WO2005098026A1 - カルボニックアンヒドラーゼｉ活性の測定法 - Google Patents

カルボニックアンヒドラーゼｉ活性の測定法 Download PDF

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cai
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Masaru Hamaoki
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Yamasa Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase

Definitions

  • the present invention relates to a method and a kit for measuring the activity of carbonic anhydrase I (CAI; sometimes referred to as carbonic anhydrase B).
  • CAI carbonic anhydrase I
  • CAII Carbonic anhydrase
  • erythrocytes erythrocytes
  • CAII Carbonic anhydrase
  • isozyme has been suggested to be applied to clinical diagnosis of hyperthyroidism / hypothyroidism different from the total amount of CA !, Non-Patent Document 1.
  • CA has a hydrolase activity in addition to carbonic anhydrase activity, and by utilizing this hydrolase activity, the CA isozyme activity can be easily determined by, for example, a spectroscopic method. It can be measured (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 2
  • a large amount of hydrolases other than CA is present, and under conditions where degradation of the added substrate by these enzymes cannot be ignored, for example, the added substrate may be rapidly degraded. Under the conditions, it was considered impossible to specifically measure the hydrolase activity of the CA isozyme.
  • Non-Patent Document 3 a method of measuring a hydrolase activity before and after immunoadsorption using an antiserum against CAI to specifically measure CAI activity.
  • Non-patent literature l Tohoku J. Exp.Med., 1996, 178, 345-356
  • Non-Patent Document 2 The Journal of Biological Chemistry, 1967; 242 (18): 422
  • Non-patent document 3 Clinica Chimica Acta, 60 (1975), 347-353
  • Non-patent document 4 The Journal of Biological Chemistry, 1966; 241 (10): 513
  • the present invention provides a method for measuring the activity of a hydrolytic enzyme of carbonic anhydrase I (CAI) in a sample, wherein the substrate used for the measurement or the combination of the substrate and the inhibitor is as follows:
  • the present invention provides a method for measuring CAI activity, which comprises using any one of A) to (E).
  • Inhibitors Inhibitors that inhibit hydrolases other than CA
  • CA inhibitor that inhibits both CAI and CAII
  • CA inhibitors that inhibit CAI more strongly than CAII
  • CA inhibitors that inhibit CAI more strongly than CAII The present invention also provides a kit for measuring the activity of a CAI hydrolase in a sample, comprising a substrate, a substrate and an inhibitor, or a combination of a substrate, an inhibitor and an enhancer used in the measurement. Accordingly, the present invention provides a kit for measuring CAI activity, characterized by containing any of the above (A) to (E).
  • the use of a specific substrate, a specific substrate and an inhibitor, or a combination of a specific substrate, an inhibitor and an enhancer enables the activity of CAI hydrolase in a sample to be measured. Can be measured specifically, selectively or substantially, and the operation is simple. As in clinical specimens, a large amount of hydrolytic enzymes other than CA exist, and the degradation of the added substrate by these enzymes cannot be ignored. It is a practical method for measuring CAI activity because it can be applied under conditions that cause degradation. Among them, the method using the combination of the specific substrate, the inhibitor and the enhancer described in (B) above can eliminate the influence of hydrolases other than CA, and can carry out the CAI hydrolase in one measurement. This is a very useful method because the activity can be measured specifically.
  • the sample is not particularly limited as long as it is a sample containing a red blood cell component, but is preferably a red blood cell lysate. Further, even if blood components other than red blood cells are mixed, they can be used as a sample.
  • the present invention relates to a method for measuring the activity of a CAI hydrolase in a sample, which comprises a substrate, a substrate and an inhibitor, or a combination of a substrate, an inhibitor and an enhancer used in the measurement.
  • a measurement method characterized by using any of the following (A) to (E).
  • Inhibitors Inhibitors that inhibit hydrolases other than CA
  • Inhibitor CA inhibitor that inhibits both CAI and CAII (D)
  • Substrate Substrate that reacts with both CAI and CAII
  • CA inhibitors that inhibit CAI more strongly than CAII
  • CA inhibitors that inhibit CAI more strongly than CAII
  • any one of the above (A) and (B) is used as a substrate, a substrate and an inhibitor, or a combination of a substrate, an inhibitor and an enhancer,
  • the hydrolase activity in the sample, specifically the esterase activity is measured under two conditions, in the presence and absence of the CA inhibitor, and the difference is determined by the CAI hydrolase activity
  • the above two methods are included.
  • the term "substrate having higher reactivity to CAI than CAII” means that the reaction amount per CAI enzyme protein (substrate change amount) depends on the substrate concentration, reaction time, etc. Substrate that is more than twice as large.
  • esters such as 2-hydroxy-5-toluene toluenesulfonic acid sultone, o-trophenyl ester, p-trophenyl thioester, ⁇ -naphthyl ester and the like are preferable, and o-trophenyl ester is particularly preferred.
  • These esters are preferably fatty acid esters, and more preferably fatty acid esters having 1 to 6 carbon atoms, and specifically, o-trophenyl acetate.
  • substrate that reacts with both CAI and CAII means that the reaction amount per CAI enzyme protein (substrate change amount) is twice as large as the CAII reaction amount, depending on the substrate concentration, reaction time, etc. Substrate is less than.
  • examples thereof include esters different from the above, such as p-trophenyl ester and a-naphthyl ester, and P-trophenyl ester is particularly preferred. These esters are preferably fatty acid esters, more preferably fatty acid esters having 1 to 6 carbon atoms, and more preferably P-trophenyl acetate.
  • inhibitor that inhibits a hydrolase other than CA refers to an enzyme of a hydrolase other than CA by setting a substrate concentration, an inhibitor concentration, a reaction time, and the like.
  • protease inhibitor cocktails catalog. No. P2714 and P83 40 (Sigma)
  • AEBSF 4- (2-aminoethyl) benzenesulfur fluoride
  • PMSF a-phenylmethanesulfur fluoride
  • a drug that enhances the inhibitory action of the inhibitor means an agent that does not have an inhibitory action by itself but enhances the inhibitory action of the above-mentioned hydrolase inhibitor.
  • the enhancer include aldehydes such as formaldehyde, acetoaldehyde, and dataraldehyde.
  • a "CA inhibitor that more strongly inhibits CAI than CAII” refers to a CAII inhibitory effect on the amount of CAI reaction change per enzyme protein amount, depending on the settings of substrate concentration, inhibitor concentration, and reaction time. Means a CA inhibitor that is more than twice the inhibitory effect on the amount of reaction.
  • imidazole, anions (CNS-, CNO ", CN", ⁇ , etc.) and the like can be mentioned.
  • CA inhibitor that inhibits both CAI and CAII refers to the reaction per CAI enzyme protein compared to the case where no inhibitor is used, by setting the substrate concentration, inhibitor concentration, and reaction time.
  • a CA inhibitor whose inhibitory effect on the amount (substrate change) is less than twice the inhibitory effect on the reaction amount of CAII.
  • examples thereof include amides (eg, dorzolamide, brinzolamide, acetazolamide, methazolamide, etc.) and rubamoyl phosphate, particularly preferably acetazonolamide.
  • Substrate nitrophenylesters, especially substrates that are more reactive to CAI than CAII. 12 trowel acetate
  • Inhibitors As inhibitors that inhibit hydrolases other than CA, protease inhibitor cocktail, AEBSF or pepstatin, especially AEBSF
  • Enhancers Agents that enhance the action of inhibitors include aldehydes, especially formaldehyde,
  • Inhibitors Inhibits both CAI and CAII As inhibitors of CA, amides,
  • Inhibitors Inhibits CAI more strongly than CAII.
  • Inhibitors Inhibits CAI more strongly than CAII.
  • the amount of reaction per amount of enzyme protein can be determined by a conventional method for measuring the reaction rate of an enzyme, such as substrate concentration, enzyme concentration, inhibitor concentration, reaction temperature, reaction PH and reaction time. It can be measured by setting constant conditions.
  • a substrate that is degraded by a hydrolase an inhibitor that inhibits a hydrolase other than CA, and an action of inhibiting the hydrolase activity of the inhibitor.
  • Enhancers that enhance the activity of CA or CA inhibitors that do not inhibit hydrolases other than CA and have the above-mentioned properties can be used as the substrate, inhibitor, and enhancer of the present invention.
  • the measurement of the hydrolase activity in the sample is not particularly limited, and a conventional method suitable for the substrate used may be employed. Specifically, a method using a spectrophotometer, a method for producing diazonium salts and azo dyes and quantifying them, a pH-stat method, and the like can be adopted (for example, see Masai Kanai, “Clinical Inspection Methods”). (Kanehara Publishing Co., Ltd., published on December 10, 1996, 30th edition, pages 312-315, edited by The Chemical Society of Japan, Biochemical Data Book II, pages 6-269)
  • the present invention can provide a kit for measuring a CAI hydrolase activity, which contains any one of the combinations of (A) to (E) described above.
  • a kit may include the following reagents.
  • sample diluents to which inhibitors and enhancers have been added in advance.
  • it may be a substrate solution.
  • an enhancer may be further attached.
  • select reagents according to the measurement method from reagents such as diazonium salt reagents, reagents for stopping the reaction, standard enzyme reagents, and reagents for sample pretreatment. Attach the kit of the invention.
  • the substrate used was o--trophenyl acetate, which is more reactive to CAI than CAII, and no inhibitor was used.
  • Table 1 shows the measurement results. As is evident from Table 1, it was revealed that CAI can be substantially measured even with the substrate o --- trophenyl acetate alone having a higher reactivity to CAI than CAII.
  • Human erythrocyte lysate was used as a sample.
  • o-ditrophenyl acetate which is more reactive to CAI than CAII, as a substrate, and 4- (2-aminoethyl) benzenesulfonate as an inhibitor that inhibits hydrolases other than CA -Fluoride (AEBSF) and formaldehyde as its enhancer.
  • AEBSF CA -Fluoride
  • Table 2 shows the measurement results. As is evident from Table 2, CAI is more specific when the substrate is more reactive to CAI than CAII. It became clear that it could be measured.
  • Human erythrocyte lysate was used as a sample.
  • O--Trophenyl acetate which is more reactive to CAI than CAII, is used as a substrate, and 4- (2-aminoethyl) benzenesulfonate is used as an inhibitor to inhibit hydrolases other than CA.
  • -Fluoride (AEBSF) and formaldehyde as its enhancer.
  • the zinc concentration on the horizontal axis indicates the zinc concentration (mgZD) in the sample determined by the atomic absorption method because CAI is a zinc enzyme that binds to 80% or more of zinc in erythrocytes.
  • the use of an inhibitor that inhibits a hydrolase other than CA and an enhancer thereof can suppress the mixed hydrolase activity, and the CAI concentration and the zinc concentration are reduced. It shows a good correlation and y-intercept (correlation coefficient: 0.9577, y-intercept: 2.00898), and the method of the present invention shows that a large amount of hydrolytic enzymes other than CA such as clinical specimens is present. It was confirmed that the decomposition of the added substrate was a practical method for measuring CA I that could be applied even under non-negligible conditions.
  • O-Ditrophenyl acetate which is more reactive to CAI than CAII
  • acetazolamide which inhibits both CAI and CAII
  • p-nit p--trophenol-acetate
  • Acetazolamide was used as a CA inhibitor in the same manner as described above.
  • CA-specific absorbance change [ ⁇ A1— ⁇ A3] — [ ⁇ A2— ⁇ A4]
  • Table 3 shows the measurement results. As is evident from Table 3, in the combination of p--trofuhl-acetate and acetazolamide, the reactivity of p--trofuhl-acetate as a substrate is less than twice that of CAI and CAII. O- -Trofuhl-acetate is not specific to CAI and reacts to both CAI and CAII, so we cannot measure CAI specifically. O- -Trofuhl-acetate and acetazolamide In a combination of It was evident that the reactivity of o--trophyl-acetate as a substrate was more than twice the difference between CAI and CAII, so that it was possible to specifically measure CAI.
  • Human erythrocyte lysate was used as a sample.
  • O--Trophenyl acetate was used as a substrate and acetazolamide was used in combination as an inhibitor.
  • CA-specific absorbance change [ ⁇ A1— ⁇ A3] — [ ⁇ A2— ⁇ A4]
  • P--Trophenyl acetate which reacts to both CAI and CAII, is used as a substrate. Used together.
  • CA-specific absorbance change [ ⁇ A1— ⁇ A3] — [ ⁇ A2— ⁇ A4]
  • Table 4 shows the measurement results. As is evident from Table 4, even if the substrate P --- trophyl-acetate reacts with both CAI and CAII, CAI can be specifically inhibited when combined with iodine ion, which inhibits CAI more strongly than CAII, as a CA inhibitor. It became clear that we could measure
  • Human erythrocyte lysate was used as a sample.
  • CAI-specific absorbance change [ ⁇ A1— ⁇ A3] — [ ⁇ A2— ⁇ A4]
  • Fig. 4 shows the results.
  • CAI concentration on the vertical axis 20 8! 111 using human JICA 1 solution instead of the sample solution the result in terms of mg of CAI of human erythrocyte lysate based on hemoglobin it to further (Hb) and expressed as mgZgHb.
  • the zinc concentration on the horizontal axis indicates the zinc concentration (mgZD) in the sample determined by the atomic absorption method because CAI is a zinc enzyme that binds to 80% or more of zinc in erythrocytes.
  • O--Trofuryl acetate (o- nitrophenyl acetate), which is more reactive to CAI than CAII, is used as a substrate. Used together.
  • CA-specific absorbance change [ ⁇ A1— ⁇ A3] — [ ⁇ A2— ⁇ A4]
  • Table 5 shows the measurement results. As is evident from Table 5, the substrate o- -trophenyl acetate, which is more reactive to CAI than CAII, inhibits CAI more strongly than CAII as a CA inhibitor It became clear that CAI can be measured specifically when combined with iodine ions [Table 5]
  • Human erythrocyte lysate was used as a sample.
  • O--Trophenyl acetate was used as a substrate, and iodine ion was used in combination as a CA inhibitor.
  • ⁇ 1 change in absorbance when using (1) solution, (2) control solution, and (3) solution
  • CAI-specific absorbance change [ ⁇ A1— ⁇ A3] — [ ⁇ A2— ⁇ A4]
  • Fig. 5 shows the results.
  • CAI concentration on the vertical axis 20 8! 111 using human JICA 1 solution instead of the sample solution the result in terms of mg of CAI of human erythrocyte lysate based on hemoglobin it to further (Hb) and expressed as mgZgHb.
  • the zinc concentration on the horizontal axis indicates the zinc concentration (mgZD) in the sample determined by the atomic absorption method because CAI is a zinc enzyme that binds to 80% or more of zinc in erythrocytes.
  • the method of the present invention is a condition in which a large amount of hydrolytic enzymes other than CA such as clinical specimens are present, and degradation of the added substrate by those enzymes cannot be ignored. It was confirmed that it was a practical method for specific CAI measurement that could be applied below.
  • FIG. 1 shows the measurement results in Example 2, in which the horizontal axis represents the zinc concentration by the atomic absorption method as a control and the vertical axis represents the CAI concentration by the present method. This is a plot of the measurement results.
  • Fig. 2 shows the measurement results in Example 4, where the horizontal axis represents the zinc concentration by the atomic absorption method as a control and the vertical axis represents the CAI concentration by the present method. Is plotted.
  • Fig. 3 shows the measurement results in Example 6, in which the horizontal axis represents the zinc concentration by the atomic absorption method as a control and the vertical axis represents the CAI concentration by the present method. Is plotted.
  • Fig. 4 shows the measurement results in Example 8, in which the horizontal axis represents the zinc concentration by the atomic absorption method as a control and the vertical axis represents the CAI concentration by the present method. Plot It was done.
  • Fig. 5 shows the measurement results in Example 10, where the horizontal axis represents the zinc concentration by the atomic absorption method as a control and the vertical axis represents the CAI concentration by the present method. It is the plots.

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Abstract

　ＣＡアイソザイム活性を特異的に測定する方法の提供。 　試料中のカルボニックアンヒドラーゼＩ（ＣＡＩ）の加水分解酵素活性を測定する方法であって、測定に使用する基質又は基質と阻害剤の組合せとして、以下（Ａ）～（Ｅ）のいずれかを用いることを特徴とするＣＡＩ活性の測定法。 　（Ａ）基　質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質 　（Ｂ）基　質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質 　　　　阻害剤：ＣＡ以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤 　（必要により、上記阻害剤の阻害作用を増強する薬剤を併用してもよい） 　（Ｃ）基　質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質 　　　　阻害剤：ＣＡＩとＣＡＩＩの両方を阻害するＣＡの阻害剤 　（Ｄ）基　質：ＣＡＩとＣＡＩＩの両方に反応する基質 　　　　阻害剤：ＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤 　（Ｅ）基　質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質 　　　　阻害剤：ＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤                                                                                 

Description

明 細 書
カルボニックアンヒドラーゼ I活性の測定法
技術分野
[0001] 本発明は、カルボニックアンヒドラーゼ I (CAI；カルボニックアンヒドラーゼ Bと称され ることもある）活性の測定法及び測定用キットに関するものである。
背景技術
[0002] 赤血球中には、カルボニックアンヒドラーゼ（CA) Iと CAIIが存在し、臨床検査にお いて CAIと CAIIの総量は、鉄欠乏性貧血、 respiratory distress syndrome等の 診断に用いられている。アイソザィムである CAIは、 CA総量とは違った甲状腺機能 亢進症 ·低下症等の臨床診断への応用が示唆されて!、る (非特許文献 1)。
[0003] CAのァイソザィム活性を分別測定する方法としては、免疫拡散法が挙げられるが、 操作が煩雑で時間が力かるため、臨床検査の場にぉ 、ては利用されて 、な 、。
[0004] また、 CAは炭酸脱水酵素活性以外にも、加水分解酵素活性を有しており、この加 水分解酵素活性を利用すれば、例えば分光学的方法により簡便に CAのアイソザィ ム活性を測定できる可能性がある（非特許文献 2)。しかし、臨床検体のように、 CA以 外の加水分解酵素類が多量に存在し、それらの酵素による添加した基質の分解が 無視できない条件下、例えば添加した基質が速やかに分解してしまうような条件下で は、 CAアイソザィムの加水分解酵素活性を特異的に測定することは不可能と考えら れていた。
[0005] このため、 CAIに対する抗血清を用いて、免疫吸着前後の加水分解酵素活性を測 定し、 CAI活性を特異的に測定する方法が報告されているが (非特許文献 3)、この 方法とても簡便な測定法とは 、えなかった。
[0006] さらに、 CA特異的な阻害剤であるァセタゾールアミド（acetazolamide)を用いて 全加水分解酵素中の総 CA活性を測定することは可能であるものの（非特許文献 4) 、 CAアイソザィム活性の特異的な測定法に関しては何ら報告されて 、な 、。
非特許文献 l :Tohoku J. Exp. Med. , 1996, 178, 345- 356
非特許文献 2 :The Journal of Biological Chemistry, 1967 ; 242 (18) :422 非特許文献 3 : Clinica Chimica Acta, 60 (1975) , 347- 353 非特許文献 4:The Journal of Biological Chemistry, 1966 ; 241 (10) : 513
7- 5149
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、 CAのァイソザィム活性を特異的に測定する方法を提供することを目的 とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者は鋭意研究を重ねた結果、特定の基質、ある!、は特定の基質と阻害剤及 び必要によりさらに増強剤を組み合わせて用いることで、 CAのァイソザィム活性、特 に CAIの加水分解酵素活性を特異的に測定することができ、この方法は CA以外の 加水分解酵素類が多量に存在するような全血などの臨床検体へも適用可能であるこ とを見出し、本発明を完成させた。
[0009] すなわち、本発明は、試料中のカルボニックアンヒドラーゼ I (CAI)の加水分解酵素 活性を測定する方法であって、測定に使用する基質又は基質と阻害剤の組合せとし て、以下 (A)〜 (E)の 、ずれかを用いることを特徴とする CAI活性の測定法を提供 するものである。
(A)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
(B)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
阻害剤： CA以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤
(必要により、上記阻害剤の阻害作用を増強する薬剤を併用してもよい）
(C)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
阻害剤： CAIと CAIIの両方を阻害する CAの阻害剤
(D)基 質: CAIと CAIIの両方に反応する基質
阻害剤： CAIIより CAIを強く阻害する CAの阻害剤
(E)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
阻害剤： CAIIより CAIを強く阻害する CAの阻害剤 [0010] また、本発明は、試料中の CAIの加水分解酵素活性を測定するためのキットであつ て、測定に使用する基質、基質と阻害剤、又は基質と阻害剤と増強剤の組合せとし て、前述の (A)〜 (E)の 、ずれかを含有することを特徴とする CAI活性の測定用キッ トを提供するものである。
発明の効果
[0011] 本発明の測定法によれば、特定の基質、特定の基質と阻害剤、又は特定の基質と 阻害剤と増強剤の組合せを使用することにより、試料中の CAIの加水分解酵素活性 を特異的、選択的あるいは実質的に測定することができ、また操作も簡便である。し 力も臨床検体のように CA以外の加水分解酵素類が多量に存在し、それら酵素によ る添加した基質の分解が無視できないような条件下、具体的には添加した基質が速 やかに分解してしまうような条件下でも適用することができるため、実用的な CAI活性 の測定法である。その中でも、特に上記 (B)の特定の基質と阻害剤と増強剤の組合 せを使用する方法は、 CA以外の加水分解酵素類の影響を排除でき、一回の測定で CAIの加水分解酵素活性を特異的に測定することができるため、極めて有用な方法 である。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明にお 、て、試料 (サンプル）は、赤血球成分が含まれる試料であれば特に制 限されないが、好ましくは赤血球溶解液である。また、赤血球以外の血液成分が混 在して ヽても試料として用いることができる。
[0013] 本発明は、前述したように、試料中の CAIの加水分解酵素活性を測定する方法で あって、測定に使用する基質、基質と阻害剤、又は基質と阻害剤と増強剤の組合せ として、以下の (A)〜 (E)のいずれかを用いることを特徴とする測定法である。
(A)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
(B)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
阻害剤： CA以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤
(必要により、上記阻害剤の阻害作用を増強する薬剤を併用してもよい）
(C)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
阻害剤： CAIと CAIIの両方を阻害する CAの阻害剤 (D)基 質: CAIと CAIIの両方に反応する基質
阻害剤： CAIIより CAIを強く阻害する CAの阻害剤
(E)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
阻害剤： CAIIより CAIを強く阻害する CAの阻害剤
[0014] すなわち、本願発明の方法としては、基質、基質と阻害剤、又は基質と阻害剤と増 強剤の組合せとして、上記 (A)又は（B)のいずれかを用いて、サンプル中の加水分 解酵素活性、具体的にはエステラーゼ活性を測定し、その加水分解酵素活性を CAI の加水分解酵素活性とする方法と、基質と阻害剤の組合せとして、上記 (C)〜(E)の いずれかを用いて、試料中の加水分解酵素活性、具体的にはエステラーゼ活性を、 CA阻害剤の存在下と非存在下の 2つの条件下で測定し、その差を CAIの加水分解 酵素活性とする方法の 2つの方法を包含するものである。
[0015] 本発明において、「CAIIより CAIに反応性の高い基質」とは、基質濃度、反応時間 等の設定により、 CAIの酵素蛋白量当りの反応量 (基質変化量)が CAIIの反応量よ りも 2倍以上となる基質を意味する。例えば 2 ヒドロキシー5 -トロー a トルエン スルホン酸スルトン、 o -トロフエ-ルエステル、 p -トロフエ-ルチオエステル、 β ナフチルエステル等のエステル類が挙げられ、特に ο -トロフエ-ルエステルが 好ましい。これらのエステルは脂肪酸のエステルが好ましぐさらに炭素数 1〜6の脂 肪酸エステルが好ましく、具体的には ο -トロフエニルアセテートが好まし 、。
[0016] 「CAIと CAIIの両方に反応する基質」とは、基質濃度、反応時間等の設定により、 CAIの酵素蛋白量当りの反応量 (基質変化量)が CAIIの反応量よりも 2倍未満であ る基質を意味する。例えば p -トロフエ-ルエステル、 a ナフチルエステル等の 上記とは異なるエステル類が挙げられ、特に P -トロフエ-ルエステルが好ましい。 これらのエステルは脂肪酸のエステルが好ましぐさらに炭素数 1〜6の脂肪酸エステ ルが好ましぐ具体的には P -トロフエニルアセテートが好ましい。
[0017] 「CA以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤」とは、基質濃度、阻害剤濃度、反応 時間等の設定により、阻害剤を用いない場合より、 CA以外の加水分解酵素の酵素 蛋白量当たりの反応量 (基質変化量)の、 CAの反応量に対する比を小さくできる阻 害剤を意味する。例えばプロテアーゼインヒビターカクテル（cat. no. P2714や P83 40など；シグマ社）、 4一（2 アミノエチル）ベンゼンスルフォ-ルフルオライド（AEB SF)、 a フエ-ルメタンスルホ-ルフルオライド（PMSF)、ぺプスタチン等が挙げら れる。
[0018] 「該阻害剤の阻害作用を増強する薬剤」とは、それ単独での阻害作用はないが、上 記加水分解酵素阻害剤の阻害作用を増強させる薬剤を意味する。増強剤としては、 例えばホルムアルデヒド、ァセトアルデヒド、ダルタルアルデヒド等のアルデヒド類が挙 げられる。
[0019] 「CAIIより CAIを強く阻害する CAの阻害剤」とは、基質濃度、阻害剤濃度、反応時 間等の設定により、 CAIの酵素蛋白量当りの反応変化量への阻害作用が CAIIの反 応量への阻害作用に対して 2倍以上となる CA阻害剤を意味する。例えばイミダゾー ル、ァニオン類（CNS— , CNO", CN", Γ等）等が挙げられる。
[0020] 「CAIと CAIIの両方を阻害する CAの阻害剤」とは、基質濃度、阻害剤濃度、反応 時間等の設定により、阻害剤を用いない場合より、 CAIの酵素蛋白量当りの反応量（ 基質変化量)への阻害作用が、 CAIIの反応量への阻害作用に対して 2倍未満であ る CA阻害剤を意味する。例えばアミド類 (例、ドルゾールアミド、ブリンゾールアミド、 ァセタゾールアミド、メタゾールアミド等）又は力ルバモイルホスフェートが挙げられ、 特にァセタゾーノレアミドが好まし 、。
[0021] 上記 (A)〜 (E)の組み合わせにお 、て、基質、阻害剤、増強剤の好ま 、組み合 わせとしては、以下の通りである。
(A)基 質： CAIIより CAIに反応性の高い基質として、 ο ニトロフエ-ルェ ステル類、特に。一二トロフエ-ルアセテート
(B)基 質： CAIIより CAIに反応性の高い基質として、 o -トロフヱ -ルェ ステル類、特に。一二トロフエ-ルアセテート
阻害剤： CA以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤として、プロテアーゼインヒ ビターカクテル、 AEBSF又はぺプスタチン、特に AEBSF
増強剤：阻害剤の作用を増強する薬剤として、アルデヒド類、特にホルムアルデ ヒド、
(C)基 質： CAIIより CAIに反応性の高い基質として、 o -トロフエ-ルェ ステル類、特に。一二トロフエ-ルアセテート
阻害剤： CAIと CAIIの両方を阻害する CAの阻害剤として、アミド類、特
にァセタゾーノレアミド
(D)基 質： CAIと CAIIの両方に反応する基質として、 p— -トロフ -ルェ ステル類、特に p— -トロフエ-ルアセテート
阻害剤： CAIIより CAIを強く阻害する CAの阻害剤として、ァ-オン類、
特にヨウ素イオン
(E)基 質： CAIIより CAIに反応性の高い基質として、 ο—ニトロフエ-ルェ ステル類、特に。一二トロフエ-ルアセテート
阻害剤： CAIIより CAIを強く阻害する CAの阻害剤として、ァ-オン類、
特にヨウ素イオン
[0022] なお、酵素蛋白量当たりの反応量は、酵素の反応速度を測定する常法を採用すれ ばよぐ基質濃度、酵素濃度、阻害剤濃度、反応温度、反応 PH及び反応時間等、一 定条件の設定により測定できる。
また、上記の例示した基質、阻害剤及び増強剤以外にも、加水分解酵素で分解さ れる基質、 CA以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤、該阻害剤の加水分解酵素 活性を阻害する作用を増強する増強剤、あるいは CA以外の加水分解酵素を阻害し ない CAの阻害剤で、上記した性質を有するものであれば、本発明の基質、阻害剤、 増強剤として利用可能である。
[0023] 試料中の加水分解酵素活性の測定は、特に制限されず、使用した基質に適した常 法を採用すればよい。具体的には、分光光度計を使用する方法、ジァゾニゥム塩とァ ゾ色素を生成させ、これを定量する方法、 pHスタツト法等を採用することができる（例 えば、金井正光編「臨床検査法提要」（金原出版株式会社、平成 8年 12月 10日第 3 0版発行、第312〜315頁、日本化学会編、生化学データブック II、 6〜269頁参照）
) o
[0024] また本発明は、前述した (A)〜（E)の組合せの ヽずれかを含有する CAIの加水分 解酵素活性測定用のキットを提供することができる。このようなキットには、下記の試 薬を含むことができる。また、阻害剤や増強剤をあらかじめ添加した試料希釈液ある いは基質液としてもよい。
(1)試料希釈液
(2)基質液
(3)阻害剤液 (必要により添付）
[0025] なお、上記阻害剤の他に、さらに増強剤を添付してもよい。また、上記各試薬の他 に、必要により、ジァゾ二ゥム塩試薬、反応停止用試薬、標準酵素試薬、サンプル前 処理用試薬などの各試薬から測定法に応じた試薬を適宜選択し、本発明のキット〖こ 添付してちょい。
実施例
[0026] 以下、本発明について実施例をあげて具体的に説明する力 本発明はこれらによ つて何等限定されるものではな 、。
[0027] 実施例 1
<試薬 >
基質として CAIIより CAIに反応性の高い o— -トロフエ-ルアセテート（o— nitroph enyl acetate)を用い、阻害剤は用いなかった。
<方法 >
(1)精製水を用いて 25 μ gZmlヒト CAI溶液と 5 μ gZmlヒト CAII溶液を用意した。
(2) 30mMジメチルマロン酸緩衝液 (pH8)を用意した。
(3)精製水を用いて、 9mMの o— -トロフエニルアセテート溶液を用意した。ただし、 基質はアセトンに溶解してから添カロし、アセトン含量は 2% (vZv)である。
(4)酵素及び基質毎に（1)、 (2)及び（3)のそれぞれの溶液を 50 μ 1ずつを混合し、 室温で 5分間反応させ、 405nmの吸光度変化（ Δ A)を測定した。
ただし、（1)の対照溶液として精製水を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの 吸光度変化を測定し、吸光度変化を下式によって算出し、 CA特異的な吸光度変化 とした。
[0028] ΔΑ1 : (1)溶液、（2)溶液及び（3)溶液使用時の吸光度変化
ΔΑ3 : (1)対照溶液、（2)溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
[0029] <算出式> CA特異的な吸光度変化 = ΔΑ1 - ΔΑ3
[0030] <結果 >
測定の結果を表 1に示す。表 1から明らかなように、 CAIIより CAIに反応性の高い 基質 o— -トロフエニルアセテート単独でも、 CAIを実質的に測定できることが明らか となった。
[0031] [表 1]
Figure imgf000009_0001
[0032] 実施例 2
<試料 >
ヒト赤血球溶解液を試料として使用した。
<試薬 >
基質として o— -トロフエ-ルアセテートを用い、阻害剤は用いな力つた。 <方法 >
(1)ヒト赤血球溶解液を精製水で 250倍に希釈し試料溶液とする。
(2) 30mMジメチルマロン酸緩衝液 (pH8)を用意した。
(3)精製水を用いて、 9mMの o— -トロフエニルアセテート溶液を用意した。ただし、 基質はアセトンに溶解してから添カロし、アセトン含量は 2% (vZv)である。
(4) (1)、（2)及び（3)のそれぞれの溶液を 50 1ずつを混合し、室温で 5分間反応さ せ、 405nmの吸光度変化（ Δ A)を測定した。
ただし、（1)の対照溶液として精製水を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの 吸光度変化を測定し、吸光度変化を下式によって算出し、 CAI特異的な吸光度変化 とした。
[0033] ΔΑ1 : (1)溶液、（2)溶液及び（3)溶液使用時の吸光度変化
ΔΑ3 : (1)対照溶液、（2)溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
[0034] <算出式> CAI特異的な吸光度変化 = ΔΑ1 - ΔΑ3
[0035] <結果 >
結果を図 1に示す。なお、縦軸の CAI濃度は、 20 8 !111ヒトじ八1溶液を試料溶液 の代わりに用い、その結果を基にヒト赤血球溶解液中の CAI量を mgに換算し、さら にこれをヘモグロビン (Hb)量で除し、 mgZgHbとして示した。また、横軸の亜鉛濃 度は、 CAIが赤血球中の亜鉛の 8割以上と結合している亜鉛酵素であることから、原 子吸光法により求めた試料中の亜鉛濃度 (mgZDを示した。
[0036] この結果から明らかなように、 y切片に相当する CA以外の加水分解酵素による活 性がかなり混在しているが、 CAIIより CAIに反応性の高い基質を使えば、阻害剤を 用いなくとも CAI濃度と亜鉛濃度は良好な相関関係を示し (相関係数: 0. 9380、 y 切片：6. 2524)、本発明方法が臨床検体などの CA以外の加水分解酵素類が多量 に存在し、その酵素による添加した基質の分解が無視できない条件下でも適用可能 な実用的な CAIの特異的な測定法であることが確認された。
[0037] 実施例 3
<試薬 >
基質として CAIIより CAIに反応性の高い o—二トロフエ-ルアセテート（o— nitroph enyl acetate)を用い、 CA以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤として 4一（2— アミノエチル）ベンゼンスルフォ-ルフルオライド (AEBSF)、及びその増強剤として ホルムアルデヒドを用いた。
<方法 >
(1)精製水を用いて 25 μ gZmlヒト CAI溶液と 5 μ gZmlヒト CAII溶液を用意した。
(2) 30mMジメチルマロン酸緩衝液（pH8)、 0. lmMAEBSF、 50mMホルムアル デヒドを用意した。
(3)精製水を用いて、 9mMの o— -トロフエニルアセテート溶液を用意した。ただし、 基質はアセトンに溶解してから添カロし、アセトン含量は 2% (vZv)である。
(4)酵素及び基質毎に（1)、 (2)及び（3)のそれぞれの溶液を 50 μ 1ずつを混合し、 室温で 5分間反応させ、 405nmの吸光度変化（ Δ A)を測定した。
ただし、（1)の対照溶液として精製水を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの 吸光度変化を測定し、吸光度変化を下式によって算出し、 CA特異的な吸光度変化 とした。
[0038] ΔΑ1 : (1)溶液、（2)対照溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
ΔΑ3 : (1)対照溶液、（2)対照溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
[0039] <算出式>
CA特異的な吸光度変化 = ΔΑ1 - ΔΑ3
[0040] <結果 >
測定の結果を表 2に示す。表 2から明らかなように、 CAIIより CAIに反応性の高い 基質 o— -トロフエニルアセテートと CA以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤およ びその増強剤を用いれば、 CAIをより特異的に測定できることが明らかとなった。
[0041] [表 2]
Figure imgf000011_0001
[0042] 実施例 4
<試料 >
ヒト赤血球溶解液を試料として使用した。
<試薬 >
基質として CAIIより CAIに反応性の高い o— -トロフエ-ルアセテート（o— nitroph enyl acetate)を用い、 CA以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤として 4一（2— アミノエチル）ベンゼンスルフォ-ルフルオライド (AEBSF)、及びその増強剤として ホルムアルデヒドを用いた。
<方法 >
(1)ヒト赤血球溶解液を精製水で 250倍に希釈し試料溶液とする。
(2) 30mMジメチルマロン酸緩衝液（pH8)、 0. lmMAEBSF、 50mMホルムアル デヒドを用意した。
(3)精製水を用いて、 9mMの o— -トロフエニルアセテート溶液を用意した。ただし、 基質はアセトンに溶解してから添カロし、アセトン含量は 2% (vZv)である。
(4) (1)、（2)及び（3)のそれぞれの溶液を 50 1ずつを混合し、室温で 5分間反応さ せ、 405nmの吸光度変化（ Δ A)を測定した。
ただし、（1)の対照溶液として精製水を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの 吸光度変化を測定し、吸光度変化を下式によって算出し、 CAI特異的な吸光度変化 とした。
[0043] ΔΑ1 : (1)溶液、（2)溶液及び（3)溶液使用時の吸光度変化
ΔΑ3 : (1)対照溶液、（2)溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
[0044] <算出式 >
CAI特異的な吸光度変化 = ΔΑ1 - ΔΑ3
[0045] <結果 >
結果を図 2に示す。なお、縦軸の CAI濃度は、 20 8 !111ヒトじ八1溶液を試料溶液 の代わりに用い、その結果を基にヒト赤血球溶解液中の CAI量を mgに換算し、さら にこれをヘモグロビン (Hb)量で除し、 mgZgHbとして示した。また、横軸の亜鉛濃 度は、 CAIが赤血球中の亜鉛の 8割以上と結合している亜鉛酵素であることから、原 子吸光法により求めた試料中の亜鉛濃度 (mgZDを示した。
[0046] この結果から明らかなように、 CA以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤およびそ の増強剤を使えばその混在する加水分解酵素活性を抑制することができ、 CAI濃度 と亜鉛濃度は良好な相関関係と y切片を示し (相関係数: 0. 9577、 y切片：2. 0898 )、本発明方法が臨床検体などの CA以外の加水分解酵素類が多量に存在し、その 酵素による添加した基質の分解が無視できない条件下でも適用可能な実用的な CA Iの特異的な測定法であることが確認された。
[0047] 実施例 5
<試薬 >
基質として CAIIより CAIに反応性の高い o—二トロフエ-ルアセテート（o— nitroph enyl acetate)を用い、阻害剤として CAIと CAIIの両方を阻害するァセタゾールァ ミド（acetazolamide)を組み合わせて用いた。また、比較として、基質として CAIに 特異性の低い（CAIと CAIIの両方に反応する） p— -トロフエ-ルアセテート（p— nit rophenyl acetate)を用い、 CAの阻害剤として上記と同様にァセタゾールアミド（a cetazolamide)を糸且み合わせて用いた。
<方法 >
(1)精製水を用いて 25 μ gZmlヒト CAI溶液と 5 μ gZmlヒト CAII溶液を用意した。
(2) 30mMジメチルマロン酸緩衝液 (pH8)を用いて、 3mMァセタゾールアミド溶液 を用意した。ただし、ァセタゾールアミドはジメチルスルホキシド (DMSO)に溶解して 力ら添加し、 DMSO含量は 0. 15% (vZv)である。
(3)精製水を用いて、 6mMの o— -トロフエ-ルアセテート溶液と 3mMの p— -トロ フエニルアセテート溶液を用意した。ただし、それぞれの基質はアセトンに溶解してか ら添加し、アセトン含量は 2% (v/v)である。
(4)酵素及び基質毎に（1)、 (2)及び（3)のそれぞれの溶液を 50 μ 1ずつを混合し、 室温で 5分間反応させ、 405nmの吸光度変化（ Δ A)を測定した。
ただし、（1)の対照溶液として精製水を、（2)の対照溶液として 0. 15% (v/v) DM SO含有 30mMジメチルマロン酸緩衝液を用い、上記と同様に反応させてそれぞれ の吸光度変化を測定し、ァセタゾールアミドによって阻害される酵素の特異的な吸光 度変化を下式によって算出し、 CA特異的な吸光度変化とした。
[0048] ΔΑ1 : (1)溶液、（2)対照溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
ΔΑ2 : (1)溶液、（2)溶液及び（3)溶液使用時の吸光度変化
ΔΑ3 : (1)対照溶液、（2)対照溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化 ΔΑ4 : (1)対照溶液、（2)溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
[0049] <算出式 >
CA特異的な吸光度変化 = [ Δ A1— Δ A3]— [ Δ A2— Δ A4]
[0050] <結果 >
測定の結果を表 3に示す。表 3から明らかなように、 p— -トロフエ-ルアセテートとァ セタゾールアミドの組み合わせでは、 p— -トロフエ-ルアセテートの基質としての反 応性が CAIと CAIIで 2倍以下の差しかなぐ p— -トロフエ-ルアセテートの反応性が CAIに特異的ではなく CAIと CAII両方に反応してしまうため、 CAIを特異的に測定 できないのに対し、 o— -トロフエ-ルアセテートとァセタゾールアミドの組み合わせで は、 o— -トロフエ-ルアセテートの基質としての反応性が CAIと CAIIで 2倍以上の 差があるため、 CAIを特異的に測定できることが明ら力となった。
[表 3]
Figure imgf000014_0001
[0052] 実施例 6
<試料 >
ヒト赤血球溶解液を試料として使用した。
<試薬 >
基質として o— -トロフエ-ルアセテートを用い、阻害剤としてァセタゾールアミドを 組み合わせて用いた。
<方法 >
(1)ヒト赤血球溶解液を精製水で 250倍に希釈し試料溶液とする。
(2) 30mMジメチルマロン酸緩衝液 (pH8)を用いて、 3mMァセタゾールアミド溶液 を用意した。ただし、ァセタゾールアミドはジメチルスルホキシド (DMSO)に溶解して 力ら添加し、 DMSO含量は 0. 15% (vZv)である。
(3)精製水を用いて、 9mMの o— -トロフエニルアセテート溶液を用意した。ただし、 基質はアセトンに溶解してから添カロし、アセトン含量は 2% (vZv)である。
(4) (1)、（2)及び（3)のそれぞれの溶液を 50 1ずつを混合し、室温で 5分間反応さ せ、 405nmの吸光度変化（ Δ A)を測定した。
ただし、（1)の対照溶液として精製水を、（2)の対照溶液として 0. 15% (v/v) DM SO含有 30mMジメチルマロン酸緩衝液を用い、上記と同様に反応させてそれぞれ の吸光度変化を測定し、ァセタゾールアミドによって阻害される酵素の特異的な吸光 度変化を下式によって算出し、 CAI特異的な吸光度変化とした。
[0053] ΔΑ1 : (1)溶液、（2)対照溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
ΔΑ2 : (1)溶液、（2)溶液及び（3)溶液使用時の吸光度変化 ΔΑ3 : (1)対照溶液、（2)対照溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化 ΔΑ4 : (1)対照溶液、（2)溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
[0054] <算出式>
CA特異的な吸光度変化 = [ Δ A1— Δ A3]— [ Δ A2— Δ A4]
[0055] <結果 >
結果を図 3に示す。なお、縦軸の CAI濃度は、 20 8 !111ヒトじ八1溶液を試料溶液 の代わりに用い、その結果を基にヒト赤血球溶解液中の CAI量を mgに換算し、さら にこれをヘモグロビン (Hb)量で除し、 mgZgHbとして示した。また、 CAIが赤血球 中の亜鉛の 8割以上と結合している亜鉛酵素であることから、横軸には原子吸光法に より求めた試料中の亜鉛濃度 (mgZDを示した。
[0056] この結果から明らかなように、 CAIIより CAIに反応性の高い基質と CAIと CAIIの両 方を阻害する CAの阻害剤を使えば、実施例 4と同様に CA特異的な測定が可能で あり、 CAI濃度と亜鉛濃度は良好な相関関係と y切片を示し (相関係数: 0. 9642、 y 切片：1. 6282)、本発明方法が臨床検体などの CA以外の加水分解酵素類が多量 に存在し、それらの酵素による添加した基質の分解が無視できない条件下でも適用 可能な実用的な CAIの特異的な測定法であることが確認された。
[0057] 実施例 7
<試薬 >
基質として CAIと CAIIの両方に反応する p— -トロフエ-ルアセテート（p— nitroph enyl acetate)を用い、 CAの阻害剤として CAIIより CAIを強く阻害するヨウ素ィォ ン (Γ)を糸且み合わせて用いた。
<方法 >
(1)精製水を用いて 25 μ gZmlヒト CAI溶液と 5 μ gZmlヒト CAII溶液を用意した。
(2) 30mMジメチルマロン酸緩衝液 (pH8)を用いて、 3mMヨウ化カリウム溶液を用 总した o
(3)精製水を用いて、 3mMの p— -トロフエニルアセテート溶液を用意した。ただし、 基質はアセトンに溶解してから添カロし、アセトン含量は 2% (vZv)である。
(4)酵素及び基質毎に（1)、 (2)及び（3)のそれぞれの溶液を 50 μ 1ずつを混合し、 室温で 5分間反応させ、 405nmの吸光度変化（ Δ A)を測定した。
ただし、（1)の対照溶液として精製水を、（2)の対照溶液として 30mMジメチルマロ ン酸緩衝液を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの吸光度変化を測定し、ヨウ 素イオンによって阻害される酵素の特異的な吸光度変化を下式によって算出し、 CA 特異的な吸光度変化とした。
[0058] ΔΑ1 : (1)溶液、（2)対照溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
ΔΑ2 : (1)溶液、（2)溶液及び（3)溶液使用時の吸光度変化
ΔΑ3 : (1)対照溶液、（2)対照溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化 ΔΑ4 : (1)対照溶液、（2)溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
[0059] <算出式>
CA特異的な吸光度変化 = [ Δ A1— Δ A3]— [ Δ A2— Δ A4]
[0060] <結果 >
測定の結果を表 4に示す。表 4から明らかなように、 CAIと CAIIの両方に反応する 基質 P— -トロフエ-ルアセテートでも、 CAの阻害剤として CAIIより CAIを強く阻害 するヨウ素イオンと組み合わせれば、 CAIを特異的に測定できることが明ら力となった
[0061] [表 4]
Figure imgf000016_0001
[0062] 実施例 8
<試料 >
ヒト赤血球溶解液を試料として使用した。
<試薬 >
基質として p— -トロフエ-ルアセテートを用い、 CAの阻害剤としてヨウ素イオンを 組み合わせて用いた。 <方法 >
(1)ヒト赤血球溶解液を精製水で 250倍に希釈し試料溶液とする。
(2) 30mMジメチルマロン酸緩衝液 (pH8)を用いて、 3mMヨウ化カリウム溶液を用 总した o
(3)精製水を用いて、 3mMの ρ—ニトロフエニルアセテート溶液を用意した。ただし、 基質はアセトンに溶解してから添カロし、アセトン含量は 2% (vZv)である。
(4) (1)、 （2)及び（3)のそれぞれの溶液を 50 1ずつを混合し、室温で 5分間反応さ せ、 405nmの吸光度変化（ Δ A)を測定した。
ただし、（1)の対照溶液として精製水を、（2)の対照溶液として 30mMジメチルマロ ン酸緩衝液を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの吸光度変化を測定し、ヨウ 素イオンによって阻害される酵素の特異的な吸光度変化を下式によって算出し、 CA I特異的な吸光度変化とした。
[0063] ΔΑ1 : (1)溶液、（2)対照溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
ΔΑ2 : (1)溶液、（2)溶液及び（3)溶液使用時の吸光度変化
ΔΑ3 : (1)対照溶液、（2)対照溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化 ΔΑ4 : (1)対照溶液、（2)溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
[0064] く算出式〉
CAI特異的な吸光度変化 = [ Δ A1— Δ A3]— [ Δ A2— Δ A4]
[0065] <結果 >
結果を図 4に示す。なお、縦軸の CAI濃度は、 20 8 !111ヒトじ八1溶液を試料溶液 の代わりに用い、その結果を基にヒト赤血球溶解液中の CAI量を mgに換算し、さら にこれをヘモグロビン (Hb)量で除し、 mgZgHbとして示した。また、横軸の亜鉛濃 度は、 CAIが赤血球中の亜鉛の 8割以上と結合している亜鉛酵素であることから、原 子吸光法により求めた試料中の亜鉛濃度 (mgZDを示した。
[0066] この結果から明らかなように、 CAIと CAIIの両方に反応する基質を使っても、 CAII より CAIを強く阻害する CAの阻害剤を使えば、実施例 6と同等の測定が可能となつ て、 CAI濃度と亜鉛濃度は良好な相関関係と y切片を示し (相関係数: 0. 9588、 y切 片：ー0. 1615)、本発明方法が臨床検体などの CA以外の加水分解酵素が多量に 存在し、その酵素による添加した基質の分解が無視できない条件下でも適用可能な 実用的な CAIの特異的な測定法であることが確認された。
[0067] 実施例 9
<試薬 >
基質として CAIIより CAIに反応性の高い o— -トロフエ-ルアセテート（o— nitroph enyl acetate)を用い、 CAの阻害剤として CAIIより CAIを強く阻害するヨウ素ィォ ン (Γ)を糸且み合わせて用いた。
<方法 >
(1)精製水を用いて 25 μ gZmlヒト CAI溶液と 5 μ gZmlヒト CAII溶液を用意した。
(2) 30mMジメチルマロン酸緩衝液 (pH8)を用いて、 300mMヨウ化カリウム溶液を 用总し 7 o
(3)精製水を用いて、 9mMの o— -トロフエニルアセテート溶液を用意した。ただし、 基質はアセトンに溶解してから添カロし、アセトン含量は 2% (vZv)である。
(4)酵素及び基質毎に（1) (2)及び（3)のそれぞれの溶液を 50 μ 1ずつを混合し、 室温で 5分間反応させ、 405nmの吸光度変化（ Δ A)を測定した。
ただし、（1)の対照溶液として精製水を、（2)の対照溶液として 30mMジメチルマロ ン酸緩衝液を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの吸光度変化を測定し、ヨウ 素イオンによって阻害される酵素の特異的な吸光度変化を下式によって算出し、 CA 特異的な吸光度変化とした。
[0068] ΔΑ1 : (1)溶液、（2)対照溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
ΔΑ2 : (1)溶液、（2)溶液及び（3)溶液使用時の吸光度変化
ΔΑ3 : (1)対照溶液、（2)対照溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化 ΔΑ4 : (1)対照溶液、（2)溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
[0069] く算出式〉
CA特異的な吸光度変化 = [ Δ A1— Δ A3]— [ Δ A2— Δ A4]
[0070] <結果 >
測定の結果を表 5に示す。表 5から明らかなように、 CAIIより CAIに反応性の高い 基質 o— -トロフエニルアセテートと、 CAの阻害剤として CAIIより CAIを強く阻害する ヨウ素イオンと組み合わせても、当然 CAIを特異的に測定できることが明ら力となった [表 5]
Figure imgf000019_0001
[0072] 実施例 10
<試料 >
ヒト赤血球溶解液を試料として使用した。
<試薬 >
基質として o— -トロフエ-ルアセテートを用い、 CAの阻害剤としてヨウ素イオンを 組み合わせて用いた。
<方法 >
(1)ヒト赤血球溶解液を精製水で 250倍に希釈し試料溶液とする。
(2) 30mMジメチルマロン酸緩衝液 (pH8)を用いて、 300mMヨウ化カリウム溶液を 用总し 7 o
(3)精製水を用いて、 9mMの o— -トロフエニルアセテート溶液を用意した。ただし、 基質はアセトンに溶解してから添カロし、アセトン含量は 2% (vZv)である。
(4) (1)、（2)及び（3)のそれぞれの溶液を 50 1ずつを混合し、室温で 5分間反応さ せ、 405nmの吸光度変化（ Δ A)を測定した。
ただし、（1)の対照溶液として精製水を、（2)の対照溶液として 30mMジメチルマロ ン酸緩衝液を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの吸光度変化を測定し、ヨウ 素イオンによって阻害される酵素の特異的な吸光度変化を下式によって算出し、 CA I特異的な吸光度変化とした。
[0073] ΔΑ1 : (1)溶液、（2)対照溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
ΔΑ2 : (1)溶液、（2)溶液及び（3)溶液使用時の吸光度変化 ΔΑ3 : (1)対照溶液、（2)対照溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化 ΔΑ4 : (1)対照溶液、（2)溶液及び (3)溶液使用時の吸光度変化
[0074] く算出式〉
CAI特異的な吸光度変化 = [ Δ A1— Δ A3]— [ Δ A2— Δ A4]
[0075] <結果 >
結果を図 5に示す。なお、縦軸の CAI濃度は、 20 8 !111ヒトじ八1溶液を試料溶液 の代わりに用い、その結果を基にヒト赤血球溶解液中の CAI量を mgに換算し、さら にこれをヘモグロビン (Hb)量で除し、 mgZgHbとして示した。また、横軸の亜鉛濃 度は、 CAIが赤血球中の亜鉛の 8割以上と結合している亜鉛酵素であることから、原 子吸光法により求めた試料中の亜鉛濃度 (mgZDを示した。
この結果から明らかなように、 CAIIより CAIに反応性の高い基質と CAIIより CAIを 強く阻害する CAの阻害剤を使えば、当然 CAI濃度と亜鉛濃度は良好な相関関係と y切片を示し (相関係数: 0. 9618、 y切片：1. 1661)、本発明方法が臨床検体など の CA以外の加水分解酵素類が多量に存在し、それらの酵素による添加した基質の 分解が無視できない条件下でも適用可能な実用的な CAIの特異的な測定法である ことが確認された。
図面の簡単な説明
[0076] [図 1]図 1は、実施例 2における測定結果を示したもので、横軸に比較対照の原子吸 光法による亜鉛濃度、縦軸に本法による CAI濃度をとり、 8検体の測定結果をプロット したものである。
[図 2]図 2は、実施例 4における測定結果を示したもので、横軸に比較対照の原子吸 光法による亜鉛濃度、縦軸に本法による CAI濃度をとり、 8検体の測定結果をプロット したものである。
[図 3]図 3は、実施例 6における測定結果を示したもので、横軸に比較対照の原子吸 光法による亜鉛濃度、縦軸に本法による CAI濃度をとり、 8検体の測定結果をプロット したものである。
[図 4]図 4は、実施例 8における測定結果を示したもので、横軸に比較対照の原子吸 光法による亜鉛濃度、縦軸に本法による CAI濃度をとり、 8検体の測定結果をプロット したものである。
[図 5]図 5は、実施例 10における測定結果を示したもので、横軸に比較対照の原子 吸光法による亜鉛濃度、縦軸に本法による CAI濃度をとり、 8検体の測定結果をプロ ットしたちのである。

Claims

請求の範囲
[1] 試料中のカルボニックアンヒドラーゼ I (CAI)の加水分解酵素活性を測定する方法で あって、測定に使用する基質又は基質と阻害剤の組合せとして、以下 (A)〜(E)の V、ずれかを用いることを特徴とする CAI活性の測定法。
(A)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
(B)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
阻害剤： CA以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤
(C)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
阻害剤： CAIと CAIIの両方を阻害する CAの阻害剤
(D)基 質: CAIと CAIIの両方に反応する基質
阻害剤： CAIIより CAIを強く阻害する CAの阻害剤
(E)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
阻害剤： CAIIより CAIを強く阻害する CAの阻害剤
[2] (A)又は (B)の組み合わせの基質又は基質と阻害剤を用い、試料中の加水分解酵 素活性を CAIの加水分解酵素活性とする、請求項 1記載の測定法。
[3] (B)の組み合わせの基質と阻害剤を用い、更に該阻害剤の阻害作用を増強する薬 剤を併用する、請求項 1又は 2記載の測定法。
[4] (C)、 (D)又 (E)の組み合わせの基質と阻害剤を用い、試料中の加水分解酵素活性 を阻害剤の存在下と非存在下の 2つの条件下で測定し、その差を CAIの加水分解 酵素活性とする、請求項 1記載の測定法。
[5] 加水分解酵素活性がエステラーゼ活性である、請求項 1〜4のいずれか 1項記載の 測定法。
[6] CAIIより CAIに反応性の高い基質力 。—二トロフエ-ルエステル類である、請求項
1〜4のいずれか 1項記載の測定法。
[7] CAIと CAIIの両方に反応する基質力 p— -トロフ -ルエステル類である、請求項
1又は 4記載の測定法。
[8] CAIと CAIIの両方を阻害する CAの阻害剤力 アミド類である、請求項 1又は 4記載 の測定法。
[9] CAIIより CAIを強く阻害する CAの阻害剤力 ァ-オン類である、請求項 1又は 4記 載の測定法。
[10] CA以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤が、プロテアーゼインヒビターカクテル、 4— (2—アミノエチル）ベンゼンスルフォ-ルフルオライド（AEBSF)、 a—フエ-ルメ タンスルホ-ルフルオライド（PMSF)及びぺプスタチンから選ばれる 1種又は 2種以 上である請求項 1〜3のいずれか 1項記載の方法。
[11] 阻害剤の阻害作用を増強する薬剤がアルデヒド類である、請求項 3記載の方法。
[12] 試料中の CAIの加水分解酵素活性を測定するためのキットであって、測定に使用す る基質又は基質と阻害剤の組合せとして、以下の (A)〜 (E)の 、ずれかを含有する ことを特徴とする CAI活性の測定用キット。
(A)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
(B)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
阻害剤： CA以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤
(C)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
阻害剤： CAIと CAIIの両方を阻害する CAの阻害剤
(D)基 質: CAIと CAIIの両方に反応する基質
阻害剤： CAIIより CAIを強く阻害する CAの阻害剤
(E)基 質: CAIIより CAIに反応性の高い基質
阻害剤： CAIIより CAIを強く阻害する CAの阻害剤
[13] (A)又は (B)の組み合わせの基質又は基質と阻害剤を用い、試料中の加水分解酵 素活性を CAIの加水分解酵素活性とする、請求項 12記載のキット。
[14] (B)の組み合わせの基質と阻害剤を用い、更に該阻害剤の阻害作用を増強する薬 剤を併用する、請求項 12又は 13記載のキット。
[15] (C)、（D)又 (E)の組み合わせの基質と阻害剤を用い、試料中の加水分解酵素活性 を阻害剤の存在下と非存在下の 2つの条件下で測定し、その差を CAIの加水分解 酵素活性とする、請求項 12記載のキット。
[16] 加水分解酵素活性がエステラーゼ活性である、請求項 12〜15いずれか 1項記載の やット。
[17] CAIIより CAIに反応性の高い基質力 0— -トロフ -ルエステル類である、請求項
12〜 15いずれ力 1項記載のキット。
[18] CAIと CAIIの両方に反応する基質力 p— -トロフエ-ルエステル類である、請求項
12又は 15記載のキット。
[19] CAIと CAIIの両方を阻害する CAの阻害剤力 アミド類である、請求項 12又は 15記 載のキット。
[20] CAIIより CAIを強く阻害する CAの阻害剤力 ァ-オン類である、請求項 12又は 15 記載のキット。
[21] CA以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤が、プロテアーゼインヒビターカクテル、 4— (2—アミノエチル）ベンゼンスルフォ-ルフルオライド（AEBSF)、 a—フエ-ルメ タンスルホ-ルフルオライド（PMSF)及びぺプスタチンから選ばれる 1種又は 2種以 上である、請求項 12〜 14いずれ力 1項記載のキット。
[22] 阻害剤の阻害作用を増強する薬剤がアルデヒド類である、請求項 14記載のキット。
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