1971) beskriver således, at alanin-estere er specifikke substrater for esterase, der fås fra humane leukocyter. Specifikt beskrives det i denne referen-30 ce, at en ekstrakt af humane leukocyt-granuler er i stand til at hydrolysere N-acetyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin-me-thylester. Endvidere hydrolyseres L-alanin-p-nitrophenyl--ester tilsvarende, hvorved der fås den gule p-nitrophenol--farveform.

35 Ligeledes beskriver Sweetman et al., Jour. Hist. Soc.,

O

4

DK 161028 B

22, 327-339, anvendelsen af 1-naphthyl-N-acetyl-DL-alanin, 1-naphthyl-N-acetyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin og 1-naph-thyl-butyrat til påvisning af tilstedeværelsen af esterase.

I USA-patentskrift nr. 4.278.763, der er overdraget 5 til Boehringer Mannheim GmbH, kombineres disse metoder ved at pege på indoxyl- eller thioindoxyl-esterne af aminosyrer eller peptider som yderligere et eksempel på et traditionelt farvedannende substrat for leukocytisk esteraseaktivi-tet. Ligesom Janoff- og Sweetman-litteraturstederne beskri-10 ver Boehringer-patentet ækvivalensen mellem protease og esterase med hensyn til deres esterolytiske tilbøjeligheder.

Acceleratorer 15 Det er kendt, at esterhydrolysereaktioner kan akti veres ved tilstedeværelsen af mange nucleofile midler, herunder et meget stort antal alkoholer. Graden af hydrolyse af phenylacetat og p-nitrophenylacetat med.esterase forøges således fra 2,5 til 5,5 gange ved tilsætning af methanol 20 eller butanol, jfr. Greenzaid og Jencks, Biochemistry, 10(7), 1210-1222 (1971). Endvidere forøges effekten med længden af n-alkylgruppen, jfr. Wynne og Shalatin, Eur. J. Biochem., 31, 554-560 (1972).

I særdeleshed er denne aktiveringseffekt for alkoho-25 ler blevet iagttaget med estere af aminosyrer. p-Nitrophe-nyl-N-acetyl-L-alaninat-hydrolyse aktiveres (accelereres) ved tilstedeværelsen af methanol, jfr. Fastrez og Fersht, Biochemistry, 12(11), 2025-2034 (1973). Alkoholer med høj molekylvægt forøger graden af esteraseinduceret hydrolyse 30 af p-nitrophenyl-tert.BOC-L-tyrosinat, jfr. Ashe og Zimmerman, Biochem. and Biophys. Res. Comm., 75(1), 194-199 (1977). I USA-patentskrift nr. 4.299.917 beskrives der andre kendte esterhydrolyse-aktivatorer, f.eks. visse metalkomplekser, pyridinderivater og imidazoler.

35

O

5

DK 161028 B

Diazoniumsalt-koblingsmidler

Det er også kendt at anvende visse diazoniumsalte til kobling med phenoler og pseudophenoler til dannelse af azofarvestoffer, jfr. Martinet og Dornier, Compt. Rend., 5 170, 592 (1920). En sådan teknik anvendes ved en esterase- analyse, ved hvilken indoxylestere hydrolyseres via esterase til dannelse af indoxyl, som dernæst kobles med et diazoniumsalt til dannelse af det tilsvarende azofarvestof, jfr. Holt og Hicks, J. Cell Biol., 29, 261-366 (1966), 10 Gossrau, Histochemistry, 57, 323-342 (1978) samt vesttysk offentliggørelsesskrift nr. 3.017.721, indleveret den 9. maj 1980.

De diazoniumsalte, der kendes til anvendelse som koblingsmidler i et middel til detektering af leukocyter, 15 esterase eller protease, beror på en exogen anion til modvirkning af diazo-kationen. Endvidere lider de hidtil diskuterede sammensætninger, i alt fald i nogen grad, af interferens eller unøjagtighed på grund af tilstedeværelsen af phenoliske eller andre forbindelser, der er nærvæ-20 rende i prøven, der er i stand til at reagere med diazoni-umsaltet. En sådan interferens kan resultere i falske negative bestemmelser.

Til sammenfatning af baggrunden af teknologisk udvikling, der fører frem til den foreliggende opfindelse, 25 kan det anføres, at der kendes flere metoder til bestemmelse af hydrolytiske enzymer og leukocytceller i opløsning. Til måling af leukocytpopulationer i f.eks. urin har mikroskopi længe været den foretrukne metode. Det har således været nødvendigt for teknikeren at fremstille et mi-30 kroskopisk præparat af en urinprøve og at optælle antallet af leukocytceller i mikroskopets synsfelt, en procedure, der kræver et uforholdsmæssigt stort forbrug af tid og dyrt udstyr, f.eks. et mikroskop og en centrifuge.

Kemiske og biokemiske metoder erstatter i øjeblik-35 ket hurtigt den mikroskopiske teknik til bestemmelse af

DK 161028 B

6 leukocyter ved diagnostiske metoder og er tidsmæssigt fordelagtige værktøjer i researchlaboratoriet. Chromogene estere, der har dannet grundstenen for kemiske tests, omfatter de følgende alkohol- og acyldele: 5 Alkohol-(phenol-)dele Acvlqrupper indoxyl acetat thioindoxyl butyrat p-nitrophenyl laurat α-naphthol stearat 10 aminosyre peptid

Kemiske metoder, ved hvilke der anvendes sådanne estere, er blevet understøttet af forskellige hydrolyse--acceleratorer samt diazoniumsalt-koblingsmidler. Som acce-15 leratorer er der blevet anvendt mange alkanoler ligesom visse metalkomplekser, pyridinderivater og imidazoler. Diazo-niumkationer, der har passende exogene anioner ionisk bundet eller forbundet dertil, er velkendte som koblingsmidler til sådanne kemiske metoder, hvorved den alkohol eller phenol, 20 der dannes ved hydrolyse af esteren, kobles med diazoniumsal-tet til dannelse af et azofarvestof. Det er imidlertid også kendt, at der kan fremkomme falske negative eller fejlagtigt lave bestemmelser ved interferens med diazoniumsaltet med phenoler og andre forbindelser i prøven, der reagerer med 25 diazoniumsaltet.

Det er opfindelsens formål at tilvejebringe et middel, der ikke har de ovenfor angivne ulemper, og som giver hurtigt og nøjagtigt respons på esterase, protease eller leukocyt-celler, hvadenten cellerne er intakte eller lyserede.

30 Dette opnås med den foreliggende opfindelse, hvor der tilvejebringes et nyt testmiddel, et nyt testmateriale og en ny fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af leukocyter, esterase eller protease i en testprøve. Midlet ifølge opfindelsen, der er af den i krav l's indledning 35 angivne art, er ejendommeligt ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

DK 161028B

7

Testmaterialet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det omfatter en bærematrix, hvori midlet er inkorporeret. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man bringer prøven i kontakt med materialet og iagt-5 tager et detekterbart respons.

Visse udtryk, der anvendes i den foreliggende beskrivelse, bør nævnes på dette sted til sikring af, at de respektive betydninger opfattes korrekt. De følgende definitioner gives således til klargørelse af opfindelsens omfang 10 og til muliggørelse af dens formulering og anvendelse.

Udtrykkene "N-blokeret aminosyrerest" og "N-blokeret peptidrest" kræver hver to definitioner. "N-blokeret" henviser til de kemiske forhold af aminogruppen i en aminosyre eller et peptid, hvor et hydrogenatom bundet til nitrogen-15 atomet er erstattet med en beskyttende gruppe, f.eks. acetyl, p-toluensulfonyl(tosyl) eller tert.butyloxycarbonyl(tert.BOC) eller andre N-beskyttende grupper, der kendes i teknikken.

Ved udtrykkene "aminosyrerest" og "peptidrest" menes der et aminosyre- eller peptidmolekyle uden OH-gruppe i 20 carboxylgruppen.

Ved udtrykket "aryl" henh. "aromatisk heterocyclisk gruppe" skal der forstås ethvert ringsystem af aromatisk natur. Omfattet af udtrykket er sådanne 5- og 6-leddede ringe som pyrrol, phenyl og pyridyl samt kondenserede ring-25 systemer såsom naphthyl. Det aromatiske ringsystem kan således være heterocyclisk eller homocyclisk og kan være substitueret eller usubstitueret, forudsat at substituentgrupper eller -grupperne ikke interfererer med materialets evne til hydrolyse i nærværelse af leukocytceller, esterase eller 30 protease. Udvælgelsen af sådanne substituenter er en rutinemæssig laboratoriebestemmelse på basis af den foreliggende beskrivelse.

Udtrykket "lavere alkyl" således som det anvendes i nærværende beskrivelse, betegner en alkyldel, der indeholder 35 fra ca. 1 til ca. 6 carbonatomer. Omfattet af udtrykket "lavere alkyl" er methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl,

DK 161028B

8 n-butyl, sek.butyl, tert.butyl og alle isomere af pentyl og hexyl. Disse kan være usubstituerede, eller de kan være substituerede, forudsat at de ikke interfererer med materialets eller testmaterialets evne til detektering af 5 leukocytceller, esterase eller protease.

Udtrykket "egnet pufferstof" betegner en puffer, der, når den bringes i kontakt med en vandig testprøve, vil give en resulterende pH-værdi på mindst ca. 7. Fortrinsvis er pufferen en sådan, der er i stand til at frem-10 bringe en pH-værdi i området fra ca. 7 til ca. 10, optimalt fra 8,5 til 9,0, og borsyre-NaOH, bicin(N,N-bis[2-hy-droxyethyl]-glycin) eller CHES (2-[N-cyclohexylamino]--ethansulfonsyre) er eksempler på egnede pufferstoffer.

Udtrykket "accelerator" referer til enhver forbin- 15 delse, der tjener til at forøge hastigheden for hydrolyse af de beskrevne chromogene estere. Omfattet af udtrykket er sådanne kemisk forskellige stoffer som pyridin, imida- zol og deres derivater, metalkomplekser med formlen Dm [B- (CN) (NO) ], hvor D betegner et alkalimetal, B er en tung-11 £* 20 metalion, p er 0 eller 1, m er 2-5, n er 4-8, og m er summen af n og valensen af B, samt alkoholer. Egnede alkoholer har fra 1 til ca. 15 carbonatomer. Lineære alkoholer foretrækkes i forhold til forgrenede alkoholer, omend de sidstnævnte også er omfattet af opfindelsens omfang.

25 Udtrykket "kondenseret ringsystem" betegner to el ler flere aromatiske ringe, der har et par carbonatomer fælles. Eksempelvis i strukturen J§3~k' ai) kan begge substituenterne R sammen danne det kondenserede ringsystem i2+ 9

DK 161028 B

/vy/v / oh ,Τττ·\ par cin) s°3' 5 hvor begge substituenterne R tilsammen betegner Et yderligere eksempel er ofr - 10 S03 hvor begge substituenterne R tilsammen betegnet -fCH=CH-CH=N)·.

Det kondenserede ringsystem er således flerkernet aromatisk og kan være heterocyclisk eller homocyclisk.

15 Udtrykket "detekterbart respons" skal her betegne en ændring i eller fremkomsten af en parameter i et testmiddel-system, der er i stand til at blive opfattet, enten ved direkte iagttagelse eller ved hjælp af et instrument, og som er en funktion af tilstedeværelsen af en specifik analyt i 20 en vandig testprøve. Nogle former for detekterbart respons er ændringer i eller fremkomsten af farve, fluorescens, re-flektans, pH, kemiluminescens og infrarøde spektre.

Udtrykket "anion" som her anvendt omfatter dele, der er negativt ladet ved en pH-værdi i området fra ca. 7 til 25 ca. 10, og som er covalent bundet til ringen som vist ved strukturen (I). Omfattet af definitionen af anionen er sul-fonat, carbonat og phosphonat. Også omfattet af udtrykket er lavere alkyl- og arylgrupper, der er covalent substitueret med dele, der er i stand til at antage en negativ ladning, 30 hvilke substituerede grupper selv er covalent bundet til ringen med strukturen (I). Sidstnævnte omfatter sådanne forskellige former som n-hexyl-6-sulfonat, phenylcarbonat og n-propyl-3-phosphonat.

Midlet ifølge opfindelsen omfatter en ester og et 35 diazoniumsalt. Omend der er et stort spillerum ved valg af disse bestanddele, findes der foretrukne udførelsesformer

DK 161028 B

10 for hver, der vil tilvejebringe de optimale resultater, dvs. en høj grad af detekterbart respons, der udvikles i løbet af kort tid. Denne optimering kan fremmes yderligere ved indføring af en accelerator i midlet.

5

Esteren Såvel midlet som testmaterialet ifølge opfindelsen indeholder en ester af en phenol eller pseudophenol og en syre. Endvidere er esteren en sådan, der er i stand til at 10 blive katalytisk hydrolyseret i nærværelse af leukocyter, esterase eller protease til dannelse af phenolen eller psudo-phenolen, som dernæst er fri til kobling med diazo-zwit-terionen.

Nogle estere, der er egnede til anvendelse ifølge 15 opfindelsen, omfatter indoxylacetat, indoxylbutyrat, indoxyl-laurat, indoxylstearat, indoxylester af en N-blokeret aminosyre eller N-blokeret peptid og thioindoxylanaloge deraf.

Også omfattet er p-nitrophenyl-N-tosyl-L-alaninat, a-naphthyl og alaninat. Yderligere eksempler på esteren omfatter estere 20 med strukturformlen

R* v._^ 0-A

rXJ (v> 25 i hvilken A er resten af en esterdannende syre uden dens karakteristiske sure OH-gruppe, R betyder lavere alkyl, aryl, carboxyl, carboxylester, amido eller cyano, Rx betyder hydrogen, lavere alkyl eller aryl, og X betegner oxygen, svovl eller NRX.

30 Udtrykket "syrerest" omfatter rester af phosphorsyre, sulfonsyre, carbonsyre og carboxylsyre, dvs.

OH 0 .0 0 OH

-P=0, -S, -C^ og -C-RX, H0-C=0 (VI)

35 OH 0 X0H

DK 161028B

11

Estere, der svarer til strukturen (V), omfatter 3-(N-tosyl--L-alaninyloxy)-5-phenyl-pyrrol, l-methyl-3-(N-tosyl-L-ala-ninyloxy)-5-phenyl-pyrrol, 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-(p--chlorphenyl)-pyrrol og 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-phenyl-5 thiophen.

Acceleratoren

Midlet ifølge opfindelsen kan udover esteren indeholde forskellige acceleratorer som defineret i det fore-10 gående. Alkoholer har vist sig være særligt anvendelige til forøgelse af esterase- og protease-katalyseret hydrolyse af de her omhandlede estere. Alkoholer med 8-15 car-bonatomer foretrækkes til dette formål, medens decanol, un-decanol og dodecanol foretrækkes til anvendelse sammen med 15 testmaterialet, primært på grund af deres lave flygtighed sammenlignet med alkoholer med lavere molekylvægt.

Diazoniumsaltet

Midlet indeholder et bestemt diazoniumsalt som et 20 koblingsmiddel. Deltagelse af diazoniumsaltet i den samlede reaktionsrækkefølge kan ses af det følgende eksempel: R* _✓'O-A R*v._^0

Il U Analyt ^ Pi + HO-A

25 H/ > r'Nc·'' R*v._,^° R*v^_✓OH (vn) + ArNæN -> 1 f R^x/ R^VN/^N=N-Ar 3Q hvor ArN =N er diazoniumsaltet (I), og A, R, R og X har den ovenfor angivne betydning. Reaktionsproduktet VII er et azofarvestof, der kan udvise en dyb, distinktiv farve.

Zwitterionen er således en art af diazoniumsalt, hvori modionen til diazoniumgruppen er covalent bundet til 35 ringsystemet. Eksempler på sådanne anioner omfatter sulfo-nyKSOg"), carbonyl ((Χ>2 ), phosphonyl (PO^ ) og andre. Omfattet af omfanget (I) er sådanne forbindelser som 1-dia- 12

DK 161028 B

zonaphthalen-4-sulfonat, l-diazo-2-naphthol-4-sulfonat, l-diazophenyl-3-carbonat og mange andre. Det har vist sig at være mest fordelagtigt at anvende l-diazo-2-naphthol--4—sulfonat.

5 Det ovenfor beskrevne middel kan anvendes som så dant til bestemmelse af leukocyter, esterase eller protease, eller det kan inkorporeres i en bærematrix til dannelse af et testmateriale, hvorved der tilvejebringes et værktøj til hurtig og pålidelig bestemmelse af tilstedeværelse 10 af analytten. Bærematrixen er sædvanligvis, men ikke nødvendigvis et porøst stof såsom filtrerpapir. Andre i teknikken anerkendte former for bærematrixmaterialer er filt, porøse keramiske strimler og vævede eller matterede glasfibre, jfr. USA-patentskrift nr. 3.846.247. Det er også 15 blevet foreslået at anvende træ.,, klæde, svampeagtigt materiale og leragtige stoffer, jfr. USA-patentskrift nr. 3.552.928. Alternativt kan bærematrixen være ikke-porøs, f.eks. forskellige polymere film eller glas. Alle sådanne bærematrixmaterialer kan anvendes i forbindelse med opfin-20 delsen tillige med flere andre. Det har vist sig, at filtrerpapir er særlig velegnet.

Ved en foretrukken fremgangsmåde til fremstilling af materialet fugtes et stykke filtrérpapir med en vandig opløsning af pufferen. Denne første neddypningsopløsning 25 kan også indeholde forskellige behandlingsmidler, f.eks. et detergent, et siettemiddel såsom polyvinylpyrrolidon og andre indifferente bestanddele.

Det imprægnerede filtrérpapir tørres derpå og fugtes med en anden neddypningsopløsning, i acetone eller et 30 andet ikke-vandigt opløsningsmiddel for esteren og, om ønsket, acceleratoren og/eller diazoniumsaltet. Det to gange imprægnerede papir tørres derpå en anden gang, hvorved der dannes et testmateriale, der er sensitivt for nærværelsen af leukocyter eller andre analytter.

Den tørrede, reagensbærende bærematrix kan monteres på et underlagsmateriale, såfremt dette ønskes. En fore- 35

DK 161028 B

13 trukken udførelsesform for testmaterialet omfatter således en filtrérpapir-bærematrix, hvori der er inkorporeret det ovenfor beskrevne middel, idet matrixen på den ene side er fastgjort til et aflangt stykke transparent polysty-5 renfilm. Matrixen er fastgjort til filmen ved hjælp af enhver egnet metode, f.eks. dobbeltsidet adhæsivt tape (Double Stick ®fra 3M Company), idet den anden ende af polystyrenfilmen tjener som et håndgreb. Ved anvendelsen holdes et sådant organ i den frie ende af polystyrenfilm-10 -underlagsmaterialet, og matrixenden nedsænkes i testprøven, f.eks. urin, og fjernes hurtigt igen. Enhver farvedan-nelse eller andet detekterbart respons iagttages efter en forud bestemt tid og sammenlignes med en referencestandard, der svarer til respons for kendte koncentrationer af leuko-15 cyter eller anden analyt med esterase-eller proteaseaktivi-tet. Det har vist sig, at en inkubationstid på fra ca. 1 til ca. 3 minutter sædvanligvis er tilstrækkeligt til, at farveudviklingen kan forekomme i det reagensholdige fil-trérpapir.

20 De følgende eksempler tilvejebringes til yderligere assistance ved udøvelse og anvendelse af den foreliggende opfindelse. Foretrukne udførelsesformer er således beskrevet i detaljer og analyseret med hensyn til resultaterne. Eksemplerne tjener udelukkende til illustration og skal på 25 ingen måde opfattes som en begrænsning af omfanget af den foreliggende opfindelse.

Generelle informationer

Infrarøde (IR) spektre fås med et Perkin-Elmer model 30 710B eller 237 infrarødt spektrofotometer som opløsninger i CHCl^, medmindre andet er angivet. 1602 cm ^-båndet af polystyrenfilm anvendes som en ekstern kalibreringsstandard. Signaler angives som cm

Kernemagnetiske resonansspektre (½ NMR) optages ved 35 89,55 MHz under anvendelse af et JEOL FX-900 spektrometer eller ved 60 MHz under anvendelse af et Varian T-60-spek-trometer. Spektre optages i CDClg-opløsning, medmindre an- det er angivet. Kemiske skift er angivet i Sigma-enheder nedad i strømmens retning fra den interne standard tetra- methylsilan.

14

DK 161028 B

13

Carbon-13-magnetiske resonansspektre ( C NMR) op-5 tages ved 22,5 MHz under anvendelse af JEOL FX90Q-spektro-meter med Fourier-transformation og med fuld protonbred-bånds-støjafkobling. Spektre optages i CDCl^-opløsning, medmindre andet er anført. Carbonskift angives i dele pr. million nedad i strømmens retning fra den interne standard 10 tetramethylsilan.

Massespektre (MS) optages på et Hewlett-Packard 5985A-spektrometer, der anvendes enten med elektronstød (El) eller et hurtigt atombombardement (FAB). Massespektre med høj opløsning fås på et AEI MS-902 spektrometer.

15 Organiske reagenser fås fra Aldrich Chemical Company og anvendes uden rensning, medmindre andet er anført. Uorganiske reagenser er af ACS-reagenskvalitet fra Fisher Scientific Company eller en anden hovedleverandør. Reaktionsopløsningsmidler er af ACS-reagenskvalitet. Tetrahydrofuran 20 (thf) er af HPLC-kvalitet fra J.T. Baker Chemical Company.

Brine refererer til en mættet vandig natriumchloridopløs-ning.

Tyndtlagschromatografi (TLC) udføres under anvendelse af silicagelplader 60F-254 fra E. Merck. Søjlechromatografi 25 udføres under anvendelse af E. Merck-silicagel 60 (70-230 mesh). Alle speltepunkter og kogepunkter, der er angivet, er ukorrigerede.

Fremstilling af nogle pseudophenoliske estere *3 0 ·

De følgende forsøg udføres til illustration af syntesen af estere, der kan anvendes i forbindelse med opfindelsen. Skønt disse forsøg vedrører specifikke udgangsmaterialer og slutprodukter, menes det, at metoderne kan anvendes til et bredt område af de her beskrevne estere.

35

Syntese af 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-phenylpyrrol (4)

Syntesen af 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-phenylpyrrol er illustreret i det følgende reaktionsskema:

O

15

DK 161028 B

COOH ^COOH

ffY ΚΗ505, Η,ο^κα 5 l\yj Acetone, NaHCO^

KOH

\ 10 - +

^COO K

— ch-coo”k+ koh, 2Η,0·Ο-“ ^02N-ffl2-COCH . Qf 2 ^ WcooV WP ^ 15

Ac2°

Pyridin 12(f C

Ψ-

20 ^OH

i—r°'AC jtj ^ 1 J) NaOH/MeOH N ^ ifYT U " <>

Ac 25 + 30 {jo .0-C-CH-CH, Il Π-Π 1 THF Cl-C-CH-CH,

<o ,*^JU Λ c .r ~ A

QJ l 11 >s pyr,J0!nc ·TO \s 35

O

DK 161028 B

16 N-tosyl-L-alanin 100 g (1,11 mol) L-alanin opløses i 2,25 liter 1 N vandig natriumhydroxidopløsning, der afkøles til 5°C, og der omrøres, medens en opløsning af 218 g (1,11 mol) p-to-5 luensulfonylchlorid opløst i 450 ml toluen langsomt tilsæt tes. Blandingen omrøres ved omgivelsernes temperatur i 20 timer. Lagene adskilles, og det kraftigt afkølede vandige lag syrnes til en pH-værdi på 1 med koncentreret saltsyre.

Det hvide faste stof, der er angivet i overskriften, opsam-10 les ved filtrering, vaskes med vand og tørres. Udbytte 178,5 g (66%) med smp. 134-135°C. IR (CHC13) cm"1: 1726, 1340, 1165, 1095. 1H NMR (DMS0-Dg) δ 1,20 (d, J=7, 3H), 2.40 (s, 3H), 3,85 (p, J=8, IH), 6,4 (br s, IH) (C02H), 7.41 (d, JAB =8, 2H) og 7,75 (d, JAB =8, 2H) (center for 15 mønster: 7,58; ΔνΑβ=20,49Ez), 8,03 (br d, J---=8, IH) (NH) .

N-Tosyl-L-alaninylchlorid Metode A

En blanding af 12,4 g (0,05 mol) N-tosyl-L-alanin 20 og 25 ml thionylchlorid opvarmes i 90 minutter ved 55°C og koncentreres derpå på en rotationsfordamper ved 40°C.

Den røde, faste remanens opløses i 200 ml kogende CCl^, affarves med 20 g ovntørret Norit ® 211 (American Norit Co., Inc.), filtreres og afkøles kraftigt. Det flødefar-25 vede faste stof, der er angivet i overskriften, opsamles ved filtrering, vaskes med hexan og tørres. Udbytte 8,48 g (65%) med smp. 101-101,5°C. IR (CHC13) cm-1: 3360, 3260, 3025, 1775, 1605, 1350, 1170, 910; XH NMR (CDCl-j) £ 1,48 (d, J=7, 3H), 2,43 (s, 3H), 4,33 (p, J=8, IH), 5,93 (br d, 30 J&8, IH) (NH), 7,31 (d, J^B =8, 2H) og 7,76 (d, JAB =8, 2H)' (center for mønster: 7,53; /1VAB=26,83 Hz).

‘Analyse, beregnet for C^qH^CINO^S: C = 45,89%, H = 4,62%, Ν = 5,35% fundet: C = 46,63%, H = 4,90%, N = 5,19%.

35

O

DK 161028 B

17

Metode B

En blanding af 3,1 g (13 mmol) N-tosyl-L-alanin og 6 ml thionylchlorid opvarmes i 90 minutter ved 50°C og fortyndes derpå med 50 ml tør hexan. Blandingen omrøres 5 hurtigt, afkøles kraftigt, og det faste stof skilles fra ved filtrering. Udbytte 3,15 g (93%) med smp. 99-100°C. IR-spektret er identisk med spektret for det omkrystalliserede materiale, der fremstilles ved metode A.

10 2-Hydroxy-3-(carboxymethylamino)-hydrokanelsyre-dikalium- salt-dihydrat (1)

En omrørt opslæmning af 1,0 kg trans-kanelsyre (6,75 mol) i 4,5 liter acetone behandles først med 2,47 kg (29,4 mol eller 4,36 ækvivalenter) NaHCO^, hvorpå der om-15 hyggeligt behandles med 4,5 liter vand. Den resulterende, tykke blanding behandles dråbevis i løbet af 1,5 til 2,0 timer med en opløsning af 3,78 kg 0Χ0ΝΕ ®-monosulfatforbindelse (indeholder 1,825 ækvivalenter KHS05) i 0,4 mM vandig dinatriumethylendiamintetraeddikesyre (EDTA, 14,5 20 liter, fremstillet ved opløsning af 2,17 g dinatrium-EDTA--dihydrat i 14,5 liter destilleret vand). Under denne tilsætning opretholdes reaktionstemperaturen ved 24-27°C under anvendelse af et vandbad. Reaktionsblandingens pH-vær-di noteres til ca. 7,4. Efter at tilsætningen er fuldstæn-25 dig, omrøres blandingen i yderligere 1/2 time, hvorpå den afkøles til ca. 10°C. Reaktionsblandingen syrnes med ca.

1,2 liter koncentreret saltsyre til pH-værdi på 2, idet temperaturen holdes på omkring 10°C, hvorefter der behandles med 5,05 liter CE^C^ og omrøres kraftigt i 10 minut-30 ter.

Efter at blandingen har fået lov at afsætte sig, af dekanteres det vandige lag, og det organiske lag, der indeholder uopløselige salte, filtreres gennem papir under anvendelse af sugning. De filtrerede faste stoffer vaskes 35 med 1,9 liter CH2CI2, og det vandige lag ekstraheres med

DK 161028B

O

18 dette filtrat. De filtrerede faste stoffer vaskes igen med 3f15 liter C^C^r og det vandige lag ekstraheres med dette filtrat. De kombinerede CHgC^-lag ekstraheres med en opløsning af 593,3 g KOH i 6,31 liter vand, idet forsig-5 tig opvarmning til ca. 40°C ofte kræves til opløsning af et fast stof, der kan udskilles under baseekstraktionen. CH2Cl2-laget ekstraheres derpå med en opløsning af 99 g KOH i 1,5 liter vand, og de kombinerede baseekstrakter behandles med 481,7 g glycin (6,416 mol eller 0,95 ækvivalen- 10. ter), og det organiske lag bortkastes.

Opløsningens pH-værdi indstilles på 11,5 med 25%'s vandig KOH, hvorpå der opvarmes til kogning. Ca. 900 ml lavtkogende væske (acetone og vand) afdestilleres, indtil damptemperaturen når 99°C, hvorefter blandingen tilbage-15 svales i 2 timer. Efter afkøling ekstraheres reaktionsblandingen med 3,15 liter C^C^, OB^C^-fasen bortkastes, og den vandige fase inddampes til tørhed under formindsket tryk med et bad med en temperatur på 70°C. Remanensen koges i 8,83 liter 95%1 s ethanol i 30 minutter, 20 hvorpå den får lov at afkøle langsomt under omrøring, hvorved produktet udskilles i form af fine krystaller. Disse skilles fra ved filtrering, vaskes med 1,26 liter frisk 95%'s ethanol og tørres i en ovn med en temperatur 50-60°C, hvorved det fås 1,77 kg eller 74,6% af den i overskriften 25 angivne forbindelse som hvide krystaller med smp. 120-122°C (ukorrigeret).

IR (KBr) cm"1: 3420 (br), 1590 (br), 1410, 1130, 710; XH NMR (DjO-TSP) £3,1 (s, 2H), 3,89 (d, JAB =4, IH) og 4,52 (d, JAB =4, IH) (center af mønster: 4,21; Δ = 30 18,83 Hz), 4,68 (s, 6H, udskiftelige protoner), 7,4 (s, 5H); TLC R^ = 0,59 (EtOH: 1M triethylammoniumbicarbonat, 7:3) .

Analyse, beregnet for : C = 37,59%, H = 4,30%, N = 3,99% 35 fundet: C = 37,22%, H = 4,24%, N = 3,96%.

O

19

DK 1610 2 8 B

N-Acetyl-3-acetoxy-5-phenylpyrrol (2)

En suspension af lfO kg (2,84 mol) 2-hydroxy-3--(carboxymethylamino)-hydrokanelsyre-dikaliumsalt-dihy-drat (1) i 3,0 liter pyridin behandles med 4,0 liter ed-5 dikesyreanhydrid ved omgivelsernes temperatur under en indifferent gasatmosfære. Der foregår en mild eksoterm reaktion, og reaktionstemperaturen stiger eksponentielt til 60-70°C i løbet af 1,5-2,5 timer. Når reaktionsblandingen begynder at køle af, opvarmes blandingen til 120-10 -123°C i 15 minutter, hvorefter den får lov at afkøle til omgivelsernes temperatur i løbet af 1 time, i hvilket tidsrum pyridiniumacetat udskilles i form af krystaller. Blandingen filtreres gennem papir under anvendelse af sugning, og saltene vaskes med EtOAc, indtil de er farve-15 løse. Filtratet inddampes til tørhed i vakuum.

Den mørkerøde remanens opløses i 3,0 liter EtOAc, vaskes tre gange med 1,0 liter vand pr. gang, tørres over magnesiumsulfat og behandles 300 g Darco ®-G60 (Aldrich Chemical Co.). Efter omrøring i 30 minutter filtreres blan-20 dingen gennem Celite ®(Fisher Scientific) og inddampes til tørhed i vakuum, hvorved der fås en rødlig-orange olie.

Denne olie opløse i 1,2 liter varm 2-propanol og får dernæst lov at afkøle langsomt til omgivelsernes temperatur natten over, hvorefter der udskilles et fast stof. Det 25 krystallinske produkt skilles fra ved filtrering, vaskes med 50%'s vandig 2-propanol og tørres i vakuum, hvorved der fås den i overskriften angivne forbindelse i en mængde på 417 g (60%) med smp. 58-60°C (ukorrigeret). En portion optages i Et20, behandles med Norit 211, filtreres 30 og koncentreres under formindsket tryk. Ved henstand ved 0°C udskilles der farveløse smånåle. Disse skilles fra ved filtrering, vaskes med en blanding af Et20/hexan i forholdet 1:1 og vakuumtørres, hvorved der fås en analytisk prøve med smp. 60-62,5°C (ukorrigeret).

35 IR (CHCI3) cm"1: 3020, 1760, 1730, 1595, 1378,

DK 161028B

O

20 1320, 1220 (br), 1030, 960, 903; ΧΗ MR (CDC13) S 2,23 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 6,18 (d, J=2, IH), 7,35 (s, 5H), 7,42 (d, J=2, IH); TLC = 0,56 (toluen:dioxan, 4:1).

Analyse, beregnet for C14H13N03: 5 C = 69,12%, H = 5,38%, N = 5,76% fundet: C = 68,88%, H = 5,25%, N = 5,53%.

3-Hydroxy-5-phenylpyrrol (3)

En findelt portion på 36,8 g (0,15 mol) N-acetyl-10 -3-acetoxy-5-phenylpyrrol (2) befries for oxygen ved omrø ring i en løbende argonstrøm i 10 minutter og suspenderes derpå i deoxygeneret MeOH (379 ml), afkøles til -6°C i et bad af en blanding af methanol (MeOH) og tøris med en temperatur på -15°C under en indifferent gasatmosfære og be-15 handles hurtigt med en iskold, deoxygeneret opløsning af 300 ml 2 N NaOH. Reaktionstemperaturen stiger øjeblikkeligt ved tilsætning af base til 18°C, og efter ca. 3 minutters forløb bliver reaktionsblandingen homogen. Efterhånden som reaktionsblandingen afkøles, udskilles forbin-20 delsen (3) i form af fine krystaller. Efter 15 minutter tilsættes der en opløsning af 150 ml kold, deoxygeneret 2 M citronsyre, den resulterende blanding omrøres i 10 minutter, og blandingen filtreres dernæst. Det faste stof vaskes grundigt med 200 ml deoxygeneret vand, idet der dra-' 25 ges omsorg for at udsætte produktet mindst muligt for luften, hvorpå der tørres natten over under vakuum, hvorved der fås 22,3 g (93,6%) af den i overskriften angivne forbindelse i form af lyse, lyserøde smånåle.

IR (KBr) cm"1: 3400, 3110, 2900, 1600, 1580, 1555, 30 1480, 1268, 1180, 742, 640; XH NMR (DMS0-D6) & 6,1 (m, IH), 6,3 (ra, IH), 7,0-7,7 (m, 5H), 8,0 (s, IH), 10,4 (br s, IH); TIC Rf = 0,20-0,28 (EtOH:CHCl3, 1:9).

Analyse, beregnet for C]_QHgN0: C = 75,45%, H = 5,70%, N = 8,80% 35 fundet: C = 75,30%, H = 5,69%, N = 8,67%.

O

21

DK 161028 B

3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-phenylpyrrol (4)

En opløsning af 450 ml vandfri tetrahydrofuran (THF), 43,8 ml pyridin (0,542 mol eller 1,2 ækvivalenter) og 85,0 ml trifluoreddikesyre (1,10 mol eller 2,4 ækviva-5 lenter), holdes ved 0°C under en indifferent gasatmosfære og behandles i én portion med 71,5 g (0,45 mol eller 1,0 ækvivalenter) 3-hydroxy-5-phenylpyrrol (3), øjeblikkeligt efterfulgt af dråbevis tilsætning i løbet 5-10 minutter af en opløsning af 141,0 g (0,54 mol eller 1,2 ækvivalenter) 10 frisk fremstillet N-tosyl-L-alaninylchlorid i 450 ml vandfri THF. Den fremkomne blanding omrøres i 15 minutter ved 0°C. Reaktionen undertrykkes derpå ved tilsætning af en opløsning af 315 ml 1,0 M vandig citronsyre og 1,35 liter EtOAc. Efter kortvarig sammenblanding adskilles faserne, 15 og det organiske lag vaskes med en opløsning af vandig NaCl (360 ml med 0,18 g NaCl pr. ml vand). Det organiske lag ekstraheres derpå to gange med en opløsning af 5%'s NaHCOg (1,35 liter pr. gang), hvorefter der vaskes med en yderligere portion vandig NaCl (360 ml med 0,18 g NaCl 20 pr. ml vand).Det rødligt-brune organiske lag omrøres ved omgivelsernes temperatur i 15 minutter med 101 g MgS04 og 143 g Darco-G60, hvorefter der filtreres gennem Celite og inddampes til tørhed i vakuum fra et bad med en temperatur på 37°C, hvorved der fås forbindelsen (4) i form af et ly-25 serødt-hvidligt, fast stof. Det rå produkt formales til et pulver og opløses i 250 ml THF med en temperatur på 50°C, omrøres kraftigt og fortyndes med 250 ml n-hexan. Omrøringen fortsættes i 1 time ved omgivelsernes temperatur, hvorved produktet krystalliserer. Det faste stof skilles fra 30 ved filtrering, vaskes med ca. 1,0 liter toluen, indtil filtratet er farveløst, og tørres dernæst i vakuum natten over, hvorved der fås 112 g (65%) af den i overskriften angivne forbindelse i form af et hvidt pulver med smp. 154,5-155°C.

IR (KC1) cm-1: 3350, 3325, 1760, 1508, 1320, 1155, 35 770; •'ή NMR (DMSO-d6) 01,33 (d, J=7, 3H) , 2,36 (s, 3H) , 4,13

O

22

DK 161028 B

(Pf J-8, IH), 6,25 (m, IH) , 6,73 (m, IH), 7,05-7,50 (m, 5H),

7,5-7,85 (m, 4H), 8,42 (d, J=8, IH), 11,18 (br s, IH); 13C

g NMR (DMSO-d ) ppm 18,335, 21,001, 51,370, 98,061, 108,336, 123,423, 126,024, 126,610, 128,560, 128,756, 129,601, 5 132,397, 137,600, 138,380, 142,737 og 119,919; [a] = -70° (c=l,ll, MeOH); TLC = 0,45 (EtOAc: hexan, 1:1); TLC = 0,40 (toluenrdioxan, 4:1).

Analyse, beregnet for C2oH20N2°4S: C = 62,48%, H = 5,24%, N = 7,29% 10 fundet: C = 62,62%, H = 5,27%, N = 7,30%.

Syntese af 3-(N-tosylalaninyloxy)-5-phenylthiophen (9)

Der udføres en række forsøg til fremstilling af 3--hydroxy-5-phenylthiophen ved mindre modifikationer af de 15 i litteraturen rapporterede metoder, der er angivet på en følgende side. Den resulterende hydroxythiophen acyleres dernæst med en N-tosyl-L-alaninylchlorid, hvorved der fås den tilsvarende N-tosyl-L-alaninatester i 46%'s udbytte (ikke-optimeret metode).

20 25 30 35

O

23

DK 161028 B

COOC2lI5 _^ o . Or ir* O^1

a. Na2S

b. BrCH2COOII

pH=8,7 10 v S? _^O-C-CH. ,-<£° _ ^r~f acjo /Οϋί 011 s ^ <-2- i/Yf ^ ^^cooh fjn O) ( 3 NaOAc l^J tf)

NaOH

H2°

Me OH

0

20 N

20 I C1-C-CH-CH3 J

N . 0-C-CH-CH, fjz i2L_QpA: Ο tS) CH2C12

Pyridin (5) 3-Phenyl-l,2-dithia-3-cyclopenten-5-on (5)

En suspension af 10 g ethylcinnamat (56,82 mmol) 30 og 10 g svovl opvarmes ved 250°C i 4 timer i en 50 ml kolbe udstyret med et destillationshoved og et forlag til fjernelse af ethanol, der dannes under reaktionen. Reaktionsblandingen får dernæst lov at afkøle til 100°C og sættes til 500 ml tilbagesvalende ethanol. Den fremkomne fæld-35 ning skilles fra ved filtrering og tritureres i rækkefølge

DK 161028 S

O

24 med 500 ml kogende acetone og to gange med 500 ml portioner af ethanol. De kombinerede ovenstående væsker koncentreres til et sort, fast stof, der krystalliseres fra ethanol, hvorved der fås mørkebrune nåle. En yderligere krystal-5 lisation fra methanol under anvendelse af Norit og filtrering gennem Celite giver 2,023 g lysegule nåle med små. 113-115°C.

IR (KBr) cm"1: 1650, 1550, 1390, 1350, 1130, 770j XH NMR (60m Hz, CDCI3) S 6,92 (s, IH), 7,58 (m, 5H); TLC 10 R^ = 0,5 (dichlormethan).

Analyse, beregnet for CgHg02S: C = 55,64%, H = 3,11% fundet: C = 55,53%, H = 3,47%.

15 cis-4-Keto-6-phenyl-3,7-dithia-5-nonendicarboxylsyre (6)

En smeltet opløsning af 35,48 g natriumsulfid--nonahydrat (148 mmol) behandles ved 94°C med 6,56 g 3--phenyl-l,2-dithia-3-cyclopenten-3-on (5) (34,23 mmol), der tilsættes portionsvis i løbet af 5 minutter. Efter 15 20 minutter sættes blandingen til en iskold opløsning indeholdende 43,6 g (314 mmol) bromeddikesyre i 60 ml vand, indstillet på en pH-værdi på 8,7 med natriumcarbonat. Den resulterende opløsning holdes ved 0°C og en pH-værdi på 8,7 i 45 minutter og filtreres derefter. Den ovenstående 25 væske holdes ved 0°C og syrnes til en pH-værdi på 3,7 med en 5 N saltsyre. Den fremkomne blanding omrøres natten over ved 5°C. Den ovenstående væske dekanteres dernæst, og den resulterende olie tritureres med ether. Olien inddampes med toluen, indtil der fås 6,98 g (65%) af et far-30 veløst skum. Dette materiale anvendes uden yderligere rensning.

Der fås en analytisk prøve fra den ovenstående ethervæske, som ved koncentration, successiv inddampning med eddikesyre og toluen og triturering med ether giver 35 gulbrune krystaller med smp. 142,5-150°C.

O

25

DK 161028 B

IR (KBr) cm"1: 1705, 1655: 1H NMR (60 MHz, DMSO--Dg) S 2,06 (s, CH2CO2H urenhed), 3,30 (s, 2H), 3,77 (s, 2H), 5,67 (m, 2H) (OH) 6,37 (s, IH), 7,43 (m, 5H); TLC Rf = 0,85 (chloroform:methanol:eddikesyre, 5:5:1).

5 Analyse, beregnet for ^-^3^^2^2^51 C = 50,00%, H = 3,88% fundet: C = 50,26%, H = 3,98%.

3-Hydroxy-5-phenylthiophen-acetat (7) 10 En kraftigt omrørt suspension af 3,40 g (10,9 mmol) rå cis-4-keto-6-phenyl-3,7-dithia-5-nonendicarb-oxylsyre (6), 3,40 g (41,5 mmol) natriumacetat og 30 ml eddikesyreanhydrid opvarmes til tilbagesvaling i 1 time. Blandingen får lov at afkøle og filtreres derpå og ind-15 dampes, hvorved der fås en sort olie. Denne remanens opløses i 75 ml ethylacetat og ekstraheres tre gange med 50 ml-portioner af iskold mættet natriumbicarbonatopløs-ning. Det organiske lag vaskes dernæst med brine, tørres over natriumsulfat, filtreres og inddampes, hvorved 20 der fås 2,826 g af et sort, fast stof. Det rå produkt renses ved fordampningsdestillation ved 120-140°C og et tryk på 0,1 mm Hg, hvorved der fås 1,235 g (52%) af en lysorange olie, der størkner ved henstand.

IR cm"1: 1700, 1745; 1H NMR (60 MHz, CDC13) 25 å 2,23 (s, 3H) , 7,03 (d, J=2HZ, IH) , ,.7,13 (d, J=2Hz, IH); 7,23-7,73 (m, 5H); MS (El, DIP) m/e 218 (M+, 12,6%); TLC Rj = 0,48 (hexen:ethylacetat, 5:1).

Analyse, beregnet for c^2Hio^°2H20: C = 63,41%, H = 4,88% 30 fundet: C = 63,78%, H = 4,86%.

3-Hydroxy-5-phenylthiophen (8)

En blanding af 2,126 g 3-hydroxy-5-phenylthio-phenacetat (7) (9,74 mmol) og 80 ml methanol under en ar- 35 gonatmosfære behandles med 11 ml 1 N natriumhydroxidopløs- 0

DK 161028B

26 ning. Efter 20 minutter undertrykkes reaktionen ved tilsætning af 11 ml 1 N saltsyre, og der inddampes ved 25°C og 12 mm Hg til et rumfang på ca. 50 ml, hvorpå der behandles med 100 ml ethylacetat. Det organiske lag skilles fra, va-5 skes med brine, tørres over natriumsulfat, filtreres og inddampes, hvorved der fås et sort, fast stof. Denne remanens opløses i 75 ml ethylacetat og tørres over MgSO^. Ved filtrering og inddampning fås der et sort, fast stof, som tritureres fire gange med varm hexan, hvorpå der ved afkø- 10 ling fås i alt 837 mg (49¾) af et gult, fast stof med smp. 74-75°C. De kombinerede moderludsvæsker koncentreres, hvorved der fås 0,87 g af et fast stof, der chromatograferes over 100 g Si02, elueret med en blanding af hexan og ethylacetat i forholdet 7:1. Efter omkrystallisation fås 15 der yderligere 380 mg produkt med smp. 73,5-74°C. Det samlede udbytte er således 1,217 g (71%). Smp. 74,5-75°C (litteraturangivelser lf^: 75°C,,78°C).

IR cm”1: 3380, 1635; XH NMR (90 MHz, CDC13)· 6 3.,81 (s, 2H), 6,57 (s, IH), 7,2-7,7 (m, 5H); MS (El) m/e 176,0 20 (70,7%); TLC = 0,23 (hexan;ethylacetat, 1:5).

Analyse, beregnet for C^0HgOS; C = 68,15%, H = 4,57% fundet; C = 68,05%, H = 4,70%, 25 3-(N-Tosyl-L-alaninyloxy)-5-phenylthiophen (9)

En opløsning indeholdende 440 mg (2,5 mmol) 3-hy-droxy-5-phenylthiophen (8) i 20 ml dichlormethan og 0,61 ml (7,5 mmol) pyridin ved 0°C under' en argonatmosfære behandles med en opløsning indeholdende 1,314 g (5 mmol) N-tosyl-30 -L-alaninylchlorid i 10 ml dichlormethan, der tilsættes dråbevis over en periode på 5 minutter. Reaktionsblandingen omrøres i 1/2 time ved 0°C og udhældes derpå i 100 ml chloroform. Blandingen ekstraheres dernæst i rækkefølge med portioner på 50 ml 1 N citronsyre, vand, iskold natriumbi-35 carbonatopløsning, vand og brine. Blandingen tørres derpå 27

DK 161028 B

O

over natriumsulfat, filtreres og inddampes, hvorved der fås 1,78 g af en brun olie. Forsøg på krystallisation fra toluen efter behandling med 1,78 g Norit mislykkes. Remanensen chromatograferes derefter på en 200 g-søjle af Si02 og elue-5 res med dichlormethan med en strømningshastighed på 10 ml pr. minut. Fraktioner, der indeholder produktet, slås sammen og koncentreres, hvorved der fås 951 mg af en rødlig olie. Produktet krystalliseres fra toluen. Successive omkrystallisationer for toluen giver i alt 463 mg produkt i 10 form af et lysegult, fast stof med smp. 85-87°C. Udbytte 46%.

IR (KCl) cm"1: 1735, 1330, 1150; ΧΗ NMR (90 MHz, CDC13) 81/53 (d, J=7Hz, 3H) , 1,62 (s, 3H) , 4,23 (m, IH), 5,32 (d, J=9Hz, IH), 6,84 (d, J=l,4Hz, IH), 6,88 (d, J=14 15 J=l,4Hz, IH), 7,23-7,83 (m, 9H); MS (FAB) m/e 402 (M+ 1, 15%) 15%); TLC Rf = 0,20 (hexan:ethylacetat 4:1).

Analyse: beregnet for C2qH^qNO^S: C = 59,83%, H = 4,77%, N = 3,59% fundet: C = 59,60%, H = 4,77%, N = 3,43%.

2o Litteratursted 1: P. Friedlander og S. Kielbasinski, Chem.

Ber. 46, 3389 (1912).

Litteratursted 2: A.I. Kosak, R.J.F. Palchak, W.A. Steele og C.M. Selwitz, J. Amer. Chem. Soc., 76, 4450 (1954).

25

Syntese af 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-1-methy1-5-phenyl-pyrrol (13)

Der udføres en række forsøg til fremstilling af den nævnte ester svarende til forbindelse (I), hvor A be-30 tegner N-tosyl-L-alaninyl, R betyder phenyl, Rx betyder . hydrogen, X betyder NR’, og R' betegner CH^. Reaktions-rækkefølgen er som følger: 35

DK 161028 B

28

O

COOK

°\j rC00K (1°)

NH(CH^)CH2COOH f^^y^N^COOK KOH/H.O I

2 CHS

10 Ac2°

Et3N

” ^χΊΓ° Vs

O -II

20 . CFjCOOH C1-C-CH-CH3

Pyridin. / \ THF H Ts

- O

II

__^o-c-ch-ch., • or? Λ - ch3 30 35

O

29

DK 161028 B

2- Hydroxy-3-(N-methylcarboxymethylamino)-hydrokanelsyre--dikaliumsalt (10)

En blanding af 30 g (0,15 mol) β-phenylglycidin-syre-kaliumsalt, 13,2 g (0,15 mol) N-methylglycin, 119 ml 5 destilleret vand og 22,3 ml 9 N KOH-opløsning opvarmes til tilbagesvaling i 3 timer, hvorved der fås en lysegul opløsning. Reaktionsblandingen inddampes til tørhed under formindsket tryk ved 70°C. Remanensen krystalliseres derpå fra 100 ml 95%'s ethanol, hvorved der fås et hvidt, 10 fast stof, som efter tørring natten over ved formindsket tryk ved 110°C giver 30,8 g (udbytte 63%) af et hvidt, fast stof (10).

IR (KC1) cm"1: 3360 (br), 1580, 1405, 705; XH NMR (CD30D)&2,30 (S/ 3h) , 2,98 (s, 2H) , 3,70 (d, J=3Hz, 15 IH), 4,48 (d, J=3Hz, IH), 4,92 (s, IH), 7,40 (s, 5H); TLC = 0,51 (EtOH: 1 M triethylammoniumbicarbonat, 7:3). Produktet har ikke noget smeltepunkt lavere end 270°C.

3- Acetoxy-l-methyl-5-phenylpyrrol (11) 20 En blanding af 15,2 g (46 mmol) 2-hydroxy-3-(N- -methylcarboxymethylamino)-hydrokanelsyre-dikaliumsalt (10), 173 ml eddikesyreanhydrid og 308 ml triethylamin opvarmes til 90°C i 19 timer. Reaktionsblandingen, der bliver dybbrun i farve, filtreres, og det faste stof va-25 skes med ether. Filtratet inddampes under formindsket tryk, hvorved der fås en dybbrun remanens, der optages i 300 ml ether og 200 ml vand. Lagene adskilles, og etherlaget vaskes med en anden portion vand på 200 ml.

Etheropiøsningen tørres derpå over MgSO^, filtreres og 30 koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 10,7 g brun remanens, som renses ved fordampningsdestillation ved 120-135°C og 0,03 mm Hg og krystallisation fra ether, hvorved der fås 3,0 g hvide krystaller af forbindelsen (11) (udbytte 30%), smp. 64-65°C.

35 IR (CHC13) cm"1: 2990, 1750, 1570, 1518, 1482,

DK 161028B

30 0 1 1375, 1230 (br) , 1024, 910, 700; H MR (CDC13) $>2,20 (s, 3H), 3,58 (s, 3H), 6,10 (d, J=2Hz, IH), 6,75 (d, J=2Hz, IH), 7/35 (s, 5H); TLC = 0,58 (hexan:EtOAc, 7:3).

Analyse, beregnet for ci3Hi3N02: 5 C = 72,54%, H = 6,10%, N = 6,44% fundet: C = 72,57%, H = 6,09%, N = 6,51%.

3-(N-Tosyl-L-alaninyloxy)-l-methyl-5-phenylpyrrol (13)

Til en blanding af 15,5 ral deoxygeneret methanol 10 og 1,3 g (6,2 mmol) 3-acetoxy-l-methyl-5-phenylpyrrol (11) under argon sættes der 12,5 ml 2 N deoxygeneret NaOH. Reaktionsblandingen omrøres i et isbad i 15 minutter. Der tilsættes dernæst 7 ml 2 M deoxygeneret citronsyre, og den resulterende blanding omrøres i et isbad i 8 minutter. Re-15 aktionsblandingen koncentreres under formindsket tryk, hvorefter der tilsættes 20 ml vand, og der ekstraheres to gange med 50 ml ethylacetat (EtOAc). EtOAc-lagene kombineres, tørres over MgSO^, filtreres og koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 3-hydroxy-l-methyl-5-phe-20 nylpyrrol.(12) i form af en orange remanens. Under argonatmosfære sættes der en kold opløsning af 12,4 ml vandfri THF, 0,6 ml (7,4 mmol eller 1,2 ækvivalenter) pyridin og 1,2 ml (15 mmol eller 2,4 ækvivalenter) trifluoreddikesy-re til den orange remanens, øjeblikkeligt efterfulgt af 25 tilsætning af en opløsning af 1,2 g (7,4 mmol eller 1,2 ækvivalenter) frisk fremstillet N-tosyl-L-alaninylchlo-rid i 12,4 ml vandfri THF. Den fremkomne blanding omrøres i 1 time ved 0°C. Reaktionen undertrykkes dernæst ved tilsætning af 5 ml 1 M vandig citronsyre og 30 ml EtOAc. Efter en 30 kortvarig sammenblanding adskilles lagene, og det organiske lag vaskes i rækkefølge med mættet natriumchloridop-løsning, to gange med 5%'s NaHCO^-opløsning og igen med . mættet natriumchloridopløsning. EtOAc-ekstrakten tørres derpå over MgSO^, behandles med Norit 211, filtreres og 35 koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås det 31

DK 161028 B

O

rå produkt (13) i form af en orange remanens. Denne opløses i 5 ml af en blanding af hexan og EtOAc i forholdet 1:1 og chromatograferes på en kolonne (100 g SiOj) ved eluering med en blanding af hexan og EtOAc i forholdet 7:3, 5 hvorved der fås 1 g af forbindelsen (13) i form af en tyk, lys orange olie. En portion af dette råprodukt renses yderligere ved semipræparativ HPLC (søjle IBM silica, 1 cm x 1 cm, mobil fase, hexan: EtOAc 8:2, strømningshastighed 2 4,0 ml/min. og tryk ca. 0,014 kg/cm ), hvorved der fås en 10 honningfarvet, tyk olie (13).

IR (film) cm"1: 3260, 2950, 1760, 1520, 1350, 1170, 770; 1H NMR (DMS0-dg) é 1,28 (d, j=7 Hz, 3H), 2,36 (s, 3H), 3,58 (s, 3H), 5,85 (d, J=2 Hz, IH), 6,15 (m, IH), 6,74 (d, J[2 Hz, IH), 7,30-7,80 (m, 9H), 8,37 (d, J=8 Hz, 15 IH); 13C NMR (DMS0-dg) S 18,205, 20,936, 34,917, 51,240, 100,598, 113,148, 126,544, 127,000, 128,105, 128,560, 129,601, 130,901, 132,202, 135,714, 138,315, 142,672, 169,724; TLC Rf = 0,52 (toluen:dioxan, 4:1); højopløsnings--massespektrum, C2iH22N2°4S dræver m/e 398,1300, fundet m/e 20 398,1297.

Syntese af 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-(p-chlorphenyl)pyrrol (18)

Der udføres en række forsøg til- fremstilling af 25 den nævnte esterforbindelse svarende til forbindelsen (I), i hvilken A er N-tosyl-L-alaninyl, R er p-chlorphenyl, R er Η, X er NR' og R' er H. Reaktionsrækkefølgen er som følger: 30 35

O

32

DK 161028 B

^ COOH ^COOII

ap n „jør ™ 5 C1 . 22-27®

10 V

_-OAc ΗΟγαχήί* ,/V^ - Ac2° ifV'f'COO'K* . 2H20

K )J I ^ Pyridin KJ) I

_ Ac 121-1220 Civ H

15 Cl (16) (15)

NaOH

CH30H

H,0 20 ψ 2

O

π M

, „o1? :2:.0^ Λ·'

25 CF..COOH

^ Pyridin

Trans-β-(p-chlorphenyl)-glycidinsyre (14) 30 Til en omrørt opløsning af 68,5 g (0,375 mol) p- -chlorkanelsyre i 260 ml acetone sættes der 137 g (1,63 mol) NaHC03, efterfulgt af langsom, tilsætning af 260 ml vand. Til denne blanding sættes der i løbet af 2 1/2 time ved 22-27°C en blanding af 211 g (0,343 mol) OXONE ®, 35 120 mg dinatrium-EDTA og 805 ml vand. Efter 5 timers for- 33

O

DK 161Q28B

løb gøres blandingen sur med 70 ml kold 12 N saltsyre, hvorved pH-værdien bringes ned på ca. 2,5, og blandingen ekstraheres dernæst med 700 ml ethylacetat. Ekstrakten vaskes med brine, tørres med MgSO^, filtreres, og filtra-5 tet inddampes til tørhed under vakuum. De hvide, faste stoffer krystalliseres fra ethylacetat. Smp. 121-125°C (72,2 g svarende til et udbytte på 97%). ^H NMR (CDCl^/-DMS0-D6) $7,3 (m, 4H) , 4,05 (d, J=2, IH), og 3,4 (d, J=2, IH) .

10 Analyse, beregnet for C^H^CIO^: C = 54,43%, H = 3,55%, Cl = 17,85% fundet: C = 54,53%, H = 3,80%, Cl = 17,91%.

2-Hydroxy-3-(carboxymethylamino)-p-chlorhydrokanelsyre-15 -dikaliumsalt-dihydrat (15)

Til en opløsning af 46,7 g (0,709 mol) 85%'s KOH og 400 ml vand sættes der 25,9 g (0,345 mol) glycin, efterfulgt af 72,2 g (0,3635 mol) trans-p-p-chlorphenylgly-cidinsyre (14). Denne blanding opvarmes til 100°C i 2 ti-20 mer, afkøles til stuetemperatur, og der tilsættes en tilstrækkelig mængde KOH til forøgelse af pH-værdien til 12.

Den uklare opløsning ekstraheres tre gange med ethylacetat, og ekstrakten bortkastes derefter. Den klare vandige opløsning (ca. 500 ml) inddampes under vakuum til tørhed, 25 idet der anvendes et vandbad med en temperatur på 70°C.

De faste stoffer opløses dernæst i ca. 300 ml varm ethanol og filtreres, og filtratet afkøles kraftigt i et isbad i flere timer. De krystalliserede faste stoffer opsamles ved filtrering og vaskes med noget kold ethanol. Smp.

30 93-95°C med decarboxylering ved 185°C (udbytte 57,2 g el ler 41%) .

XH NMR (D20-TSP) 6 7,4 (s, 4H) , 4,7 (s, 6H, udskiftelige protoner), 4,4 (d, J=4, IH), 4,05 (d, J=4, IH) og 3,1 (s, 2H).

35 34

DK 161028 B

O

Analyse, beregnet for C-j^H^qCINO^I^*21^0: C = 34/24%, H = 3,66%, N = 3,63% fundet: C = 34,40%, H = 4,03%, N = 3,42%.

5 N-Acetyl-3-acetoxy-5-(p-chlorphenyl)pyrrol (16)

Til 10 g (0,02591 mol) 2-hydroxy-3-(carboxyme-thylamino)-p-chlorhydrokanelsyre-dikaliumsalt-dihydrat (15) sættes der 40 ml eddikesyreanhydrid og 30 ml pyri-din. Denne blanding opvarmes forsigtigt til 35°C, ved 10 hvilken temperatur opløsningen reagerer exotermt op til 67°C, hvorpå temperaturen begynder at falde, hvorefter opvarmningen genoptages. Blandingen opvarmes til 121--122°C (indre temperatur) i 1 time og afkøles derefter.

Til reaktionsblandingen sættes der ca. 30 ml ethylace-15 tat, hvorved det meste af pyridiniumacetatsaltet udfældes . Dette salt opsamles ved filtrering og vaskes med en lille mængde ethylacetat. Filtratet inddampes dernæst under vakuum til en olie, og der tilsættes isvand. Produktet ekstraheres med ether, og etherekstrakterne 20 vaskes i rækkefølge med kold fortyndet vandig citronsyre, koldt vand, tre gange med kold fortyndet vandig .NaHCO^-opløsning, koldt vand og brine, efterfulgt af tørring over MgSO^ og filtrering. Filtratet behandles med 10 g Darco, omrøres i 20 minutter og filtreres der-25 efter. Filtratet inddampes til en olie under vakuum.

Til olien sættes der 25 ml 2-propanol, og den fremkomne opløsning giver under kraftig afkøling og skrabning bleggule krystaller med smp. 69“71°C i et udbytte på 3.4 g eller 47%. TLC = 0,61 (toluen:dioxan, 95:5).

30 En analytisk prøve omkrystalliseres fra 2-propanol, men der.iagttages ingen ændring i smeltepunktet.

IR (KC1) cm"1: 1755 (C=0, ester) og 1730 (C=0, amid); 1H NMR (CDCI3) $ 7,4 (m, 5H) , 6,2 (d, J=2, 3iH) , 2.4 (s, 3H) og 2,3 (s, 3H).

35

O

35

DK 161028 B

Analyse, beregnet for C^H^dNC^: C = 60,55%, H = 4,36%, N = 5,04% fundet: C = 60,65%, H = 4,55%, N = 5,07%.

5 3-Hydroxy-5-(p-chlorphenyl)-pyrrol (17)

En prøve af 2,8 g (0,01 mol) N-acetyl-3-acetoxy--5-p-chlorphenyl-pyrrol (16) deoxygeneres i 10 minutter ved hjælp af en strøm af nitrogen. De faste stoffer opløses dernæst i 30 ml deoxygeneret methanol, som dernæst 10 afkøles kraftigt til -8°C. Der tilsættes øjeblikkeligt en kold deoxygeneret opløsning af NaOH (1,6 g eller 0,04 mol) i 20 ml vand, og denne opløsning opvarmes derpå kortvarigt til 15°C og afkøles dernæst øjeblikkeligt til -5°C. Efter 25 minutters forløb behandles den klare opløsning med en 15 kold deoxygeneret opløsning af citronsyre (4,2 g eller 0,02 mol) i 15 ml vand, og temperaturen stiger kortvarigt til 5°C. Efter 1/2 times omrøring ved -5°C opsamles de faste stoffer ved filtrering og vaskes med koldt, deoxygeneret vand. Det bleggrønne produkt tørres under vakuum ved 20 stuetemperatur over ?2°5 ^ f^ere dage, og der fås 1,3 g eller 68%. TLC Rf = 0,19 (CHCl3:EtOH, 9:1)·, IR (KC1) viser ingen tegn på C=0-absorption.

Analyse, beregnet for C10HgClN0*l/6 H20: C = 61,08%, H = 4,27%, N = 7,12% 25 fundet: C = 61,36%, H = 4,44%, N = 6,85%.

3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-(p-chlorphenyl)-pyrrol (18)

Til 15 ml THF, der er deoxygeneret med nitrogen, sættes der 0,65 ml (0,008 mol) pyridin, 1,27 ml (0,0164 30 mol) trifluoreddikesyre og 1,3 g (0,0065 mol) 3-hydroxy--5-p-chlorphenylpyrrol (17) . Opløsningen afkøles kraftigt til 0°C til -4°C, og en med nitrogen deoxygeneret og kraftigt afkølet (0°C til -4°C) opløsning af 2,1 g (0,008 mol) N-tosyl-L-alaninylchlorid i 15 ml THF tilsæt-35 tes i løbet af 10 minutter. Efter at blandingen har været 36

O

DK 161028B

holdt ved 0°C i 1 time, tilsættes der en blanding af is og 100 ml 1 N citronsyre. Denne blanding ekstraheres med ethylacetat, og ekstrakten vaskes én gang med kold brine, to gange med kold fortyndet NaHCO^-opløsning og én gang 5 med kold brine, hvorefter der tørres over MgSO^ og filtreres. Filtratet behandles med 2 g Darco og omrøres i 10 minutter og filtreres, og filtratet koncentreres under vakuum til en rødligbrun olie. En anden behandling med 1,3 g Darco giver en lyst rødlig olie. Olien opløses i en 10 blanding af toluen og cyclohexan i forholdet 4:1 og anbringes i køleskab natten over. Der fås lyst laksefarvede krystaller i et udbytte på 1,45 g eller 53% og med smp. 113-115°C. TLC Rf = 0,47 (Et20) ; IR (KC1) cm”1: 1740 (C=0, ester); 1H NMR (CDCl^) 6 8,4 (br s, IH), 7,8-7,2 (m, 8H) , 15 6,7 (m, IH), 6,2 (m, IH), 5,5 (d, J=9, IH), 4,2 (p, j=8, IH), 2,4 (s, 3H), 1,4 (d, 3H); MS (El, DIP) m/e 418 (M+, 2,3%) og 420 ( M+, 0,8%).

Analyse, beregnet for C^QH^gClI^O^S: C * 57,34%, H = 4,57%, N = 6,69% 20 fundet: C = 57,53%, H = 4,58%, N = 6,67%.

Fremstilling og anvendelse af forskellige testmaterialer Der udføres en række forsøg til fremstilling af testmaterialer ifølge opfindelsen, hvor estersubstraterne 25 som ovenfor beskrevet afprøves for deres evne til at undergå leukocyt-katalyseret hydrolyse og påfølgende kobling med zwitterion (I), dvs. respons over for leukocyter i urin. Hvert materiale omfatter et lille kvadrat af filtrerpapir, der indeholder analysereagenserne, idet papi-30 ret er anbragt ved den ene ende af en polystyrenfilmstrimmel. Filtrerpapiret imprægneres med puffer, esteren, en accelerator og et zwitterion-koblingsmiddel. Hvert af de afprøvede materialer viser sig at give en positiv test for leukocyter i urin.

35 37

DK 161028 B

O

Testmateriale/ hvor esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)--5-phenylpyrrol (4)

Der fremstilles et testmateriale, der er følsomt over for tilstedeværelsen af leukocyter i urin. Materialet 5 omfatter et lille kvadrat af filtrerpapir anbragt ved den ene ende af en aflang strimmel af polystyrenfilm. Papiret er imprægneret med forskellige bestanddele, derunder en chromogen ester, en accelerator og et diazoniumsalt. En ca. 30,5 cm bred strimmel af Eaton og Dickman nr. 205-fil-10 trerpapir neddyppes i en vandig opløsning indeholdende følgende bestanddele: 0,4 M borat-NaOH-puffer, pH = 9,0 2,0% (vægt pr. rumfang) polyvinylpyrrolidon K-30 Æ\ 0,2% (vægt pr. rumfang) Bioterg AS-40 15 0,25 M NaCl.

Papiret tørres derpå i 7 minutter i en Overly Air Foil-papirtørrer ved fra ca. 80°C til ca. 95°C ved et luftstrømstryk på ca. 2,5 cm H20. Dernæst neddyppes det tørrede papir i en acetoneopløsning indeholdende følgende bestand-20 dele: 1,5% (rumfang pr. rumfang) n-decanol 0,7 mM l-diazo-2-naphthol-4-sulfonat 1,1 mM 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-phenylpyrrol.

Efter denne imprægnering tørres papiret i 7 minut-25 ter i Overly-ovnen ved ca. 66°C ved 0,5 i H20. Der fås et grålig-hvidt testpapir.

Et stykke af det tørrede, imprægnerede papir udskæres til et kvadrat, der måler ca. 0,5 cm på hver side, og det monteres ved den ene ende af en aksialt orienteret 30 polystyrenstrimmel, der måler ca. 10 cm x ca. 0,5 cm. Montering af papiret på strimlen opnås under anvendelse af Double Stick-dobbeltsidet adhæsiv fra 3M Company.

35 38

DK 161028 B

O

Testmateriale, hvor esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)--l-methyl-5-phenylpyrrol (13) Ét testmateriale, der er følsomt over for tilstedeværelsen af leukocyter i urin, fremstilles, idet der an-5 vendes 1-methyl-3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-phenylpyrrol som esterindikatoren/ og idet koblingsmidlet er 1-diazo-naphthalen-4-sulfonat * Et stykke filtrerpapir (Eaton and Dikeman nr. 205) neddyppes i en vandig, første dyppeopløsning indeholdende følgende bestanddele; 10 0,4 M borsyre 2,0% (vægt pr. rumfang) polyvinylpyrrolidon (K-30) 0,2% (rumfang pr. rumfang) Bioterge AS-40 0,25 M NaCl.

Inden imprægneringen af filtrerpapiret titreres 15 opløsningen med NaOH til en pH-værdi på 9,0.

Den anden dyppeopløsning i acetone indeholder følgende bestanddele: 0,75 mM l-diazo-2-naphthol-4-sulfonat 1,3 mM l-methyl-3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-20 -phenylpyrrol 1,5% (rumfang pr. rumfang) dodecanol.

Efter imprægnering i den første vandige dyppeopløsning tørres papiret i ca. 5 minutter ved ca. 80°C, ned-dyppes i den anden dyppeopløsning og tørres i ca. 5 minut-25 ter ved ca. 70°C.

Det dobbelt-imprægnerede papir tørres derpå i en ovn med forceret luftgennemstrømning i 5 minutter ved 50°C.

Det tørrede papir udskæres i kvadrater, der måler ca. 0,5 cm på hver side, og monteres ved enden af en poly-30 styrenfilm, der måler ca. 0,5 cm x ca. 8,25 cm. Monteringen udføres under anvendelse af Double Stick, et dobbeltsidet adhæsiv fra 3 M Company. Testmaterialet opbevares i flasker med 100 i hver, sammen med silicagel og molekylsigter til opnåelse af tørring.

35

DK 161028B

39

O

Testmateriale, hvor esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)--5-(p-chlorphenyl)-pyrrol (18)

Der fremstilles testmaterialer som beskrevet i det foregående afsnit, men med den undtagelse, at acetoneopløs-5 ningen i stedet for phenylpyrrol indeholder 1,3 mM 3-(N-to-syl-L-alaninyloxy)-5-(p-chlorphenyl)-pyrrol.

Bedømmelse af testmaterialet

De testmaterialer, der fremstilles ifølge de oven-10 for beskrevne eksempler, underkastes bedømmelse af deres evne til detektering af leukocyter, der er til stede i urin.

Der fremstilles testprøver fra en normal samling prøver af human urin. En prøve tjener som blindprøve, og leukocyter isoleret fra frisk aftappet blod sættes til to 15 yderligere urinprøver, således at der fås koncentrationer på henholdsvis 0, 10 og 75 leukocyter pr. jil.

Testmaterialerne neddyppes hurtigt i en testprøve og fjernes igen. 2 Minutter senere iagttages materialerne under anvendelse af et spektrofotometer til måling af pro-20 cent reflektans ved forskellige bølgelængder fra 400 til 700 nM.

De opnåede data viser, at alle testmaterialerne udviser klart skelnelige forskelle i lysreflektans svarende til forskellige leukocytniveauer i testprøverne. De 25 opnåede data fremgår af den følgende tabel.

30 35

DK 161028 B

40

Leukocyt- koncentration % Reflektans

Forsøg nr. (celler/jul) ved 555 nm 5 7.3.1* 0

Anvendelse af 10-12 ester (4) 7.3.2 0 67 10 Anvendelse af 10 64 ester (13) 75 60 7.3.3. 0 61

Anvendelse af 10 51 15 ester (18) 75 42 * Visuel iagttagelse: purpur.farve dannes ved 10-12 celler/μΐ; blindprøve giver ingen farveændring .

Claims

1. Middel til bestemmelse af tilstedeværelsen af en analyt udvalgt blandt leukocyter, esterase og protease i en testprøve, kendetegnet ved, at det omfatter en 5 ester, der af leukocyter, esterase eller protease hydrolyseres til phenol eller pseudophenol, hvorpå phenolen eller pseudophenolen ved kobling med en diazoniumzwitterion giver et detekterbart respons, samt en zwitterion med strukturen

10 N* 15. hvilken A“ er en anion, substituenterne R er ens eller forskellige og betyder H, lavere alkyl, aryl eller en aromatisk heterocyclisk gruppe, eller begge substituenterne R tilsammen danner et kondenseret ringsystem, og R' betyder H, OH eller lavere alkyl. 20

2. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at A" befinder sig i 4-stillingen.

3. Middel ifølge krav 2, kendetegnet ved, 25 at A" er S0~ J ·

4. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at zwitterionen hidrører fra l-diazo-2-naphthol-4-sulfonat.

5. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-phenylpyrrol. 1 Middel ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at det yderligere indeholder en accelera- 35 tor. DK 161028B

7. Middel ifølge krav 6, kendetegnet ved, at acceleratoren er en alkohol indeholdende fra 8 til 15 carbonatomer.

8. Middel ifølge krav 6, kendetegnet ved, at acceleratoren er en alkohol med fra 8 til 15 carbonatomer, og at zwitterionen hidrører fra l-diazo-2-naphthol-4-sul-fonat.

9. Testmateriale til bestemmelse af tilstedeværelsen af leukocyter, esterase eller protease, kendetegnet ved, at det omfatter en bærematrix, hvori midlet ifølge ethvert af kravene 1-8 er inkorporeret.

10. Fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af leukocyter, esterase eller protease i en testprøve, kendetegnet ved, at man bringer prøven i kontakt med materialet ifølge krav 9 og iagttager et detekterbart respons.