CN102834721B - 用于测量钙离子的方法 - Google Patents

用于测量钙离子的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102834721B
CN102834721B CN201180016989.XA CN201180016989A CN102834721B CN 102834721 B CN102834721 B CN 102834721B CN 201180016989 A CN201180016989 A CN 201180016989A CN 102834721 B CN102834721 B CN 102834721B
Authority
CN
China
Prior art keywords
calcium
calcium ion
reagent
hydrogen
halogen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201180016989.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN102834721A (zh
Inventor
H-P.约瑟尔
H-J.基特齐亚
M.米克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN102834721A publication Critical patent/CN102834721A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102834721B publication Critical patent/CN102834721B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/26—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having more than one amino group bound to the carbon skeleton, e.g. lysine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/18—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)

Abstract

本发明涉及用于测定钙的试剂和使用所述试剂的测定方法。更具体地，本发明涉及用于测定钙的包含单硝基取代的BAPTA型螯合剂(BAPTA=1,2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,Nˊ,Nˊ-四乙酸)的试剂。本发明还描述了测定方法，这种方法允许精确测定在样品如血液样品(例如全血、血浆或血清)或任何其它含水液体样品(例如脑脊髓液、淋巴液、唾液或尿)中的钙，并因此对于临床诊断是特别有用的。

Description

用于测量钙离子的方法
技术领域
本发明涉及用于测定钙的试剂和使用所述试剂的测定方法。更具体地，本发明涉及用于测定钙的试剂，其包含单硝基取代的BAPTA型螯合剂(BAPTA＝1,2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸)的。本发明描述了以下测定方法，这种方法允许精确测定样品如血液样品(例如全血、血浆或血清)或任何其它含水液体样品(例如脑脊髓液、淋巴液、唾液或尿)中的钙，并因此对于临床诊断是特别有用的。
背景技术
血液或血清钙水平分别具有重要的诊断价值并可具有重要治疗意义。
钙离子的参考范围非常窄(2.20-2.55mmol/L)，在这些水平之上或之下的轻微偏离对数种生理障碍是具有诊断性的。与高钙血症(血清钙升高)相关的两种最常见的疾病是甲状旁腺功能亢进和恶性肿瘤，尤其是当恶性肿瘤已经转移至骨骼并导致骨吸收(即骨的局部破坏，伴有从转移病灶的位置释放钙)时。血清钙水平降低(低钙血症)一般与甲状旁腺功能减退相关。约1％的新生儿患有显著的低钙血症(血清钙<1.75mmol/L)，具有诸如易激惹(irritability)、颤搐和惊厥的症状，这种情况需要立即进行医疗干预。
如同钙一样，镁是在体内发现的一种重要元素。镁水平的缺损也导致临床症状，其中的一些与针对钙水平缺损所发现的临床症状非常相似。鉴于低血清钙和低血清镁具有几乎相同的临床症状，因此必须指出哪种元素导致所述临床症状。通常，有必要对血清钙和镁都进行测量以测定哪种元素或视情况而定是否两种元素都在正常范围之外，并且重要的是，镁不干扰钙的量化。
用于测量钙和镁的参考方法分别是原子吸收。对于常规测量，原子吸收有些不方便，需要昂贵的仪器和相当熟练的操作员来实施测定，以实现足够的精度和重现性。
某些酶的催化活性强烈依赖钙离子的存在，由此使得可以通过测量钙依赖性酶活性来量化钙。基于酶法测量钙离子的方法已经例如描述在US6,068,971中。
临床实验室日常工作中经常用于测量钙的现有方法是基于利用螯合的生色剂如邻甲酚酞络合酮(o-CPC)、偶氮胂III、偶氮膦或偶氮氯膦的方法。尽管这些方法的至少一种经常用在实验室的临床日常工作中，但是每种方法都有缺点。
o-CPC方法的敏感性非常依赖于pH。为得到最大敏感性，使反应在约10.7的pH进行。然而，在这些碱性pH值时，试剂容易吸收环境二氧化碳。吸收的二氧化碳与水组合形成的碳酸逐渐降低试剂pH并最终使试剂丧失钙测量功能。pH的逐渐改变也需要更频繁地进行校准，以确保准确的测量。此外，o-CPC是非常不具有选择性的，结合镁和其它金属如钆。为了消除在血清中常规水平的镁的干扰，添加8-羟基喹啉以螯合镁。
基于偶氮胂III的钙检测方法不具有在o-CPC法中固有的高pH和镁干扰(取决于测量pH)的问题。偶氮胂III在弱酸性条件下(例如pH5–6)结合钙，如果钙测量在小于7的pH进行，那么镁的结合可忽略。尽管偶氮胂III消除了o-CPC法的许多缺点，但是它的问题是相当低的敏感性和环境忧虑。每摩尔的偶氮胂III含有2摩尔的砷，由于担心供水被砷污染，因此偶氮胂III试剂的处置在许多国家是重要问题。
JP-A-04-120464披露，通过使用偶氮氯膦-III作为螯合剂和生色剂可将钙和镁同时量化。在偶氮氯膦-III的情况中，最适于其颜色改变的pH范围是弱酸性pH以及偶氮氯膦-III是不含砷的试剂。因此，偶氮氯膦-III就由相对于高pH和毒性导致的问题方面是有利的。然而，使用偶氮氯膦-III同时量化镁和钙引起问题。通常将这种螯合剂添加至样品以结合镁和钙，由此导致变色。然后添加EGTA以单独释放结合的钙，这种释放导致颜色变化。然后基于颜色变化来量化钙。偶氮氯膦-III也倾向于产生高空白值，该事实限制了可在其中进行钙离子测定的浓度范围。
已经描述了BAPTA型螯合钙的试剂并且其被用作缓冲体系用于例如控制细胞内钙离子的浓度。Pethig,R.etal.,(CellCalcium10(1989)491-498)已经测定了数种不同BAPTA型钙缓冲剂的缔合常数。他们建议在有关钙的生理工作中使用二溴-BAPTA。
如上所述，用于测量钙离子的各种测定方法是临床日常工作中已知的。可得到用于钙测定的基于使用螯合剂和生色剂的数种试剂，每种试剂都留有进一步改进的余地。
因此，仍需要定量地测量分析样品中的钙的试剂和方法。理想的方法应基于如下的螯合剂，其a)在贮存条件下和在分析仪的工作台上稳定，b)不含有毒性元素如砷，c)具有相对低的试剂空白吸收，d)不与镁离子或其它金属离子如钆结合，e)允许快速测定和高样品通量，和f)在宽测量范围内对钙离子进行精确测量。
意料不到地发现，BAPTA型螯合剂的单硝基衍生物表现出相当有利的性质，从而使它们非常适于测量钙离子。
发明内容
本发明提供在测量钙离子中非常有用的试剂，并且其有益方面包括极好的贮存稳定性，不存在砷的环境污染问题，不显示镁或钆的干扰和允许在宽浓度范围内快速和精确地测定钙，等等。
本发明涉及用于测定样品中的钙离子浓度的方法，所述方法包括以下步骤：使样品与包含单-硝基-BAPTA型螯合剂的溶液混合，由此使钙离子与单-硝基-BAPTA型螯合剂结合，从单-硝基-BAPTA型螯合剂释放钙离子，其中所述释放导致单-硝基-BAPTA型螯合剂的吸光度变化，测量吸光度变化并使用测量的吸光度变化来测定钙离子浓度。
本发明还披露了用于测定钙的稳定试剂组合物，其含有单-硝基-BAPTA型螯合剂以及pH为pH8.5-pH11.5。
本发明还涉及包含用于测量钙的试剂组合物的试剂盒，所述试剂组合物的pH为pH8.5-pH11.5并含有单-硝基-BAPTA型螯合剂。
具体实施方式
发明详述
在一个优选实施方案中，本发明涉及测定样品中的钙离子浓度的方法，所述方法包括以下步骤：使样品与包含单-硝基-BAPTA型螯合剂的溶液混合，由此使钙离子与单-硝基-BAPTA型螯合剂结合，从单-硝基-BAPTA型螯合剂释放钙离子，其中所述释放导致单-硝基-BAPTA型螯合剂的吸光度变化，测量吸光度变化并使用测量的吸光度变化来测定钙离子浓度。
本发明披露了测定样品中的钙离子浓度的方法，所述方法包括以下步骤：a)使样品与包含式I化合物的溶液混合，由此使钙离子与所述化合物结合，
式I为：
其中R1选自氢、卤素、羧基、烷基和甲酰基，R2独立选自氢、卤素、烷基、烷氧基、吗啉代、CN、羧基和甲酰基，R3独立选自氢、卤素、N-烷基硫酸酯基(N-alkylsulfate)、羧基、烷氧基、苯基、CN、CF3和叔丁基，R4独立选自氢、卤素或烷基，R5和R7独立地为氢或烷基，R6选自氢、烷基、烷氧基和卤素，或者其中R3和R4形成芳族桥以及X+为带正电荷的抗衡离子，b)从所述化合物释放钙离子，其中所述释放导致化合物吸光度变化，c)测量吸光度变化，和d)使用在(c)中测量的吸光度变化测定钙离子浓度。
作为R1、R2、R3、R4和/或R6的候选取代基所提及的卤素优选选自CI-、Br-和F-。
在一个优选实施方案中，取代基R1和/或R2和/或R3为羧基。
针对R1、R2、R4、R5、R6和/或R7提及的烷基优选为C1-C3-烷基。
针对R2、R3和/或R6提及的烷氧基优选为甲氧基或乙氧基。
在R3和R4之间的芳族桥优选为苯环系的一部分。
抗衡离子X+优选选自Na+、K+、Li+和Cs+。还优选的X+为K+或Na+。
在本申请中使用的每一个下列术语具有与其在该部分中的含义相关的含义。
本申请中使用的名词是指一个或多个((即至少一个))所述名词表达的含义。例如，"标记物(amarker)"是指一个标记物或多个标记物。术语"至少"用于表示可任选存在一个或多个其它对象。
表达方式"一个(种)或多个(种)"是指1-50，优选1–20，还优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15。
式I化合物能够结合钙离子。一旦结合或释放钙，其光谱特性就发生变化。这种光谱特性变化可容易地测量，并且与样品中存在的钙离子浓度直接相关。
已经发现，有利的是首先使待分析样品中存在的所有钙离子与式I化合物结合。由此得到稳定的基线。这种稳定的基线对于测量低浓度钙离子是特别有价值的。一旦钙离子从式I化合物中释放出来，就诱导其光谱特性产生可测量的变化，可利用所述变化精确测定样品中存在的钙离子浓度。
式I化合物可在宽pH范围内有效地结合钙离子。可从约pH5.0至约pH11.0观察到有效钙结合。在一个实施方案中，本发明的方法在以下条件下实施：包含式I化合物和样品的测定混合物中的pH为pH5.0-pH11.0。所述反应混合物含有至少一等分样品和式I化合物。在更优选的实施方案中，反应混合物的pH为从pH5.0或更高，从pH5.5或更高，从pH6.0或更高，从pH6.5或更高，至pH11或更低，至pH10或更低，至pH9.0或更低，至pH8.0或更低。
将式I化合物的最终浓度调节至足够高以可靠地测量样品中的钙离子。由于通过使用式I化合物测量钙离子所实现的高敏感性，可将临床样品如血清或血浆稀释例如约100倍，并仍然能可靠地测量。本领域技术人员清楚的是，式I化合物在测定混合物中的最终浓度必须与所述测定混合物中的最终钙离子浓度匹配。在一个优选实施方案中，披露的方法将使用如下最终浓度的式I化合物来实施：所述最终浓度是最终钙离子浓度的预期上限的至少1.5倍。
如上所述，应可靠地测量具有5mmol/L钙离子的样品，这是预期上限。在所述样品被以1:100稀释的情况中，测定混合物中的最终钙离子浓度将为0.05mmol/L。式I化合物的最终浓度应为该浓度的至少1.5倍，即0.075mmol/L。还优选的是，式I化合物在测定混合物中的最终浓度将为钙离子浓度的至少2倍，2.5倍，3倍和至多20倍，15倍或10倍，其是针对具有5mmol/L预期上限的样品所计算的。优选地，式I化合物在测定混合物中的最终浓度将为用样品的稀释因子乘以5mmol/L所得到的摩尔浓度的至少1.5倍，2倍，2.5倍，3倍和至多20倍，15倍或10倍。
已经发现，式I化合物溶液的长期稳定性在8.5或较高的pH得以最佳维持。优选的是使用不需要新鲜制备或频繁检查功能的包含式I化合物的试剂，因此在一个实施方案中，本发明权利要求的方法用包含式I化合物的pH为pH8.5-pH11.5的溶液实施。
在可选的优选实施方案中，本发明方法用包含式I化合物的pH为pH8.5-pH11.0或者为pH9.0-pH10.5的溶液实施。
在优选实施方案中，本发明方法用式I化合物实施，其中R1为氢或卤素。
在优选实施方案中，本发明方法用式I化合物实施，其中R2为氢、卤素、羧基、吗啉代或烷基。
在优选实施方案中，本发明方法用式I化合物实施，其中R3为氢、卤素、羧基或烷氧基。
在一个实施方案中，在本发明披露的方法中使用的式I化合物优选应以等于9.0或更低的结合常数logk结合钙离子。在另一方面，描述为logk的与钙离子的结合常数应为至少4.0或更高。优选地，以logk给出的针对钙离子的结合常数应为4.5-8.5，还优选的是，logk将为5.0-8.0。
根据在Harrison,S.M.和Bers,D.M.,BiochimicaetBiophysicaActa925(1987)133–143中描述的操作测量logk。简而言之，将结合钙的化合物在25mMHepes缓冲液中缓冲至pH7.0。温度恒定地保持在20℃。将各种钙离子浓度与恒定量的结合钙的化合物一起孵育。测定游离的钙离子和结合的钙离子的分数，并借助于Scatchard图计算亲和常数。
本领域技术人员将理解的是，取代基的各种组合是可能的。可选择和使用取代基来影响或调节式I化合物的结合常数。吸电子基团将导致结合常数降低，而供电子基团一般将导致较强的钙离子结合。
优选地，选择式I化合物的取代基以得到作为logk给出的以下结合常数：7.0或较小，还优选地，logk为4.0-7.0，为4.5-6.5，或者为5.0-6.0。
很可能将两种或更多种式I化合物组合以实施本发明方法。在一个优选实施方案中，使用单一一种式I化合物。
本发明的方法基于反滴定，即首先使钙离子与式I化合物结合，然后释放。从式I化合物释放钙离子最容易地是通过使用与式I化合物相比更强地结合钙离子的螯合剂实现的。在一个优选实施方案中，在本申请上面披露的方法的步骤b)中用于释放钙离子的螯合剂的结合常数比在钙检测方法中使用的式I化合物的结合常数高10倍。
尽管可将logk为5.0的结合钙的式I化合物与logk为6.0的螯合剂组合，但是优选使用logk为至少7.0或更高的螯合剂。本领域技术人员清楚的是，最佳地选择用于从式I化合物释放钙离子的试剂，使其具有的光谱特性不干扰所关注的那些，例如不干扰式I化合物的吸收或发射光谱。
优选地，在本申请披露的方法中用于从式I化合物释放钙的试剂/螯合剂选自二-、三-、四-乙酸衍生物、聚-膦酸或磷酸衍生物、4,4'-二氟-BAPTA、5,5'-二溴-BAPTA、5,5'-二氟-BAPTA、5-甲基-5'-甲酰基-BAPTA、5,5'-二甲基-BAPTA、(1,2-亚环己基二次氨基)四乙酸(CETA)、枸橼酸、次氨基三乙酸(NTA)、亚氨基二乙酸(IDA)、N-(2-羟基乙基)亚氨基二乙酸(HIDA)、N-(2-羟基乙基)乙二胺-N,N*,N*-三乙酸(＝HEDTA；CAS150-39-0,logk＝8.14)、CyDTA(＝CAS125572-95-4,logk＝12.50)、TTHA(＝CAS869-52-3,logk＝10.06)、Me-EDTA(＝1,2-丙二胺-N,N,N',N'-四乙酸,logk＝10.4)、BAPTA(＝CAS73630-08-7,logK6.97)、DTPA(＝二亚乙基三氨基五乙酸；CAS-Nr.:67-43-6,logk＝10.8)、EGTA(＝乙二醇-二(2-氨基乙基醚)-N,N,N,N-四乙酸；CAS-Nr.:67-42-5,logk＝10.9)、DTPMP(＝二亚乙基三氨基五(亚甲基膦酸)；CAS-Nr.:15827-60-8,logk＝10.7)和EDPMP(＝亚乙基二氨基四(亚甲基膦酸)；CAS-Nr.:1429-50-1,logk＝10.2)。
还优选地，实施本发明方法，使得钙离子的释放被EDTA、DTPA、EGTA、DTPMP和/或EDPMP触发。
对用于从式I化合物释放钙离子的螯合剂的选择并不是重要的，只要在添加所述螯合剂之后使与式I化合物结合的钙离子释放即可。螯合剂在最终反应混合物中的浓度优选与混合物中的式I化合物的浓度至少等摩尔，但是不高于其100倍。为了充分安全可靠，例如通过补偿移液中的小错误，可使用过量的螯合剂。在一个实施方案中，在实施本申请披露的方法时，最终反应混合物中的螯合剂的浓度高于式I化合物的最终浓度，例如为1.5倍至50倍，或者还优选为2倍至10倍。
在常规临床化学中用于测量钙离子的试剂在运输和长期贮存条件下应为稳定的。已经发现，式I化合物在酸性或中性pH时不如它在碱性缓冲液条件下那样稳定。包含式I化合物的试剂组合物应具有至少8.5的pH，或者pH应更高。在一个优选实施方案中，本发明披露了用于测量钙离子的试剂，其pH为pH8.5-pH11.5，并含有如权利要求1中定义的式I化合物。
在可选择的优选实施方案中，本发明的试剂的pH为pH8.5-pH11.0或者为pH9.0-pH10.5。
适合于缓冲pH为8.5和/或更高pH的溶液的缓冲体系是本领域技术人员公知的。优选地，这种缓冲体系将选自AMPD(＝2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)、CHES(＝2-(N-环己基氨基)-乙磺酸)、AMPSO(＝3-[二甲基(羟基甲基)-甲基氨基]-2-羟基丙磺酸)、CAPSO(＝3-环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸)、CAPS(＝3-环己基氨基)-2-丙磺酸)、甘氨酸缓冲体系或碳酸盐缓冲体系。还优选的是，本发明用于测量钙离子的试剂将包含选自CAPS或CAPSO的缓冲体系。
如上所述，循环中的钙浓度受到严格调节并且生理浓度通常为2.20-2.55mmol/L。循环中的高水平钙离子极少会超过4mmol/L。因此，适于测量循环中的钙离子的试剂通常被制造为覆盖最高5mmol/L的测量范围。用于测量钙的试剂应与生理学相关的浓度匹配。然而在尿中，钙浓度可在大范围内编号。这要求用于测量钙的测定也应覆盖大的测量范围。
在一个优选实施方案中，用于测量钙的试剂包含浓度为0.10mmol/L-50mmol/L的式I化合物。
本领域技术人员会理解的是，式I化合物在测定混合物(包含待测量的样品)中的最终浓度必须与样品中的钙离子浓度匹配。在一个实施方案中，式I化合物的浓度将为0.10mmol/L-2mmol/L。在可选择的实施方案中，式I化合物的浓度将为0.1、0.125、0.15或0.2至2.0、1.5或1mmol/L。可将这种试剂与待测量的样品混合，不经进一步稀释即使用。
在另一个实施方案中，提供用于测量钙的基于式I化合物的更浓的试剂。为了测量样品，可将这种更浓的试剂适当地稀释。本发明试剂的浓缩形式将包含范围为0.5-50mmol/L的式I化合物。在可选择的实施方案中，在用于检测钙离子的更浓试剂中的式I化合物的浓度将为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1mmol/L至50、40、30、20、15或10mmol/L。
在一个更优选的实施方案中，本发明中披露的用于测量钙的试剂包含式I化合物，其中R1为氢或卤素。
在一个更优选的实施方案中，本发明中披露的用于测量钙的试剂包含式I化合物，其中R2为氢、卤素、羧基、吗啉代或烷基。
在一个更优选的实施方案中，本发明中披露的用于测量钙的试剂包含式I化合物，其中式I的R3为氢、卤素、羧基或烷氧基。
已经发现，有利的是还将洗涤剂(detergent)添加至用于测量钙离子的试剂中，这可能是由于减少了干扰性非特异性结合，减少了泡沫和气泡，或由于其它正面影响。在一个更优选的实施方案中，本发明涉及用于测量钙离子的试剂，其pH为pH8.5-pH11.5，含有如权利要求1中定义的式I化合物和洗涤剂。
本申请使用的术语"洗涤剂"是指离子洗涤剂或非离子洗涤剂。洗涤剂的实例包括但不限于：十二烷基硫酸钠(SDS)、脂肪酸盐、家族、辛基糖苷、3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基-铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、十二烷基麦芽糖苷钠(DM)、月桂基二乙基胺氧化物(LDAO)、NP-40和家族、伯胺、胺乙酸盐和胺盐酸盐、季铵盐、三甲基乙基溴化铵、取代的二胺的酰胺、二乙醇氨基丙胺或二乙基氨基酰胺(diethylaminopropylamide)、环化的二亚乙基三胺的酰胺、烷基芳基磺酸盐、石油磺酸盐、磺化甘油酯、胆酰胺(cholamides)、磺基甜菜碱(sulfobetaines)、烷基糖苷、皂苷、烷基-聚乙二醇醚。
在一个实施方案中，所述洗涤剂为非离子洗涤剂。非离子洗涤剂的非限制性实例为ImbentinV413/91、Thesit、X-100、X-114、35、58、20、80、P-40、辛基β葡糖苷和MEGA8-辛酰基-N-甲基葡糖酰胺。在一个实施方案中，非离子洗涤剂选自35、X-100、20和P-40。
如上所述，钙离子浓度是临床常规诊断中的重要参数。用于测量钙的试剂优选以试剂盒(kit)的形式组装起来，所述试剂盒包含至少一种含有钙指示剂(如目前使用的化合物或本发明所述的式I化合物)的试剂。在一个更优选的实施方案中，本发明涉及用于测量钙的测试试剂盒，所述测试试剂盒含有包含式I化合物且pH为pH8.5-pH11.5的试剂。
在许多情况中，有利的是在经特制用于测量钙离子的试剂盒中包含至少两种试剂，第一试剂包含式I化合物且pH为pH8.5-pH11.5，以及第二试剂包含螯合剂。在一个更优选的实施方案中，本发明涉及试剂盒，其含有第一试剂(包含式I化合物且pH为pH8.5-pH11.5)和第二试剂(包含钙离子螯合剂)。任选地，所述试剂盒也可包含包装说明书和/或一种或多种另外的试剂。
提供下列实施例和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中阐述。应理解的是，可对所述操作进行改变，而不偏离本发明主旨。
附图说明
图1NM-BAPTA的合成在图1中示意性地示出。
图2根据在实施例2最后一栏中给出的操作，在RocheDiagnostics,Germany的ModularP分析仪上测量钙离子。在上部分(A)中，将理论值和实际测量值彼此相对地作图。在下部分(B)中，给出恢复百分数(％recovery)，即，将实际测量值作为预期(理论)值的百分数给出。
图3根据在实施例2中间栏中给出的操作，在RocheDiagnostics,Germany的cobasc501分析仪上测量钙离子。在上部分(A)中，将理论值和实际测量值彼此相对地作图。在下部分(B)中，给出恢复百分数，即，将实际测量值作为预期(理论)值的百分数给出。
图4根据在实施例2最后一栏中给出的操作，在RocheDiagnostics,Germany的ModularP分析仪上测量钙离子。将NM-BAPTA的浓度降低至标准浓度的90％。在上部分(A)中，将理论值和实际测量值彼此相对地作图。在下部分(B)中，给出恢复百分数，即，将实际测量值作为预期(理论)值的百分数给出。
图5根据在实施例2最后一栏中给出的操作，在RocheDiagnostics,Germany的ModularP分析仪上测量钙离子。将NM-BAPTA的浓度降低至标准浓度的80％。在上部分(A)中，将理论值和实际测量值彼此相对地作图。在下部分(B)中，给出恢复百分数，即，将实际测量值作为预期(理论)值的百分数给出。
图6NF-BAPTA的合成在图6中示意性地示出。
图7分别在钙离子存在和不存在的情况下，分别给出NM-BAPTA和NF-BAPTA的吸收光谱。四个谱图的索引在图的下面给出。
实施例1
NM-BAPTA的合成
NM-BAPTA的合成在图1中示意性地示出。
a)1-(2-氯-乙氧基)-2-硝基-苯
将2-硝基-苯酚(168.7g)和甲苯-4-磺酸2-氯乙基酯(100g)溶解在500mlDMF中，并在小心地添加199g碳酸钾后在110-120℃搅拌1小时。将反应混合物倒入剧烈搅拌的碎冰和水(8升)的混合物中。过滤出残留物，用水洗涤数次并干燥。
收率：100-120g
b)4-甲基-1-硝基-2-(2-(2-硝基-苯氧基)-乙氧基)-苯
将1-(2-氯-乙氧基)-2-硝基-苯(116g)和5-甲基-2-硝基-苯酚(88g)溶解在500mlDMF中，并在小心地添加160g碳酸钾后在90-110℃搅拌4小时。将反应混合物倒入剧烈搅拌的碎冰和水(8升)的混合物中。过滤出残留物，用水洗涤数次并干燥。将粗产物悬浮在甲醇中并将浅黄色残留物再次过滤，用甲醇洗涤并干燥。
收率：150-165g。
c)2-(2-(2-氨基-苯氧基)-乙氧基)-4-甲基-苯基胺
将100g4-甲基-1-硝基-2-(2-(2-硝基-苯氧基)-乙氧基)-苯和10g钯/碳悬浮在3.5升二噁烷中并在室温在5.5巴的氢气压下氢化。在用氮气吹洗三次后，在氮气气氛下过滤催化剂并蒸发剩余溶液和在真空下干燥产物。
收率：80g
d)((2-(2-(2-(二-甲氧基羰基甲基-氨基)-苯氧基)-乙氧基)-4-甲基-苯基)-甲氧基羰基甲基-氨基)-乙酸甲酯
将2-(2-(2-氨基-苯氧基)-乙氧基)-4-甲基-苯基胺(80g)溶解在2.5升DMF中并添加285ml溴-乙酸甲酯、429g碳酸钾和36.8g碘化钠。将反应混合物加热至80℃并保持2小时。在蒸发后，用己烷从产物中除去剩余的溴-乙酸甲酯。粗产物通过在甲醇中结晶进一步纯化。
收率：93g
e)((2-(2-(2-(二-甲氧基羰基甲基-氨基)-5-硝基-苯氧基)-乙氧基)-4-甲基-苯基)-甲氧基羰基甲基-氨基)-乙酸甲酯
将50g((2-(2-(2-(二-甲氧基羰基甲基-氨基)-苯氧基)-乙氧基)-4-甲基-苯基)-甲氧基羰基甲基-氨基)-乙酸甲酯溶解在600ml冰醋酸中。在剧烈搅拌下，添加91.5ml浓度为1M的硝酸/冰醋酸，并在第二步中添加28ml浓硫酸。温度升至30℃。将反应混合物直接倒入10升冰/水混合物中。过滤出残留物，用水洗涤数次并在真空下干燥。将粗产物通过柱色谱法在硅胶上进一步纯化(首先用己烷/乙酸乙酯(1:1)作为洗脱剂，然后用甲苯/乙腈(1:1)作为洗脱剂)。产物最后用丙-2-醇结晶。
收率：20g
f)NM-BAPTA；((2-(2-(2-(二-羧基甲基-氨基)-5-硝基-苯氧基l)-乙氧基)-4-甲基-苯基)-羧基甲基-氨基)-乙酸的钾盐
将9.5g((2-(2-(2-(二-甲氧基羰基甲基-氨基)-5-硝基-苯氧基)-乙氧基)-4-甲基-苯基)-甲氧基羰基甲基-氨基)-乙酸甲酯溶解在水/甲醇(各230ml)的混合物中并添加160ml浓度为1M的氢氧化钾溶液。将反应混合物回流1小时。在冷却至室温并添加250ml水后，将溶液的pH调节至pH3并蒸发甲醇。通过用乙酸乙酯进行溶剂萃取来分离产物。在蒸发后，在真空下干燥产物。
将(2-(2-(2-(二-羧基甲基-氨基)-5-硝基-苯氧基)-乙氧基)-4-甲基-苯基)-羧基甲基-氨基)-乙酸溶解在甲醇中并添加等摩尔的氢氧化钾/甲醇。在蒸发和干燥后，可分离适当的钾盐。
收率：9g
实施例2
用NM-BAPTA测量钙离子的一般操作
用单-硝基-BAPTA型式I化合物测量钙离子以反滴定法实施。
将一等分试样的关注样品与包含单-硝基-BAPTA型化合物的溶液混合并孵育。在RocheDiagnostics,Germany的自动分析仪上，将这种试剂称为R1。进行孵育直到获得稳定的基线信号。通常，稳定的基线信号在少于10分钟内得到，多数情况下在2–5分钟内得到。
然后分析样品和R1的混合物(任选经稀释，例如用蒸馏水稀释)，即测量在最适波长的吸光度值或测量了光谱。
然后通过添加释放剂如EDTA使与式I化合物结合的钙离子释放。在RocheDiagnostics,Germany的自动分析仪上将这种第二试剂称为R2。在需要的情况下，可用蒸馏水进一步稀释混合物。
然后分析样品、R1和R2的最终混合物(任选经稀释，例如用蒸馏水稀释)，即测量在最适波长的吸光度值或测量光谱。
吸光度的变化与关注样品中的钙离子浓度直接相关，并根据标准操作计算钙离子浓度。
在表1中，给出推荐用于在RocheDiagnostics,Germany的5个不同的自动分析仪上测量钙离子的应用的综述。对于ModularP和ModularD分析仪，所推荐的应用是相同的。
表1：
推荐的用于测量钙离子的移液体积(以μl计)
HiCoR1＝高浓度R1试剂；
LoCoR1＝低浓度R1试剂；
Integra、cobas、Roche/Hitachi902、ModularD和ModularP是RocheDiagnostics,Germany分销的分析仪系统。
表2：
HiCoR1、LoCoR1和R2各自的组成
实施例3
使用NM-BAPTA进行钙测量的线性
在本发明中披露的用于测量钙离子的方法具有技术优异性，例如它显示出非常高的精确度。如果将理论预期值与实际测量值相比较，这一点会变得例如显而易见。
在所述新方法中，将不同的钙离子浓度(→理论值)与实际测量值进行比较。
仅两个代表性实例作为图2和3给出，其值分别是在两个不同的分析仪即ModularP和cobasc501(均由RocheDiagnostics分销)上测量的。这两个图证实了所述测量的突出技术质量/精确度。从图2和3明显看出，所有实际测量值落在对应的预期理论值的95-105％之间，这反映出在所研究的整个浓度范围内相当准确的钙离子测量。
实施例4
测定NM-BAPTA的最小浓度
在循环中的钙离子浓度极少会超过4mmol/L。能够以可靠的方式测量最高5mmol/L钙的试剂应该最适于测定循环中的钙离子。
在ModularP仪器上以表1的最后一栏中描述的应用测量了各种钙离子浓度(在图4和5中的预期值)。然而，分别仅使用常规浓度90％或80％的NM-BAPTA。分别从图4和5可看出，与实施例2中给出的标准操作相比，即使在检测混合物中仅存在80％NM-BAPTA的情况下，最高5mmol/L的钙离子仍在95-105％之间恢复。从图5明显看出，如果NM-BAPTA的浓度降至80％，高于5mM的值倾向于以过低的值恢复。这意味着，为了测量一些病理样品中存在的高浓度的钙(在将这种样品如在上面实施例中所述以约1:70稀释的情况中)，NM-BAPTA的最终浓度应为约0.2mmol/L以确保准确地测量这些样品中的钙离子。
实施例5
NM-BAPTA的pH依赖性稳定性
在运输条件下以及在分析仪的工作台上，用于测量钙的试剂应尽可能地稳定。
为了研究它的稳定性，将NM-BAPTA在不同的pH值条件下贮存。使用短期应力模型(stressmodel)并将含NM-BAPTA的试剂在35℃贮存。在其它条件相同但使用"施加了应力的(stressed)"试剂测量钙离子的条件下，，使用相同样品的等分试样。在第0天(即开始对试剂施加温度应力(temperaturestress)的当天)，将对所述试剂施加应力后测量的值与用未施加应力的试剂测量的值进行比较。
使用的缓冲体系分别为100mmol/LHEPES(pH7.4)、50mmol/LTris(pH8.0)、50mmol/LNaHCO3(pH10.0)、50mmol/L甘氨酸(pH9.8)和40mmol/LCAPSO(pH10)。相应的数据总结在表3–7中。
表3：
NM-BAPTA在100mmol/LHEPES中(pH7.4)在35℃的稳定性
从表3明显看出，含NM-BAPTA的试剂在pH7.4不稳定。钙离子的恢复仅在80％范围内或更低。
表4：
NM-BAPTA在50mmol/LTRIS(pH8.0)中在35℃的稳定性
从表4明显看出，含NM-BAPTA的试剂已经具有临界，但是在pH8.0仍具有可接受的稳定性。钙离子的恢复主要在80％-90％的范围内。
表5：
NM-BAPTA在50mmol/LNaHCO3(pH10.0)中在35℃的稳定性
表6：
NM-BAPTA在50mmol/L甘氨酸(pH9.8)中在35℃的稳定性
表7：
NM-BAPTA在40mmol/LCAPSO(pH10.0)中在35℃的稳定性
从表5–-7明显看出，在本申请中披露的试剂在约10的pH具有优异的稳定性。在将所述试剂在35℃施加应力一周之后，钙离子的恢复优异，大体上在90％-110％的希望范围内，甚至大多数为95％-105％。无论是否使用缓冲系统都可实现这种高稳定性。
实施例6
在使用NM-BAPTA进行钙测量的过程中未受镁干扰
向包含生理浓度为2.53mmol/L的钙离子的样品中加入0-15mmol/L镁离子。将加料样品在Roche/Hitachi917分析仪上以在实施例2中对ModularP给出的应用进行测量。三次测定的中值结果在下表8中给出。
表8：
镁离子对钙离子测量无影响
从表8中给出的恢复值明显看出，在上面的实验中，镁离子不干扰钙离子的测量。
实施例7
在使用NM-BAPTA进行钙测量的过程中不受钆干扰
向包含生理浓度为约2.35mmol/L的钙离子的一个样品以及具有约3.40mmol/L的高水平钙离子的一个样品中添加不同水平的(C1：14μL+986μL(14μLad986μL),C2：2.8μL+997μL)。为常用的含钆对比剂。将加料样品在Hitachi917分析仪上以在实施例2中对ModularP给出的应用进行测量。三次测定的中值结果在下表9中给出。
表9：
钆离子对钙离子测量无影响
从表9中给出的恢复值明显看出，在上面的实验中，钆离子不干扰钙离子的测量，因为所有测量值都正好位于95-105％的恢复范围内。
实施例8
NF-BAPTA的合成
NF-BAPTA的合成在图6中示意性地示出。
a)1-(2-氯-乙氧基)-2-硝基-苯
参见实施例1
b)4-氟-1-硝基-2-(2-(2-硝基-苯氧基)-乙氧基)-苯
将1-(2-氯-乙氧基)-2-硝基-苯(10g)和5-氟-2-硝基-苯酚(7.86g)溶解在50mlDMF中，并在小心地添加13.82g碳酸钾后在90-110℃搅拌19小时。将反应混合物倒入剧烈搅拌的碎冰和水(500ml)的混合物中。过滤出残留物，用水洗涤数次并干燥。将粗产物悬浮在甲醇中并再次过滤出浅黄色残留物，用甲醇洗涤并干燥。
收率：9.5g。
c)2-(2-(2-氨基-苯氧基)-乙氧基)-4-氟-苯基胺
将9.48g4-氟-1-硝基-2-(2-(2-硝基-苯氧基)-乙氧基)-苯和1.5g钯/碳悬浮在500ml二噁烷和60ml冰醋酸中并在室温氢化。在用氮气吹洗三次后，在氮气气氛中过滤催化剂并蒸发剩余溶液和在真空下干燥产物。
收率：7.52g
d)((2-(2-(2-(二-甲氧基羰基甲基-氨基)-苯氧基)-乙氧基)-4-氟-苯基)-甲氧基羰基甲基-氨基)-乙酸甲酯
将2-(2-(2-氨基-苯氧基)-乙氧基)-4-氟-苯基胺(7.52g)溶解在250mlDMF中并添加38.4ml溴-乙酸甲酯、56g碳酸钾和2.13g碘化钠。将反应混合物加热至80℃并保持21小时。在蒸发后，用己烷从产物除去剩余的溴-乙酸甲酯。粗产物通过在甲醇中结晶进一步纯化。
收率：4.14g
e)((2-(2-(2-(二-甲氧基羰基甲基-氨基)-5-硝基-苯氧基)-乙氧基)-4-氟-苯基)-甲氧基羰基甲基-氨基)-乙酸甲酯
将2.5g((2-(2-(2-(二-甲氧基羰基甲基-氨基)-苯氧基)-乙氧基)-4-氟-苯基)-甲氧基羰基甲基-氨基)-乙酸甲酯溶解在30ml冰醋酸中。在剧烈搅拌下，添加4.54ml浓度为1M的硝酸/冰醋酸，并在第二步中添加11.35ml浓硫酸。温度升至30℃。将反应混合物直接倒入250ml冰/水混合物中。过滤出残留物，用水洗涤数次并在真空下干燥。粗产物通过柱色谱法在硅胶上进一步纯化(首先用己烷/乙酸乙酯(1:1)作为洗脱剂，然后用甲苯/乙腈(1:1)作为洗脱剂)。收率：0.82g
f)NM-BAPTA；((2-(2-(2-(二-羧基甲基-氨基)-5-硝基-苯氧基)-乙氧基)-4-氟-苯基)-羧基甲基-氨基)-乙酸的钾盐
将0.82g((2-(2-(2-(二-甲氧基羰基甲基-氨基)-5-硝基-苯氧基)-乙氧基)-4-氟-苯基)-甲氧基羰基甲基-氨基)-乙酸甲酯溶解在水/甲醇(各20ml)的混合物中，并添加13.77ml浓度为1M的氢氧化钾溶液。将反应混合物回流1小时。在冷却至室温并添加250ml水后，将溶液的pH调节至pH3并蒸发甲醇。通过用乙酸乙酯溶剂萃取来分离产物。在蒸发后，在真空下干燥产物。
将((2-(2-(2-(二-羧基甲基-氨基)-5-硝基-苯氧基l)-乙氧基)-4-氟-苯基)-羧基甲基-氨基)-乙酸溶解在甲醇中并添加等摩尔的氢氧化钾/甲醇。在蒸发并干燥后，可分离适合的钾盐。
收率：0.75g
实施例9
钙离子与NF-BAPTA结合
使用Uvikon930光度计分析在钙离子存在和不存在的情况下NF-BAPTA的吸收特征。分别在不存在或存在0.09mmol/LCa2+的情况下，在50mmol/LCAPSO(在pH7)、0.9％NaCl和0.01％Brij-35中，分别用0.15mmol/LNM-BAPTA或NF-BAPTA得到吸收光谱。
如图7中所示，NM-BAPTA或NF-BAPTA各自的吸收光谱非常相似，从而表明这两种化合物即一般的式I化合物可用于测量钙离子。

Claims (15)

1.式I的化合物在制备用于测定样品中的钙离子浓度的试剂中的用途，其中：
a)将所述样品与包含式I化合物的溶液混合，由此使钙离子与所述化合物结合，
式I为：
其中R1选自氢、卤素、羧基、烷基和甲酰基，R2独立选自氢、卤素、烷基、烷氧基、吗啉代、CN、羧基和甲酰基，R3独立选自氢、卤素、N-烷基硫酸酯基、羧基、烷氧基、苯基、CN、CF3和叔丁基，R4独立选自氢、卤素或烷基，R5和R7独立地为氢或烷基，R6选自氢、烷基、烷氧基和卤素，或者其中R3和R4形成芳族桥以及X+为带正电荷的抗衡离子，
b)将钙离子从所述化合物中释放出来，其中所述释放导致所述化合物的吸光度发生变化，
c)测量所述吸光度变化，
d)使用在(c)中测量的吸光度变化来测定所述钙离子浓度；
其中所述式I的化合物的结合常数logk等于或小于7.0。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述包含式I化合物的溶液的pH范围为pH8.5至pH11.5。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述包含式I化合物的溶液的pH范围为pH9.0至pH10.5。
4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中式I的R1为氢或卤素。
5.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中式I的R2为氢、卤素或烷基。
6.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中式I的R3为氢、卤素、羧基或烷氧基。
7.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中在所述权利要求1的步骤(b)中的钙离子释放由在20℃钙离子结合常数logk等于或大于7.0的钙螯合剂触发。
8.如权利要求7所述的用途，其中在所述权利要求1的步骤(b)中的钙离子释放由EDTA、DTPA、EGTA、DTPMP和/或EDPMP触发。
9.用于测量钙的pH范围为pH8.5至pH11.5的试剂，其含有如权利要求1中所定义的式I化合物，其中所述式I的化合物的结合常数logk等于或小于7.0。
10.如权利要求9所述的试剂，其包含浓度为0.10mM至50mM的式I化合物。
11.如权利要求9所述的试剂，其包含缓冲体系，其中所述缓冲体系选自2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇、2-(N-环己基氨基)-乙磺酸、3-[二甲基(羟基甲基)-甲基氨基]-2-羟基丙烷-磺酸、(3-环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸、(3-环己基氨基)-2-丙磺酸、甘氨酸缓冲体系或碳酸盐缓冲体系。
12.如权利要求9至11中任一项所述的试剂，其中式I的R1为氢或卤素。
13.如权利要求9至11中任一项所述的试剂，其中式I的R2为氢、卤素或烷基。
14.如权利要求9至11中任一项所述的试剂，其中式I的R3为氢、卤素、羧基或烷氧基。
15.用于测量钙的测试试剂盒，所述测试试剂盒包含如权利要求9至14中任一项所述的试剂。
CN201180016989.XA 2010-03-30 2011-03-28 用于测量钙离子的方法 Active CN102834721B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10003408.1 2010-03-30
EP10003408 2010-03-30
PCT/EP2011/054713 WO2011120913A1 (en) 2010-03-30 2011-03-28 Method for measurement of calcium ions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102834721A CN102834721A (zh) 2012-12-19
CN102834721B true CN102834721B (zh) 2016-01-20

Family

ID=42261895

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180016989.XA Active CN102834721B (zh) 2010-03-30 2011-03-28 用于测量钙离子的方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US8962338B2 (zh)
EP (1) EP2553469B1 (zh)
JP (1) JP5631480B2 (zh)
KR (1) KR101495970B1 (zh)
CN (1) CN102834721B (zh)
AU (1) AU2011234646B2 (zh)
BR (1) BR112012020015B1 (zh)
CA (1) CA2794386C (zh)
ES (1) ES2532991T3 (zh)
HK (1) HK1175241A1 (zh)
MX (1) MX2012010759A (zh)
SG (1) SG183826A1 (zh)
WO (1) WO2011120913A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101877003B1 (ko) * 2016-10-28 2018-07-12 (주)바이오액츠 마그네슘 이온 검출용 bapta 유도체 및 이의 용도
US11867703B2 (en) 2020-09-23 2024-01-09 Chundo Pharm Co., Ltd Method of producing test strips for colorimetric determination of calcium level in biological fluid using ca-OCPC complex
KR102363408B1 (ko) 2020-09-23 2022-02-15 주식회사 청도제약 Ca-OCPC 복합체를 이용한 체액 칼슘 비색 검출용 검사지의 제조방법
CN112724030B (zh) * 2020-12-24 2022-09-06 福建福缘生物科技有限公司 一种用于测量钙离子的试剂盒及其使用方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0594047A1 (en) * 1992-10-22 1994-04-27 Bayer Corporation Arylazo chromoionophores
CN1605333A (zh) * 2003-10-10 2005-04-13 合肥恒星药物研究所 Bapta衍生物在制备临床药物中的应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4753890A (en) * 1986-04-29 1988-06-28 Eastman Kodak Company Analytical element and method for determination of magnesium ions
DE3881931D1 (de) 1987-04-10 1993-07-29 Univ Southern Australia Bestimmung von kaliumionen in fluessigkeiten.
US4795712A (en) * 1987-04-10 1989-01-03 Eastman Kodak Company Calcium complexing dyes and their use in analytical compositions, elements and methods
DE69032422T2 (de) * 1989-12-15 1999-02-04 Hoffmann La Roche Reagenzzusammensetzung, Verfahren und Kits zur Quantifizierung von Magnesium oder Calcium und Magnesium
JPH11194A (ja) * 1997-06-13 1999-01-06 Oriental Yeast Co Ltd 測定用試薬及び測定方法
JP2002098681A (ja) 2000-09-25 2002-04-05 Kanagawa Acad Of Sci & Technol 金属イオン測定用試薬
JP2005298444A (ja) 2004-04-15 2005-10-27 Fuji Photo Film Co Ltd 新規なアミノピラゾール化合物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0594047A1 (en) * 1992-10-22 1994-04-27 Bayer Corporation Arylazo chromoionophores
CN1605333A (zh) * 2003-10-10 2005-04-13 合肥恒星药物研究所 Bapta衍生物在制备临床药物中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A rapid micro-method for determining serum calcium;ISOBEL M. BETT 等;《CLINICA CHIMICA ACTA》;19591231;第4卷;第346-350、353页 *
Decarboxylation is a significant reaction pathway for photolabile calcium chelators and related compounds;Andreas Barth 等;《Photochemical & Photobiological Science》;20051201;第5卷;第107-112、114页 *
Ligand binding and thermodynamic stability of a multidomain protein, calmodulin;LAURA MASINO 等;《Protein Science》;20001231;第9卷;第1523、1525、1527页 *
On the dissociation constants of BAPTA-type calcium buffers;R. PETHIG 等;《Cell Calcium》;19891231;第10卷;第491、492、495、496页 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20120135291A (ko) 2012-12-12
AU2011234646A1 (en) 2012-08-23
EP2553469A1 (en) 2013-02-06
KR101495970B1 (ko) 2015-02-25
HK1175241A1 (zh) 2013-06-28
WO2011120913A1 (en) 2011-10-06
SG183826A1 (en) 2012-10-30
AU2011234646B2 (en) 2013-12-05
BR112012020015A2 (pt) 2016-05-03
CA2794386A1 (en) 2011-10-06
CA2794386C (en) 2015-09-01
US20130023055A1 (en) 2013-01-24
ES2532991T3 (es) 2015-04-06
MX2012010759A (es) 2012-10-09
BR112012020015B1 (pt) 2021-05-25
US8962338B2 (en) 2015-02-24
JP2013524187A (ja) 2013-06-17
EP2553469B1 (en) 2015-01-14
CN102834721A (zh) 2012-12-19
JP5631480B2 (ja) 2014-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bretonniere et al. Design, synthesis and evaluation of ratiometric probes for hydrogencarbonate based on europium emission
Timms et al. Difference gel electrophoresis
CN102834721B (zh) 用于测量钙离子的方法
US10921327B2 (en) Probes for quantitative imaging of thiols in various environments
CN103012199B (zh) 快速高选择性硫化氢比色探针的制备方法
CA1290749C (en) Compounds, reagents and procedures for determining cations
CN106220640A (zh) 一类汞离子荧光探针及其制备方法和应用
US11993810B2 (en) Chromogenic peroxidase substrates
CA2869125C (en) Lithium reagent composition and method and device for determining lithium ion amount using same
CA2083313C (en) Colorimetric methods and reagents for the assay of calcium in a test sample
CN105418559B (zh) 高灵敏性检测肼的试剂盒及其应用
CN105445241B (zh) 高选择性检测肼浓度的方法
CN105418500A (zh) 高选择性肼比率荧光探针及其制备方法
CN105418560A (zh) 长波长肼比色荧光探针及其制备方法
CN112724030B (zh) 一种用于测量钙离子的试剂盒及其使用方法
JP2002156371A (ja) アミノメタンスルホン酸化合物のサンプルに含まれるホルムアルデヒドの定量方法
JP6008395B2 (ja) リチウム試薬組成物、リチウム試薬キット、及びリチウムイオン測定方法。
Uziel et al. Direct labeling of DNA-adducts formed from carcinogenic diol-epoxides with a fluorescent reporter compound specific for the cis vic-diol group
JP2012037472A (ja) 抗甲状腺ホルモン抗体の測定方法
Liew et al. Supplementary Information Assessment of the blood-brain barrier of potential neuroprotective aurones in PAMPA and porcine brain endothelial cell models
HU229524B1 (hu) Nátriumionokra és adott esetben káliumionokra is érzékeny fluoreszcens festékek, eljárás előállításukra és alkalmazásuk

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1175241

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1175241

Country of ref document: HK