CN109776499B - 一种用于pH检测的荧光探针，其合成方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新颖的结构式(Ⅰ)表示的用于pH检测的荧光探针，其合成方法及其应用，属于化学合成及荧光检测领域。所述荧光探针具有在酸碱条件下的响应位点，对pH进行检测能够在酸性和碱性条件下都具有高的选择性和灵敏度，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及化学合成及荧光检测领域，具体地说是一种用于pH检测的荧光探针，其合成方法及其应用。
背景技术
细胞内pH(pHi)在离子转运、肌肉收缩、多药耐药、钙调节、细胞生长和凋亡等细胞事件中发挥着重要的作用，pHi异常会导致很多常见病，包括神经退行性疾病、囊性纤维化、阿尔茨海默病和癌症。在不同的原核物种和真核细胞的不同亚细胞间隔中，pHi值可以从高酸性到基本值不等。但在异常的酸碱假丝酵母作用下，细胞膜的通道蛋白、转运蛋白和信号通路蛋白将失去正常功能。此外，酸碱环境异常会中和或降解碱性(酸)蛋白的官能团，导致不可逆的变化。因此，检测pHi的波动对于研究细胞功能、理解胜利和探索细胞代谢至关重要。
近年来，生物体中pH的检测引起了人们越来越多的兴趣。目前用于pHi 检测的手段有核磁共振、HPLC-MS、酸碱结合滴定、吸光度光谱和电化学等。而荧光探针由于其操作简单、灵敏度高、时间分辨率高等优点，是检测细胞pH最强的工具之一。到目前为止，已经设计报道了多个pH荧光探针，但是主要分为两类，一类用于pH在4.00-6.00范围内的酸性范围，另一类用于pH在6.80-7.40的中性范围。而用于强酸性(pH<4.00)和极碱性pH 探针(pH>8.00)的研究较少。到目前为止，在这种极端酸性和碱性条件下生物系统中pH值得检测还缺乏有效的手段。
发明内容
本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供一种化学和光学稳定性好，对pH值进行检测时，能够在酸性和碱性条件下都具有高的选择性和灵敏度的小分子萘酰亚胺化合物荧光探针。
本发明进一步的技术任务是提供上述荧光探针化合物的合成方法。
本发明再进一步的技术任务是提供上述荧光探针化合物的应用。
本发明再进一步的技术任务是提供以上述荧光探针进行pH值检测的方法。
本发明的技术任务是按以下方式实现的：一种用于pH检测的荧光探针,其化学名称为4-吗啉-N-异烟酰肼-萘酰亚胺，其结构式如式(Ⅰ)所示：
以4-吗啉-萘二酸酐和异烟酰肼为反应物，经缩合酰化反应，即可得到式(Ⅰ)所示荧光探针，合成路线如下：
合成过程中，4-吗啉-萘二酸酐与异烟酰肼的摩尔比优选为1:(1-1.5)。
本发明4-吗啉-N-异烟酰肼-萘酰亚胺具有在酸碱条件下的响应位点，在酸性条件下，异烟酰肼上吡啶氮原子结合一个氢离子，而在碱性条件下是酰胺异构体失去一个氢质子，作用机理如下：
具体来说，在强酸条件下，氮原子与吗啡啉基团的孤对电子相互作用消失，抑制电子转移，荧光母核荧光强度降低。随着碱度的增加，吗啡啉基团的电子给药能力得到恢复，同时，将酰胺氮上的氢带走，使酰胺异构化，增强共轭体系，增强荧光强度。因此，本发明的荧光探针在应用于细胞的共聚焦成像时，能够达到良好的成像效果，特别是可以应用于强酸性或极碱性条件下生物系统中的pH值检测。
所述强酸性指pH<4.00；所述极碱性指pH>8.00。
以本发明荧光探针进行pH值检测时，优选将荧光探针化合物配制在 PBS缓冲液与DMSO的混合液中。PBS缓冲液与DMSO的体积比优选为 (3-5):1。
式(Ⅰ)所示荧光探针的摩尔浓度优选为1×10-5-5×10-5mol/L。
本发明的用于pH检测的荧光探针，其合成方法及其应用与现有技术相比具有以下突出地有益效果：
(一)所述荧光探针可以检测到不同酸碱条件下的荧光光谱变化，并且能够在酸性和碱性两个范围内都有响应，填补了现有技术在极端酸性和碱性条件下生物系统中pH值的检测空白；
(二)所述荧光探针具有良好的选择性，检测限低，灵敏度高；
(三)合成简便，并且易于提纯；
(四)可应用于细胞的共聚焦成像，具有重要的应用价值。
附图说明
附图1是荧光探针在不同pH值溶液时的紫外光谱图；
附图2是荧光探针在不同pH值溶液时的荧光光谱图；
附图3是荧光探针分子在pH值3到6.5时荧光光谱图；
附图4是荧光探针分子在pH值8.3到10.5时荧光光谱图；
附图5是荧光探针分子在pH 7.2时的选择性实验图，1.空白；2.F- (10mM)；3.Br-(10mM)；4.NO3 -(10mM)；5.NO2 -(10mM)；6.N3 -(10mM)； 7.SO4 2-(10mM)；8.SO3 2-(10mM)；9.Na+(10mM)；10.Ag+(10mM)；11.Al3+ (10mM)；12.Ca2+(10mM)；13.Cr3+(10mM)；14.Co2+(10mM)；15.Fe2+ (10mM)；16.Fe3+(10mM)；17.Mn2+(10mM)；18.Ni2+(10mM)；19.Pb2+ (10mM)；20.Zn2+(10mM)；21.Cu2+(10mM)；22.H2O2(10mM)；23.NO (20mM)；24.ONOO-(10mM)；25.O2(20mM)；26.ClO-(10mM)；27.·OH (20mM)；28.T-Buoo-(10mM).λex＝400nm；
附图6是荧光探针分子在pH值分别为3.0、6.0、8.0和11时在Hela 细胞中的荧光成像；
附图7是在pH值11时，用荧光探针孵化Hela细胞分别孵化20s、 40s、60s和120s时的荧光成像。
具体实施方式
参照说明书附图，以具体实施例对本发明的用于pH检测的荧光探针，其合成方法及其应用作以下详细地说明。应当理解，此处所描述的具体实施实例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如无特别说明，下述所用各成分的含量为质量百分比含量。
制备实施例：
4-吗啉-萘二酸酐(284mg，1mmol)与异烟酰肼(164.4mg，1.2mmol) 加入到50ml的三口烧瓶中，再向烧瓶中加入10ml N,N-二甲基甲酰胺，氮气保护下回流11h。反应后减压蒸馏除去溶剂，粗品过硅胶柱，展开剂为CH2Cl2/MeOH＝50/1,v/v，最后得到目标化合物淡黄色固体(352mg, 88％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ/ppm):11.64(s,1H),8.87(dd,J＝ 4.5,1.6Hz,2H),8.59(t,J＝8.2Hz,2H),8.50(d,J＝8.1Hz,1H),7.91(dd,J ＝4.4,1.5Hz,2H),7.89–7.86(m,1H),7.42(d,J＝8.2Hz,1H),3.97–3.90 (m,4H),3.31–3.25(m,4H).
13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ/ppm:164.24,162.21,161.64,156.81, 151.16,139.06,133.65,132.11,129.62,126.82,125.90,122.53,121.91, 115.79,115.38,66.59,53.48.ESI-HRMS(C22H18N4O4):calclculated[M+H]+: 403.1406,obtained:403.1390.
产品化合物4-吗啉-N-异烟酰肼-萘酰亚胺(NDI)的结构式如下：
实验例1(紫外光谱)：
在PBS缓冲-DMSO溶液中系统地进行酸碱滴定。NDI样品溶解于PBS 缓冲液：DMSO体积比为4:1的溶液中，并放置30min后测量，如图1所示,在酸性条件下在415nm有一个最大吸收峰以及在345nm有一个侧峰 (pH值6)。当pH值逐渐从6.00变化到11.00,最大吸收峰从415纳米到 401纳米,吸收光谱随着pH值的增加发生蓝移，这是ICT作用导致的。
实验例2(荧光光谱)：
NDI探针的荧光pH滴定如图2、3、4所示。探针NDI在561nm处显示出主发射带。当pH值由3.00变为6.50时，561nm处的荧光强度呈线性增加。但当溶液由酸性变为碱性时，即从6.50到8.30，荧光强度迅速增加，荧光强度的变化与pH值之间不存在线性关系。随着pH值从8.30增加到10.50，探针561nm处的发射带再次线性增加。在强酸条件下，氮原子与吗啡啉基团的孤对电子相互作用消失，抑制电子转移，荧光母核荧光强度降低。随着碱度的增加，吗啡啉基团的电子给药能力得到恢复。同时，将酰胺氮上的氢带走，使酰胺异构化，增强共轭体系，增强荧光强度。
实验例3(选择性实验)：
如附图5所示，在pH 7.2的溶液中存在不同离子、ROS或RNS，561nm 激发探针(5mM)时的荧光，可以看出荧光强度都没有变化。
实验例4(细胞实验)：
用探针NDI孵育Hela细胞在pH 3.0、6.0、8.0和11.0下进行细胞实验测量，如附图6、7所示，实验结果表明探针在其酸性环境下的生物系统中具有良好的工作性能，且海拉细胞孵育10μM NDI 60s,60s后，荧光强度达到最大。
Claims (6)
1.结构式（Ⅰ）所示荧光探针在制备生物成像的试剂中的应用，
式（Ⅰ）。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荧光探针应用于制备细胞的共聚焦成像的试剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荧光探针应用于制备强酸性或极碱性条件下生物系统中的pH值检测的混合液，所述强酸性指pH < 4.00； 所述极碱性指pH >8.00。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将式（Ⅰ）所示荧光探针配制在PBS缓冲液与DMSO的混合液中，得到所述混合液。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，PBS缓冲液与DMSO的体积比为(3-5):1。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，式（Ⅰ）所示荧光探针的浓度为1×10-5-5×10-5mol/L。
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| Design, synthesis, anti-mycobacterial and cytotoxic evaluation of C-4 functionalized 1,8-naphthalimide-heterocyclic hydrazide conjugates;Shalini等;《Chemical Biology & Drug Design》;20190218;第94卷(第1期);第1302页Scheme2 * |
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