KR920009425B1 - 유체중 이온의 측정 - Google Patents

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더 플린더스 유니버시티 오브 사우쓰 오스트레일리아
하워드 존 부칸
뵈링거 만하임 게엠베하
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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
유체중 이온의 측정
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 생물학적 및 비생물학적 유체중에서, 이하에서 검체라고도 불리는, 이온을 측정하기 위한 약제 및 방법에 관한 것이다.
본 발명은 민감한 효소의 활성을 자극하거나 또는 억제하기 위한 여러 검체의 능력에 근거하고 있다. 이 검체는 양이온 또는 음이온, 금속성 또는 비금속성, 단순물 또는 혼합물일 수 있다. 실제로 적절한 분석지시효소의 감도범위 밖의 농도로, 또는 효소가 또한 그에 대해 민감한 다른 이온의 존재에 의해 방해가 유발되는 농도로 검체가 시료중에 존재한다는 것이 종종 발견된다. 본 발명은 이들 문제를 여러 가지로 해결하기 위한 것이다.
임상 생화학에 있어서 혈청전해질의 측정은 병원에서 수행되는 가장 통상적인 분석시험이다. 이런 측정들은 일상적인 조사 뿐만 아니라 분석속도가 필수적으로 요구되는 생명이 위급한 상황 및 비상시에도 자주 요청된다. 병원에서 주요 지연원인중의 하나는 병실에서 진단실험실 표본을 운반하는 것이기 때문에, 침대-근처에서 용이하게 수행되는 방법이 위급한 상황시에 특히 가치를 발휘하게 될 것이다.
임상 생화학 실시에서 칼륨과 나트륨을 분석하는 통상적인 방법은 염광 광도법 (flame photometry)이다.이 방법은, 원자가 열에 의해 여기되었을 때 흥분되어 바닥상태로 돌아올 때에는 특색파장의 광을 방출한다는 원리에 따르는 것이다. 원자에 의해 유발되는 방사에너지의 특성파장의 세기는 불꽃중에서 흥분된 원자의 수에 비례하는데, 이는 시료중의 관심물질의 농도에 비례한다. 여기에서 요구되는 장치는 복잡하며 상대적으로 값이 비싸고 연소성 기체를 사용하여야 한다.
특히 나트륨, 칼륨 및 염화물에 대한 다른 방법은 이온-선택성 전극을 사용하는 것이다. 이상적으로 각전극은, 전극이 단지 하나의 이온에 대해서만 반응하는 독특한 이온-선택성을 가지게 된다. 실제로 이것은 가능하지 못하며, 모든 이온-선택성 전극에 방해하는 이온이 존재한다. 더우기, 이온-특유전극은 일반적으로 보정은 가능하지만 절대적으로 특유한 것은 아니다. 전극은 특유 이온의 존재시에 생긴 전위차를 측정한다. 이 기구는 상대적으로 값이 비싸다. 이 방법은 분광적으로 수행될 수 없을 뿐만 아니라 그럼으로써 이온측정을 위한 임상적 필요성은, 일차적으로 분광적 검정을 위해 고안된 상업적으로 입수가능한 임상분석기의 복잡성을 실제로 증가시키게 된다. 두가지 방법의 성공적인 수행에는 상당한 정도의 기술과 지식이 요구된다.
유사하게, 전기량법(coulometric method)에 의한 염화물의 일반적인 측정은 특별한 기계사용을 필요로 한다. 이 적정 과정의 종말점은 불용성 염화은 생성물 형성의 전기흐름증가의 완료에 의해서 탐지된다. 그렇지 않다면, 전위차 측정을 사용할 수 있는데 이것도 매우 시간을 필요로 하며 부가적인 기계사용을 요구한다.
더우기 염화물의 경우에, 예를 들면 다음과 같은 광도측정 및 적정 방법이 있다 :
-디페닐카바존 착물을 통한 유리 Hg2+이온의 적정측정
-HgCl2의 침전 다음 수은 착물의 분해시에 형성된, 철의 로단화 착물의 비색측정(Skeggs, Clin.Chem. 10, 1964, 918f.; Schmidt Zentralbatt Pharm. 124(9), 1985, 527f).
-각각의 수은염으로부터 클로랄산(Chloranilic acid)의 비색측정(Renschler).
-무색의 수은염으로부터 디에틸-디티오카밤산의 착색된 Cu2+착물의 측정(독일공개공보 2137146).
-수은착물의 분해시에 착색된 금속착물의 형성에 유사하게 근거한 보다 통상적인 TRTZ-방법
(tripyridile-s-triazine) (R. Fried, Zeitschr. Klin.Chem., Klin, Bioch. 19, 1972, 280f ; DOS 2153387).
이들 방법의 주요결점은 독성이 강한 물질을 함유하는 용액을 사용해야 한다는 것이다. 몇몇 방법은 복잡하며 조정커브(calibraition curve)는 직선이 아니며(예를 들면 로단화물 방법), 더우기 이들 방법중 몇몇은 시료의 단백질 함유에 위해 유발되는 방해를 제거하기 위해 사전처리를 필요로 한다.
개선된 TPTZ-방법이 Wo. 83/002670에 개시되어 있지만, 독성의 수은 화합물을 사용해야 하는 단점은 여전히 가지고 있다. 수은 이온을 사용하지 않는 비색방법은 과염소산용액중에서 Fe(Ⅲ)의 헥사클로로 착물을 측정하는 것이다(F. Hoppe., Ther. Ggw, 110(4), 1971, 554f.; H. Mahner, Zeitschre. Klin. Biochem. 11(11), 1973.; W. T. Law, Clin. Chen. 26(13) 1980, 1874f.; US-4278440). 이 방법에 대한 강한 제한은 부식성의 강한 산성약제를 사용하는 것이며 그러므로 기계적인 피펫계와 함께 사용될 수 없다는 것이다. 또다른 단점은 시료중에 있는 빌리루빈에 의한 방해이다.
칼슘은 임상실험실에서 통상적으로 측정되는 전해질의 또다른 예이다. 채액중에서의 이 금속이온의 농도는 좁은 범위내에서 조절된다. 병적으로 높거나 낮은 농도는 신장부전, 췌장염, 테타니 및 울형성심장마비와 같은 생명을 위협하는 질환을 유발할 수 있다.
칼슘을 측정하기 위한 최초의 방법중 하나는 Tisdall에 의해 설명된 것(J. Biol. Chem. 63, 461-465, 1925)으로 여기에서 칼슘은 옥살산에 의해 침전되고 그 다음에 비색측정에 의해 평가된다. 이 방법은 원심 분리단계를 포함하며 그러므로 매우 시간이 소비된다; 이것은 칼슘에 대해서 특유한 것이 아니며 시료의 조작에 주의가 요망되기 때문이다. 이 방법은 적정 및 직접적인 비색방법으로 여러 실험실에서 사용되고 있으나 전자는 복잡하고 귀찮은 과정을 포함하는 단점을 가지며 많은 부피의 시료를 필요로 한다. 후자의 방법에서 칼슘은, 예를 들면 광도측정계에서 측정될 수 있는 오르토크레졸프텔레인 콜플렉슨(orthoresolphthalein complexone)과 같은 염료의 색깔에 영향을 끼친다. 이 방법의 단순함은 임상실험에서의 자동화를 제공해 준다. 하지만 이 방법도, 강한 알칼리용액 및 독성물질을 사용하는 것을 포함하고 있다. 특히 이것은 지질, 단백질, 인산염 및 빌리루빈과 같은 다수의 혈청 성분에 의해 방해를 받는 경향이 있으며 그 결과 원자흡수 및 염광광도 측정의 표준방법과 잘 맞지 않는다. 비색방법의 또다른 단점은 보정커브가 직선이 아니며 색깔이 온도에 의해 상당히 좌우된다는 것이다.
(W. H. Outlaw and O. H. Lowry, Analytical Biochemistry 92, 370-374 (1979)에는 조직중에서 칼륨이온을 측정하기 위한 효소-조정분석방법이 설명되어 있다. 이 방법은 토끼근육으로부터 나오는 피루베이트 키나제(pyruvate kinase)를 사용하여, 이것은 칼륨이온 및 나트륨 이온에 의해 활성화되는데, 전자가 약 5배 정도 더 영향력이 강하다. 이 비-특이성 때문에 이 방법은 칼륨이온이 우세한 양이온인 식물질에는 적절할 수 있지만, 30배 초과되는 나트륨이온을 포함하는 혈청과 같은 체액에서의 측정에 부적합하다. 그러므로 나트륨이온은 플라즈마 또는 혈청중의 칼륨을 측정하기 위해 Lowry등에 설명된 효소적 광도측정기법을 사용할 때 수용하지 못할 방해를 유발한다. 또다른 문제는 암모늄이온이 칼륨이온에 유사한 활성을 제공한다는 것이다. 상기한 출판물의 방법은 혈청과 같은 생체액중에 있는 칼륨이온의 분석과 관련된 이들의 중요한 문제를 해결해 주지도 못하며, 나트륨이온을 측정하기 위한 어떤 방법도 제시하지 못하고 있다.
그러므로 본 발명의 목적은 상기 문제점을 해결할 수 있는 방법과 시약을 제공하는 것이다. 본 발명은 이 문제들을 효소활성에 대한 이온의 영향을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법에 의해 유체중의 이온(검체)를 측정함으로써 해결한다.
본 발명의 주요한 일면은, 특히, 체액의 희석이 불가능할 때 분석효소에 대한 최적범위내에서 검체의 자유농도를 유발하는 선택성 결합제를 사용하는 것이다. 본 발명의 부가적인 요소는 검체에 대한 효소의 감도를 감소시키기 위하여 해당분석효소에 대해 경쟁적인 억제제를 사용하는 것인데, 이에 의해 더 높은 농도에서 검체의 측정이 가능해 진다. 이는 특히 예를 들어 선택성 결합제가 용이하게 입수될 수 없거나 또는 비쌀 경우 특히 유용하다.
본 발명의 또다른 일면은 방해가 무시될 정도의 수준으로 방해이온의 자유농도를 감소시키기 위하여 선택성 결합제를 사용한다는 것이다. 또 억제제는 검체보다 더욱 효과적으로 방해이온과 경쟁하며, 이에 의해 방해이온과 비교하여 검체에 대한 효소의 감도를 증가시키기 위해 사용된다.
중요한 것은 검체의 효소의 활성에 대한 작용이 방해이온과 그것보다 더 크도록 적당한 이소엔자임(isoenzyme)의 선택을 포함하며, 적당한 반응조건을 선택하는 것이다. 더우기, 분석효소의 활성에 대한 검체 및 방해이온의 작용은 합으로 나타나므로 만약 방해이온의 농도가 알려진다면, 검체의 농도가 용이하게 구별에 의해 측정될 수 있다. 방해이온의 방해가 분석중인 체액에서 상대적으로 일정한 농도에서 일어나는 경우에, 적당한 농도의 방해이온을 표준(보정)용액에 포함시킬 수 있다. 이런 검체를 분석하기 위한 또다른 방법은 검체가 결합제로부터 다른 이온을 교체시키게 되고, 결합제로부터 분리된 이 이탈된 이온의 적당한 효소의 활성에 대한 효과를 측정하는 간접적인 분석방법을 사용하는 것이다.
이들 일반원칙은 플라즈마 또는 혈청중의 칼륨, 나트륨, 칼슘, 염소 및 중탄산 이온을 측정하는데에 이들을 적용하는 방법을 나타냄으로써 상세히 매우 잘 예시될 수 있다. 하지만, 이들은 넓은 이온영역, 예를 들면 마그네슘, 리튬, 납 아연, 구리, 철 또는 기타 중금속과 같은 양이온에 적용될 수 있다. 측정될 수 있는 비-금속이온의 예는 수소이온 또는 암모늄이다. 암모늄을 발생시키는 우레아와 같은 물질도 또한 측정될 수 있다.
적합한 효소
사용될 수 있는 적합한 효소는 예컨대 다음과 같다(H. J. Evans등, Ann. Rev. Plant Physiol. 17, 47, 1986) :
인을 함유하는 그룹을 전이하는 트랜스퍼라아제와 같은 트랜스퍼라아제(Transferase). 이런 트랜스퍼라아제는 피루베이트 키나아제일 수 있다. 피루베이트 키나아제 대신에 마그네슘이온 또는 망간이온에 민감한 아데닐레이트 키나아제(adenylate kinase) 또는 헥소키나아제(hexokinase)와 같은 다른 키나아제가 사용될 수 있다. 다른 트랜스퍼라아제는 아세테이트 키니아제(acetate kinase)(E. coli로부터)이다. 다른 예는 아연이온에 민감한 뇌에서 유발되는 피리독살 키나아제(pyridoxal kinase)이다.
글리코시다아제(glycosidase)와 같은 하이드롤라아제(Hydrolases). 예를 들면 α- 또는 β-D-갈락토시다아제(E. coli로부터), 카복시펩티다아제 A(소 췌장으로부터), 콜라게나아제(클로스트리듐 히스톨리쿰으로부터), 아밀라이제(타액 또는 췌장으로부터) 또는 포스포글리콜레이트 포스파타아제.
또한 시스테인 또는 티올 의존성 프로테인아제와 같은 펩타이드 하이드록라이제로서, 이들의 특이 예는(J. Biol. Chem. 259, 12488-12494,(1984))에서 Sasaki등에 의해 설명된 칼파인(Calpain) Ⅰ 및 Ⅱ(또는 한 칼슘 활성화된 중성 프로테아제라고 불림)이다. (J. Biochem. 95, 1759-1766(1984))에 A. Kitahara등의 방법에 따라 분리 및 정제될 수 있다. 또다른 예는 디펩티딜 아미노펩티다아제 Ⅰ(E. C. 3.4.14.1, 카텝신 C),(J. Ken Mc Donald, Bioch. Biophys. Res. Communication 24(5), 66, 771f). 또다른 효소원으로 유전자 재조합 기법에 의해 얻어지는 단백질이 있다.
글리세롤 디하이드로게나아제(효모로부터) 또는 티로시나아제(카테콜 옥시다아제)와 같은 옥시도리덕타아제(Oxidoreductase)
알돌라아제(효모로부터) 또는 카본산 안하이드라아제(소의 적혈구부터)와 같은 리아제(Lyase).
다른 적절한 효소는 친할로겐 미생물에서 나온 여러 효소이다. 다른 효소원으로는 유전자 재조합 기법에 의해 얻어지는 단백질이 있다.
선택성 결합제 : 여러 가지 결합제들이 검체 또는 방해이온의 결합을 위해 유용하다. 이런 결합 또는 차폐물질은 크립탄드(cryptand), 코로난드(coronand), 크라운 에테르(crown ehter) 포단드(podand), 스페란드(spherand), 헤미스페란드(hemisperand), 칼릭사렌(calixaren) 및 이들의 조합물, 천연에 존재하는 이오노포어(inophor), 예를 들면 항생제, 발리노마이신(valinomycin)과 같은 시클릭 펩타이드, 컴플렉슨(complaxone) 및 킬레이팅제, 예를 들면 이미노디아세트산, EDTA, 니트로트리아세트산 및 이들의 유도체이다. 이런 화합물들은 (Konkakte(Merck), 1977, No.1, p. 11 ff) and p. 29 ff; Knotakte(Merck), 1977, No. 2, p. 16 ff; ); (Konakte(Merck), 1977, No. 3, p. 36 ff); (Phase Ttansper Catalysts, Properties and Applications(Merck-Schucgardt) 1987, Thermodynamic and Kinetic Data for Cation-Macrocycle Interaction); (R. M. Izatt등, Chemical Reviews 85, 271-339(1985)); (Data for Biochemical Research, 1986, R. M. C. Dawson 등, Eds., 제3판, 399-415(Clarendon Press)옥스퍼드); (F.
Figure kpo00001
등, Chem. Macrocycles, Springer Verlag, Springer Verlag뉴욕, 1982); (M. Hiraoka, Ed., Crown Compoumds, Elsevier, Amsterdam, 옥스퍼드, 뉴욕, 1982); (J. M. Lehn등, J. Am. Chem. Soc. 97, 6700-6707(1975); (G. Schwarzenbach등, Helv. Chim. Acta 28, 828(1945); (S. F. A. Kettle, Koordinationsverbindungen, Taschentext 3, Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr. 1972); (A. E. Martell등, Die Chemie der Metallchelatverbindungen, Verlag Chemie, Weinheim/Bergstr. 1958); (M. Becke-Geohring 등, Komplexchemic, Springer Verlag, 1970); (F. Kober, Grundlagen der Komplexchemie, Otto Salle Verlag, Frankfurt/Main 1979); (G. Schwarzenbach등, Helv. Chem. Acta 31, 1029(1948)); (R. G. Perason등 Science 151,172(1966))에 기술되어 있다.
다가 이온, 특히 이가 양이온을 결합할 수 있는 킬레이트제의 예는 에틸렌글리콜-버스-(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA로 불림) 및 (에틸렌디니트릴로)테트라아세트산(EDTA)이다.
예컨대 EDTA 및 dl들의 유도체와 같은 다가이온을 결합할 수 있는 결합제는 많이 존재하는 반면에, 일가이온을 결합할 수 있는 시약은 덜 일반적이다. 테트라페닐보론은 칼륨이온을 결합한다. 하지만 더 광범위한 가능성을 가지는 한 그룹의 화합물은 크립탄드로서 이것은 수용액중에서 일가 양이온을 선택적으로 결합할 수 있는 시약의 예이다(R. M. Izatt등 Chem Reviews 85, 271-339). 크립탄드에 대한 특별한 예는 Merck-Schuchardt의 Krypofix
Figure kpo00002
화합물이다. 예컨대 : 4,7,13,16,21-펜타옥시-1,10-디아자비시클로(8.8.5)-트리코산, Kryptofix
Figure kpo00003
221, 페이지 438, Merck-Schuchardt 카탈로그, 1987/88, 번호 810646(K 221). 4,7,13,16,21,24-헥사옥사-1,10-디아자비시클로(8.8.8)헥사코산, KrypofixR222, 페이지 438, Merck-Schuchardt카탈로그, 1987/1988, 번호 810647(K 222)가 있다.
방해하는 음이온을 제거하기 위한 차폐화합물로서 다음과 같은 부류의 물질들이 사용될 수 있다; 음이온크립탄드, 헤테로시클로판(heterocyclophanse), 카타피난드(catapinandnds) 및 무기금속착물 또는 불용성염. 이온 착물형성 화합물의 특별한 예는 문헌에 설명되어 있는데, 예를 들면 아자모노- 또는 아자폴리사이클, 마크로시클릭 4차 테크라헤드론 화합물, 마크로시클릭 비스-금속-착물, 공유결합된 루이스산 센터를 가지는 마크로사이클, 양성화- 또는 알킬화된 4차 크립탄드 또는 카다피난드(F. P. Schemidtchen, Nackrichten chemm. Techn. Iab. 36(1), 1988, S. 8f ; E. Graf, J. Amer. Chem. Soc. 98(20), 1976, 6403f ; C. H. Park, J. Amer. Chem. Soc. 90(9),1968,2431f) 및 예컨대 헥사클로로 착물 또는 질산은이다.
결합제의 기능 : 이들 결합제는 다음과 같은 목적을 위해 사용된다 :
1. 방해이온의 선택적 결합
2. 시료의 희석이 불가능할 때 검체의 농도를 최적의 측정수준으로 감소시키는 것
3. 본 발명의 구현예로, 결합제가 ＂지시＂이온과 착물을 형성하며, 이 착물로부터 지시이온은 검체이온에 의해 정량적으로 교체되고, 효소의 활성에 대한 교체지시이온의 작용을 분석하여, 이에 의해 검체이온의 농도를 간접 측정하는 방법이 있다. 예컨대 이런 방법에서 효소는 피루베이트 키나아제이고, 지시이온은 칼륨이고, 결합제는 Kryptofix
Figure kpo00004
221이며 측정될 이온은 나트륨이거나; 또는 효소는 키나아제이고, 지시이온은 Mg2+이고, 결합제는 킬레이트제, 예컨대 EDTA이며, 이온은 금속이거나; 또는 효소는 피리독살 키나아제이고, 지시이온은 Zn2+이고, 결합체는 kryptofix
Figure kpo00005
221이며, 이온을 중금속이거나; 또는 효소는 α-아밀라아제이고, 결합체는 Ag 또는 Hg이며 측정될 이온은 염소이거나; 또는 효서는 콜라게나아제이고, 결합제는 EDTA와 같은 킬레이트제이며 측정될 이온은 칼슘이다.
분석용 유체 : 검체의 측정을 실행하는 생물유체는 혈액, 혈청, 플라즈마, 땀, 추출물 또는 뇨이다. 다른 유체의 수돗물 또는 음식물의 추출물 또는 과일 또는 포도주와 같은 발효액이다.
칼륨 및 나트륨이온의 측정에 대한 일반원칙의 적용
칼륨이온에 대한 피루베이트 키나아제의 감도에 근거하여, 혈청 또는 플라즈마에 있는 칼륨이온의 측정을 위한 만족스런 방법에 대한 필수요건은 나트륨 또는 암모늄이온에 의해 유발되는 방해를 극복하는 것이다.
본 발명에서 구현된 일반원칙에 따라 이는 하나이상의 다음 과정에 의해서 성취될 수 있다.
1. 적절한 결합제, 예를 들면 Kryptofix
Figure kpo00006
221로 나트륨이온을 선택적으로 결합함.
2. 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus sterarothermophilus) 효소가 근육효소 보다 두배나 큰 나트륨 이온에 비해 칼륨이온에 대한 선택성을 가지기 때문에 토끼근육 보다 이 미생물효소를 피루베이트 키나아제로서 선택하는 것.
3. 분석에서 선택적 지시효소의 경쟁적 억제제인 이온의 선택, 예를 들면 나트륨이온 및 칼륨이온과 경쟁시키기 위해 리튬이온을 사용하는 것.
4. 암모늄이온의 효소적 제거
리튬이온은 칼륨이온에 대해 경쟁제로서 덜 효과적이기 때문에, 전체적인 효과는 나트륨이온과 비교하여 50% 더 칼륨이온에 대한 피루베이트 키나아제의 상대적인 선택성을 증가시키는 것이다. 더우기, 리튬이온의 존재하에서 피루베이트 키나아제의 활성에 대한 칼륨 및 나트륨이온의 효과는 상호-작용적이라기 보다는 합산되어 나타난다. 이것은, 만약 다른 한 이온의 농도가 알려져 있다면 칼륨이나 또는 나트륨이온의 측정이 가능하다는 것이다.
결합제가 없는 상태에서 과정 2와 3을 사용함으로써 칼륨이온 대 나트륨이온에 대한 피루베이트 키나아제의 상대적인 선택성을 100 : 1로 얻는 것이 가능하다. 이것은 110 대 170밀리몰/ℓ의 상당히 비정상적인 나트륨이온 농도에서 조차, 측정된 칼륨이온 농도에서의 오차는 140밀리몰/ℓ(실시예 A)의 정상적인 플라즈마 나트륨이온 농도에 대해서 0.3밀리몰/ℓ를 초과하지 않을 것이라는 것을 의미하는 것이다. 이는 대부분의 임상목적을 위하여 충분히 정확한 것으로 간주되지는 않는다. 하지만, 플라즈마의 나트륨이온의 진정한 농도가 알려져 있다면, 칼륨이온의 측정오차를 + 0.05밀리몰/ℓ로 낮추어 정확히 측정하는 것이 가능하다(실시예 B). 만약 과정 1-3이 합쳐지고 결합제, 예를 들면 Kryptofix
Figure kpo00007
221이 포함된다면, 나트륨이온과 비교하여 칼륨이온에 대한 피루베이트 키나아제의 상대적인 감도는 ＞500 : 1로 증가될 수 있다. 이러한 상황하에서 플라즈마 칼륨이온 농도를 0.05밀리몰/ℓ이하까지(실시예 C) 측정하기 위하여 나트륨이온 농도를 아는 것은 불필요한 것이다.
칼륨이온 측정을 위한 이들 방법은 방해를 감소시키는 것과 관련한 본 발명에서 구현된 일반원칙을 적용하는 것이 가능하다는 것을 보여주는 것이다. 다른 한편으로 혈청 또는 혈장에서의 나트륨이온의 측정은 효과적인 검체 농도를 규정하는데 이들 원칙을 적용하는 것을 잘 예시하고 있다. 본 발명에서 구현된 바와 같은 나트륨이온 측정의 한가지 수단은 나트륨이온에 대해 활성이 높은 효소를 사용하는 것이다. 이런 효소의 예는 β-갈락토시다아제이다(Kuby등, J. Am. Chem. Soc. 75, 890, 1953). 하지만, 이 효소가 가장 감도가 높은 나트륨이온 농도의 범위는 희석단계없이 혈장시료에서 용이하게 얻어질 수 있는 것 보다 훨씬 낮다.
시료의 희석이 가능하지 않을 경우에 효과적인 나트륨이온 농도를 최적 수준으로 낮추기 위해 본 발명에서 구현된 원칙들을 지키는데에는 다음 과정들이 사용된다 :
1. Kryptofix
Figure kpo00008
221과 같은 나트륨이온 결합제의 사용.
2.β-갈락토시다아제의 경쟁적 억제제로서 리튬이온을 사용하여, 나트륨 이온에 대한 효소의 감도를 감소시킴.
과정 1과 2를 조합하면, β-갈락토시다아제를 사용하여 혈장 또는 혈청중의 나트륨이온의 측정을 용이하게 해주며, 결합재의 양은 110밀리몰/ℓ이하의 나트륨이온 농도에 감응을 최소화하는 반면 통상의 분석범위(110-170밀리몰/ℓ의 감응을 향상시키기 위해 조절될 수 있다(실시예 D)
칼륨이온에 의한 효소활성의 자극이 감소되고, 칼륨이온-결합제, 예컨대 Kryptofix
Figure kpo00009
222가 반응혼합물에 포함된다면, 피루베이트 키나아제에 의해 나트륨이온도 측정될 수 있다(실시예 E).
혈장 나트륨이온 농도를 측정하는 다른 방법으로는, 나트륨이온이 Kryptofix
Figure kpo00010
221에서 나오는 칼륨이온을 교체하여 방출된 칼륨이온이 혈청나트륨 이온 농도에 비례하여 피루베이트 키나아제의 활성을 자극하는 방법도 있다(실시예 F).
본 발명의 다른 구현은 생물학적 및 비-생물학적 체액중의 이온측정을 위한 조성물 및 시약이다.
본 발명에 의한 시약은 용해 또는 건조형일 수 있다. 이것은 적당한 담체상에 주입될 수도 있다. 시험편형의 진단용약제는, 아세톤과 같은 휘발성 용매중의 시험편의 생산에 편리하게 사용되는 필요한 시약 용액으로 담체물질, 바람직하게는 여과지, 셀룰로오스 또는 합성섬유 양모에 주입시킴으로써 생산될 수 있다. 이것은 한번 이상의 주입단계로 제조될 수 있다. 완성된 시험종이는 그 자체로서 또는 알려진 방법으로 처리되어 바람직하게 합성수지와 미세한 메쉬 사이에 봉인되어 사용될 수 있다.
이하에서 본 발명의 실시예를 보다 상세히 설명하겠다. 그러나 설명된 세부항목의 하나 또는 조합에 본 발명이 국한되지는 않는다는 것을 알 수 있을 것이며, 특히, 이 실시예에서 설명된 것들 외에 기계적인 또는 화학적인 변형이 있을 수 있다.
[칼륨이온의 분석방법에 대한 상세한 설명]
이 부분은 본 발명에서 설명된 원리들을 구현하여 칼륨이온측정이 대한 더욱 상세한 발명을 설명하는 것이다. 칼륨이온을 측정하기 위하여, 체액, 예를 들면 혈장을, 아데노신 디포스페이트(ADP), 포스포에톨피루베이트(PEP), 감소된 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드(NADH), 피루베이트 키나아제(PK)및 락테이트 디하이드로 게나아제(LDH)를 포함하는 완충된 혼합물에서 배양한다. PK 및 LDH에 의해 촉매화된 반응중에, 이 혼합물에서의 피루베이트, 그 다음에 락테이트의 형성은 전적으로 적당한 양이온의 존재에 의해 좌우되는데, 이것이 없는 상태에서 PK는 실제로 불활성이다. NADH는 340nm에서 강하게 흡수하지만, NAD는 그러하지 아니한다.
미생물 PK에 필요한 망간이온을 포함하는 분석을 위해 선택된 조건하에서, NADH 산화물은 칼륨이온의 농도에 비례한다(실시예 A-C)참조.
이들 조건하에서 다음 반응이 발생한다 :
Figure kpo00011
반응(1)의 반응율은 계에 존재하는 칼륨이온의 농도에 의해서 결정되며, 이것은 거꾸로 반응(2)의 반응율을 제한한다. 이들 반응율을 측정할 수 있는 몇가지 방법이 있다. 일반적인 방법은 반응(2)에서, NADH의 소실율을 분광 광도적으로 측정하는 것이다. NADH는 340nm에서 강하게 흡수하는 반면에, NAD는 그러하지 아니하다. 따라서, 340nm에서 (또는 대체파장에서) 반응 혼합물의 흡수가 강하하는 것은 반응율을 직접 측정하는 것이 되며 이로부터 혼합물중에 존재하는 칼륨이온의 농도가 유추될 수 있다. 그렇지 않으며, 반응(1)과 (2)과 H+를 소비하여, 반응혼합물의 양성자 농도를 감소시킨다는 사실을 이용할 수 있다. 양성자 농도의 강하율을 pH미터, 또는 적정방법에 의해 측정될 수 있다. 후자의 경우에 있어서 사용되는 완충액의 농도는 분광광도기법에서 보다 훨씬 적을 것이다. 피루베이트 키나아제의 활성을 조정하기 위하여 형광미터 또는 발광미터와 같은 다른 장비가 사용될 수 있다.
PK활성과 관련된 피루베이트의 축적을 찾아내는 많은 다른 방법이 있다. 여기에는 소비된 산소 또는 무기인산염 또는 과산화수소; 피루베이트 옥시다아제의 효소적 작용에 의해 발생된 이산화탄소 또는 아세틸포스페이트; 2,4-디니트로페닐 히드라진과 함께 히드라존의 형성; 피루베이트 디카복실라제 또는 피루베이트 디하이드로 게나아제; 피루베이트 카복실라아제의 효소적작용의 반응물 또는 생성물의 측정; 플라빈결합된 계의 사용; 그리고 기질의 미소농도를 측정하기 위한 동위원소방법(M. N. Berry 등, Analytical Biochem. 118, 334-352(1981))이 있다.
200개의 혈청시료를 조사함에 있어서 염광광도 측정 또는 이온-선택성 전극측정과 같은 다른 방법과의 우수한 일치가 얻어졌다. 이 방법에 있어서의 중요한 방해는 혈청에 일반적으로 존재하는 암모늄이온이다. 암모늄이온 방해의 가능성은 반응혼합물에 α-케토글루타레이트(KG) 및 글루타메이트 디하이드로게나아제(GDh)를 포함시킴으로써 완전히 피할 수 있다. 암모늄 이온은 다음 반응에 따라 사전배양에서 제거된다 :
Figure kpo00012
뇨와 같은 암모늄이온 함량이 높을 수 있는 용액에서는 결합된 반응이 사용될 수 있다 :
Figure kpo00013
이 결합된 방법은 글루코스 - 6 - 포스페이트 디하이드로 게나아제를 사용한다. 가해진 글루코스 - 6 - P 및 - KG가 존재하는 어떤 암모늄이온보다 초과된다면, 시약에 NADH를 보존하는 중에 모든 암모늄이온이 제거될 것이다.
10uℓ의 혈장 또는 혈청을 사용하여 37℃에서 칼륨이온을 효소적으로 측정하기 위한 주요시약의 전형적인 농도범위는 다음과 같다 :
Figure kpo00014
칼륨이온에 대해 감도가 높은 다른 예로는 글리세롤디하이드로 게나아제가 있다(E.C.C.Lin등, B 235, 1820, 1960). 글리세롤 디하이드로 게나아제를 사용하여 37℃에서 칼륨이온의 효소적 측정을 위한 주요시약의 농도 범위는 다음과 같다 :
Figure kpo00015
칼륨이온에 대해 감도가 높은 또다른 예로는 아세트알데히드 디하이드로게나아제가 있다(S.Black, Arch.Biochem.Biophys.34,86.1951). 아세트알데히드 디하이드로게나아제를 사용하여 37℃에서 칼륨이온의 효소적 측정을 위한 주요시약의 전형적인 농도범위는 다음과 같다.
Figure kpo00016
아세트알데히드(0.02밀리몰/ℓ 내지 1 밀리몰/ℓ)는 글리콜알데히드로 치환될 수 있다.
아세트알데히드 디하이드로게나아제는 또한 에스터라아제 활성을 나타내므로 칼륨이온농노는 4-니트로페닐아세테이트로부터 4-니트로페놀의 이탈을 조사함으로써 측정될 수 있다. 아세트알데히드 디하이드로게나아제의 에스터라아제 활성에 근거하여 37℃에서 칼륨이온의 효소적 측정을 위한 주요시약의 전형적인 농도범위는 다음과 같다 :
Figure kpo00017
[나트륨이온 측정]
원칙적으로 PK를 사용하여 나트륨이온을 측정하는 것은 칼륨이온의 측정방법과 유사하다. 하지만, 일정한 주요 차이가 존재한다. 첫째로 PK는 상기한 배양조건에 좌우되어 나트륨이온에 대한 것보다 약 40-100배 더 칼륨이온에 대해 강도가 높다. 나트륨이온이 혈장에 칼륨이온의 농도보다 약 30배 존재하기 때문에, 후자는 나트륨이온측정을 방해할 수 있다.
본 발명의 일반적인 원리에 따라서, 리튬이온을 생략하며, 토끼 근육의 PK는 미생물효소보다 선호되며, 마그네슘이온은 망간으로 대체될 수 있다. 칼륨이온을 Kryptofix
Figure kpo00018
222에 특정으로 결합시켜 PK활성에 대한 나트륨이온의 효과를 직접 측정하는 한 방법이 있다(실시예 E).
피루베이트 키나아제를 사용하여 37℃에서 나트륨이온의 효소적 측정을 위한 조요시약의 전형적인 농도범위는 다음과 같다 :
Figure kpo00019
나트륨이온이 Krptofix
Figure kpo00020
221로부터 칼륨이온은 치환하여, 방출된 칼륨이온은 PK의 활성에 나트륨이온농도에 좌우되어 그 농도까지 작용하는 것을 이용하는 다른 방법도 있다(실시예 F).
Kryptofix
Figure kpo00021
221로부터의 칼륨이온의 대체를 측정하기 위하여 피루베이트 키나아제를 사용하여 37˚C에서 나트륨이온의 효소적 측정을 위한 주요시약의 전형적인 농도범위는 다음과 같다 :
Figure kpo00022
더 정확하고 정밀한 측정구현에서는 β-갈락토시다아제와 같은 나트륨이온 의존성효소를 사용한다(실시예 D).
2-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드(NPG) 및 β-D- 갈락토시다아제를 포함하는 완충된 혼합물과 함께 혈장을 배양시킨다. β-D- 갈락토시다아제에 의해 촉매화되는 반응은 나트륨이온의 존재에 좌우되며 활성율은 나트륨이온농도의 측정치가 된다. 이 방법의 요체는 나트륨이온농도가 100 밀리몰/ℓ를 초과할 수 있는 경우에, 통상적인 분석범위(110-170 밀리몰/ℓ)에서 작은 나트륨이온농도의 변화에 대해 효소가 가장 민감하도록 나트륨이온농도가 감소시키기 위해. 혈청 또는 다른 생물학적 유체에서의 측정을 위한 적량의 나트륨이온-선택성결합제(예컨대 Kryptofix
Figure kpo00023
221)를 사용하는 것이다. 적당히 높은 농도의 마그네슘 및 리튬이온의 존재를 포함하는 분석을 위해 선정된 조건하에서, 2-니트로페놀 및 갈락토오스의 형성율은 실제로 측정되는 나트륨이온의 농도에 비례한다. 마그네슘 이온의 최적의 β-갈락토시다아제활성을 위해 필요하다. 리튬이온은 나트륨이온과 경쟁적이며 따라서 나트륨이온에 대한 효소의 Km을 상승시킨다.
β-D-갈락토시다아제에 대한 기질로서 많은 다른 화합물들이 적합하다. 일반적으로, 갈락토시다아제를 포함하는 시료를 적당한 β-D-갈락토시다아제 기질과 혼합하면, 기질은 효소에 의해 쪼개지며, 그 다음에 하나의 분열생성물은 적당한 방법으로 검출된다. 효소의 작용에 의해 분리된 클리콘 또는 아글리콘(aglycone)이 측정될 수 있다. 대체로, 후자를 측정한다. 기질로서, 천연적인 기질락토오스가 사용될 수 있지만, 색원체 갈락토시드를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 따라서 [Biochem. Z., 333, 209(1960)]에는, 페닐-β-D-갈락토시다아제 뿐만 아니라 방향족 고리에서 치환된 몇몇 유도체, 예를 들면 2-니트로페닐-β-D-갈락토시다아제(NPG) 및 3-니트로페닐 -β-D-갈락토시드가 β-D-갈락토시다아제의 기질로서 기술되어 있다. 가수분해에 의해 유리된 페놀은 UV범위에서, 또는 니트로페놀의 경우에는, 단파장의 가시파장 범위에서 광도측정적으로 측정된다. 아미노안티피린과의 산화적 커플링 또한 지시반응으로써 쓸 수 있다(Analytical Biochem. 40, 281(1971)참조). 다른 기질들이 독일공개공보 33 45 748 및 독일공개공보 34 11 574에 기술되어 있다.
10㎕의 혈청 또는 혈장시료를 사용하여 37℃에서 나트륨이온의 효소적 측정을 위한 주요시약의 전형적인 농도범위는 다음과 같다 :
Figure kpo00024
EGTA는 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)-테트라아세트산을 의미한다. 한쌍시험의 형태로 동일한 큐벳(cuvette)에서 나트륨 및 칼륨이온을 효소적으로 분석을 시행하는 것도 또한 가능할 것이다(실시예 G참조).
[칼슘이온의 측정]
칼슘이온의 측정을 위해, 혈장(또는 다른 체액) 시료를 펩티드기질 숙신일-류신-메티오닌-p-니트로아닐리드 및 효소칼파인 I을 포함하는 완충된 혼합물과 함께 배양한다. 칼파인 I에 의해 촉매화되는 반응을 칼슘이온의 존재에 의해 좌우되며 활성율은 칼슘이온농도의 측정치이다. 이 방법의 요체는 효소가 가장 민감한 범위로 이들의 농도를 낮추기 위해 특이적으로 칼슘이온을 결합할 수 있는 킬레이터를 사용하는 것이다. L-시스테인 및 2-머캅토에탄올의 사용을 포함하는 분석을 위해 선택된 조건하에서, p-니트로아닐린 형성율은 실제로 측정되는 칼슘의 농도에 비례한다.
바람직한 펩티드 기질은 일반식에 의해 설명될 수 있다:
P - Pn- P2- P1- X
상기식에서 R은 아세틸, 벤조일, 카보벤즈옥시, 숙신일, 3차-부톡시카로닐 또는 3-(2-푸릴)아크릴오일을 나타내며; Pn- P2- P1적어도 두개의 잔기의 펩티드사슬을 나타내는데 P1위치에서 Try, Met, Lys 또는 Arg 그리고 P2위치에는 Leu 또는 Val 잔기가 바람직하며; X는 효소의 작용에 의해 유리되어 가시광선 또는 형광에서 검출가능한 변화를 나타내는 색원체 또는 형광그룹이다. X는 니트로페닐, 나프틸 또는 티오벤질에스테르 및 방향족고리에 치환체를 가질 수 있는 니트로아닐린, 나프틸아민 또는 메틸쿠마린그룹일 수 있다. 몇가지 적당한 펩티드유도체는 또한 T.Sasaki등에 의해[J. Biol, Chem. 259, 12489-12494]에 기술되어 있는데, 예를 들면 숙신일-Leu-Met-MCA(MCA=4-메틸쿠마린-7-아미드), 숙신일-Leu-Tyr-MCA, 숙신일-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA 그리고 3차-부톡시카보닐-Val-Leu-Lys-MCA이 있다. 또다른 합성기질들이 [Bergmeyer Hu(ED) Methods of Enzymatic Analysis, 제3판 제5권, 84-85(1984)]에 기술되어 있다.
이런 측정방법을 위한 화합물의 농도범위와 시약은 다음과 같다 :
Figure kpo00025
별표*는 기질로서 카제인과 함께 30℃에서 배양 30분후에 750nm에서 흡수가 1.0증가하는 효소의 양으로 정의되는 단위를 의미한다(N.Yoshimura 등, J.Biol.Chem. 258, 8883-8889, (1983)).
필요한 pH 범위에서 칼슘에 대해 무시할만한 결합능력을 가지는 pK를 갖는 어떤 완충액도 이 분석에서 사용될 수 있다. 트리스, HEPES, MOPSO, BES, TES 및 이미다졸과 같은 양호한 완충액(N. E. Good등, Biochem. 5, 467-477(1966))들이 이들 요건을 충족한다(실시예 H 참조). 칼파인 I 대신에 콜라게나아제가 사용될 수 있으며, pH 6.5-7.5에서 L-이소류실-L-아날일글리실 에텔에스테르, 0.01 밀리몰/ℓ내지 0.2밀리몰/ℓ, 와 함께 형광측정적으로 분석될 수 있다.
[염소이온의 측정]
혈액중의 염소를 측정하기 위해, 0.01밀리몰/ℓ의 시스테아민, 4 밀리몰/ℓ의 Gly- Phe-p-니트로아닐리드 및 -0.0-2 U/ml의 카텝신 C를 포함하는 완충된 혼합물과 함께 배양한다. p-니트로아닐린의 형성은 전적으로 염소음이온의 존재에 의해 좌우된다. 브롬이온에 의한 방해를 제거시키거나 또는 이들의 농도를 최적의 효소범위로 조절하도록 염소이온의 활성을 감소시키기 위해 선택성 결합제를 부가적으로 첨가할 수 있다. 분석을 위해 선택된 조건하에서(실시예 5참조) p-니트로아닐린의 형성율 :
Figure kpo00026
은 시료에 있는 염소이온의 농도에 비례한다. 이실시예에서 반응율 405nm에서 흡수증가의 측정에 의해 결정된다.
이런 측정방법에 대한 화합물의 농도범위는 다음과 같다 :
Figure kpo00027
필요한 pH-범위 및 무시할만한 염소농도를 가지는 어떤 완충액도 이 분석에 사용될 수 있다. 상기한 모든 범주의 효소(트렌스퍼라아제, 히드롤라아제, 옥시도리덕타아제 및 리아제)의 예는 문헌에, 특히 이들 효소의 근원이 친할로겐 미생물로부터 유래할 경우에 염소의존성을 가지는 것으로 나타나 있다. 팹티아아제형 효소의 염소의존성은 집중적으로 설명되었다. 예를 들면 디펩티딜펩티다아제 I(카텝신 C). EC 3.4.14.1(J. Ken Mc Donald, Bioch.Bioph, Res.Communication, 24(5) 1966, 771f) 또는 티펩티딜펩티다아제 ⅢEC 3.4.14.3(J.Ken Mc Donald, Journal of Biol. Chem. 241(7) 1966, 194f),둘다 아미노말단으로부터 올리고펩티드 유도에의 가수분해를 촉매화한다. 다른 예로는 넓은 범위의 올리고펩티드의 카복실말단으로부터 디펩티드를 가수분해시켜 이탈시키는 것을 촉매화하는 디펩티딜카복시펩티다아제인 맥관 긴장전환 효소 EC 3.4.15.1가 있다(P.Bunning, 등, Bioch. 26, 1987, 3374f; R.Shapiro등, Bioch.22, 1983, 3850f).
Gly-Arg-p-니트로아닐리드 이외에 상이한 다른 디펩티드-또는 올리고펩티드 기질이 사용될 수 있다. 바람직한 펩티드 기질은 다음 일반식으로 나타낼 수 있다 :
R - Pn-P1-X
상기식에서 디펩티딜 펩티다아제 효소의 경우에 R=H이고 Pn-P1은 적어도 두 개의 잔기를 가지는 펩티드 사슬을 나타낸다. X는 효소의 작용에 의해 색깔 또는 형광의 검출가능한 변화를 생성하는 색원성 또는 형광성 그룹을 나타낸다. X는 니트로페닐-, 나프틸- 또는 티오벤질에스테르 및 방향족 고리에 치환체를 가질 수 있는 니트로아닐린, 나프틸아민 또는 메틸쿠마린일 수 있다. 디펩티딜 카복시펩티다아제 효소의 경우에 X는 아미노말단을 나타내며 R은 효소의 작용에 의해서 방출되는 색원성 또는 형광성그룹이다. R은 치환체를 가질 수 있는 N-푸란아크린오일- 또는 벤조일그룹일 수 있다(실시예 1참조).
염소이온의 효소적 측정의 또 다른 예로서, 플라즈마를 4,6-에틸리덴(G7)-p-니트로페닐(G1)-, D-말토헵타오시드(4,6-에틸리덴-G7PNP)(5밀리몰/ℓ), α-아밀라아제(0.60 U/ml) 및 α-글루코시다아제(=30 U/ml)를 포함하는 완충된 혼합물과 함께 배양한다. p-니트로페놀의 형성은 완전히 염소음이온의 존재에 의해 좌우되며, 이 경우에 사전희석, 소량의 시료에 사용하거나 선택성 결합제를 사용하여 염소이온 농도를 효소의 최적 범위로 조정한다. 시험원리를 이하에 요약했으며, 반응율은 405nm에서의 흡수증가의 측정에 의해 결정된다.
Figure kpo00028
2에틸리덴-G5+ 2G2PNP + 2에틸리덴 - G4+ 2G3PNP + 에틸리덴 - G3+ G4PNP 2P2PNP + G2PNP +10 H2O α-글루코시다아제 4PNP + 10 G(PNP=p-니트로페놀 ; G=글루코스).
이런 측정을 위해 사용되는 화합물의 농도범위는 다음과 같다 :
Figure kpo00029
상기한 카텝신 C(실시예 1) 분석의 변화를 또한 실시예 J에 적용한다.
[중금속이온의 측정]
이들 금속은 Kryptofx
Figure kpo00030
221 및 Kryptofx
Figure kpo00031
222와 같은 크립탄드에 단단히 결합된다. 그러므로 이들은 보다 약하게 결합되어 있는 다른 금속들은 대체할 것이다. 용이하게 대체되는 금속이온의 예는 아연이다. 아연이온은 혈장중에 매우 낮은 농도가 존재한다. 따라서 완충된 혈청혼합물에 아연이온을 가하여 K 221에 착체화되도록 하는 것이 가능하다. 만약 중금속이 존재한다면 아연이온이 이탈되고 이들의 존재가 아연이온에 대해 상당히 민감한 효소인 피리독살 키나아제(양의 뇌로부터)에 작용하여 검출될 수 있다. 많은 다른 유사한 간접적 분석이 가능하며, 설명된 것들은 실시예로서이지 제한을 위한 것이 아니다.
[중탄산 이온의 측정]
중탄산 이온은 본 발명에서 구현된 원리를 변형사용하여 측정될 수 있다. 많은 리간드, 예를 들어 크립탄드는 pH에 대해서 민감하며 이 성질은 중탄산 이온을 측정하기 위해 이용될 수 있다. 필수적으로, 중탄산이온이 양성자를 중화하는 능력을 이용한다. 염산이 가해진 가볍게 완충된 혈청시료의 pH가 중탄산 이온농도를 나타낼 수 있다. 최종 pH는 Kryptofx
Figure kpo00032
221과 같은 pH-고감도 이온 결합제 존재시에 나타나는 유리나트륨이온(β-갈라토시다아제로서 검출)의 양에 의하여 검정되며, 이는 원래의 중탄산이온농도를 나타낸다. 필수적으로 같은 부피의 HCl(75밀리몰/ℓ)로 혈청을 대략pH 4.5로 산성화시켜 모든 중탄산 이온을 수산으로 전환시키고, β-갈락토시다아제와 같은 이온 선택성 효소 및 적당한 pH-고감도 이온결합제를 포함하는 희석된 트리스 완충액(5 밀리몰/ℓ)를 사용하여, pH 7.5-7.8에서 분석계와 반응시킨다. 시료의 나트륨 이온농도는, 시료중의 나트륨 이온의 양에 근거해서 보정이 필요하기 때문에 정확한 결과를 얻기 위해 알아야 한다. 이 방법은 실제로 pH 검출기로서 색원체성 지시제를 사용하는 방법보다 훨씬 강도가 높다(실시예K)
10㎕의 혈장 또는 혈청시료를 사용하여 37℃에서 중탄산이온의 효소적 측정을 위한 주요시약의 전형적인 농도범위는 다음과 같다
Figure kpo00033
Figure kpo00034
나트륨이온농도에 대한 보정의 필요성은 혈장중에 정상적으로 존재하는 미량금속(예컨대 아연이온)에 민감한 효소(예컨대 피리독살 키나이제)를 사용하여 회피될 수 있다. pH에 민감하여 Kryptofx
Figure kpo00035
221에 대한 나트륨이온과 유사한 친화성을 가지는 결합제에 미량금속이 결합한다면, 중탄산이온은 혈장중에서 측정될 수 있는 것보다 초과되는 충분한 농도로 반응혼합물에 있는 아연이온을 포함함으로써 측정될 수 있다. 내재해 있는 아연이온이 방해하지 않기 때문이다.
상기한 방법은 간단하고, 매우 신속하며, 정확하고 정밀하며 값싼 정비로 수행될 수 있다. 이온-선택성 전극과 관련된 많은 문제들과 함께 인화성 기체로 인한 실험실 재해도 방지할 수 있다. 이 방법은 다양한 분석을 수행하는 많은 장비로써 사용하기 위해 채택될 수도 있지만, 또한 응급환자용으로 침대 가까이의 스탠드만 있는 값싼 기구로 사용될 수도 있다. 킷형태의 포장방법이 간단하다. 더우기, 칼륨 및 나트륨이온농도의 측정에 동일한 큐벳에서 후석적으로 수행될 수 있다(실시예 G). 또한 건식분석화학에 사용하는 기계를 사용하여 이 방법이 의사의 사물실에서도 사용될 수 있다. 비록 이들 방법은 자동분광광도계를 사용하여 개발되었지만, 이들은 형광광도계, 발광광도계, 동위원소 카운터등과 같은 자동 또는 수동형 실험실 장비에도 용이하게 채택된다.
10㎕의 혈청 또는 혈장에 근거하여 본 발명을 다음 실시예로써 더욱 상세히 설명하겠다. 이들 실시예는 제한이 아닌 예시용으로써 나타냈다.
다음 실시예에서 작은 부피의 시료(다른 지시가 없을 때 혈청 또는 혈청을 제외하면 10㎕)를, 완충된 기질 및 일정한 공동성분을 포함하는 시약 1과 혼합하고, 일정한 시간, 일반적으로 0.1-5분간 배양한다. 이 배양기간중에 흡수치 해독을 적당한 기간중에 행한다. 그 다음에 지시효소를 포함하는 시약 2를 가하고 반응율을 관찰한다. 몇 실시예에서, 시약 1은 지시효소를 포함하며 시약 2는 적당한 기질을 포함한다. 실시예는 시료, 시약 1 및 시약 2를 혼합한 후의 최종반응혼합물을 나타낸다.
[실시예 A]
나트륨이온농도는 알려지지 않고, 나트륨이온-결합제 없이 피루베이트 키나아제를 사용하여 칼륨이온농도의 측정
최종 배양혼합물은 다음을 함유한다 :
Figure kpo00036
칼륨이온표준(보정)용액은 혈장중에 존재하는 나트륨이온의 피루베이트 키나아제에 대한 작용효과를 보상하기 위하여 140 밀리몰/ℓ의 나트륨이온을 포함한다.
[실시예 B]
나트륨이온농도는 알려져 있고, 나트륨이온-결합제 없이 피루베이트 키나아제를 사용하여 칼륨이온농도의 측정
배양혼합물과 보정용액은 실시예 A와 동일한다.
보정은 나트륨이온농도가 140 밀리몰/ℓ 이하(또는 이상)인 매 10 밀리몰/ℓ에 0.1 밀리몰/ℓ의 칼륨을 가함으로써(또는 뺌으로써)혼합물의 나트륨이온농도에 대해 행해질 수 있다. 하지만, 이 보정은 알려진 나트륨 및 칼륨농도를 포함하는 수용액을 분석함으로써 증명되어야 한다.
[실시예 C]
나트륨이온-결합제 존재하에서 피루베이트 키나아제를 사용한 칼륨이온농도의 측정
인간의 혈청알부민을 생략하고 매질에 부가적으로 분석당 6 마이크로몰의 Kryptofx
Figure kpo00037
221을 포함시킨것을 제외하고는 실시예 B와 같다. 각 표본의 칼륨이온함량을 변경하므로써 기인하는 Kryptofx
Figure kpo00038
221로부터의 나트륨 이온의 대체시의 변화를 최소화하기 위해 pH 7.8을 선택한다.
[실시예 D]
β-D-갈락토시다아제를 사용한 나트륨이온농도의 측정
변형 a : 최종배양혼합물은 다음을 포함한다 :
Figure kpo00039
유리된 2-니트로페놀의 형성율을 측정함으로써 최초의 시료중에 있는 나트륨이온농도를 결정하기 위하여 이 반응을 420nm(또는 근처) 파장에서 관찰했다.
변형 b : 변형 a와 비교되는 다른 접근방법은 사전희석에 의해 시료농도를 10배로 감소하거나 또는 소량의 시료부피를 사용하는 것인데, 이 경우에는 크립탄드를 생략할 수 있다.
변형 c : 낮은 나트륨 이온함량(예컨대＜20 밀리몰/ℓ)의 유체중에서의 측정으로 이 경우 크립탄드를 생략할 수 있다.
[실시예 E]
피루베이트 키나아제로 나트륨이온의 측정(칼륨이온의 감도가 감소되는 조건하에서, 나트륨이온에 의한 효소활성의 직접 작용)
변형 a : 10㎕의 혈장시료에 대해서 배양혼합물은 다음을 포함한다.
Figure kpo00040
Figure kpo00041
나트륨이온 보정용액은, 피루베이트 키나아제에 대한 혈청 칼륨이온의 작용효과를 보상하기 위하여 4 밀리몰/ℓ 의 칼륨을 함유한다.
[실시예 F]
피루베이트 키나아제로 나트륨이온의 측정(간접분석)-칼륨이온 농도는 알려져 있음.
최종 배양혼합물은 10㎕ 의 혈장시료에 대해 다음을 함유한다 :
Figure kpo00042
염화칼륨을 이 시약에 가하여 Kryptofx
Figure kpo00043
221로부터 나트륨이온을 화학양론적으로 대체하여, 표본의 나트륨이온농도가 정량되도록 한다.
[실시예 G]
동일한 큐벳중의 칼륨이온과 나트륨이온농도의 측정(트윈-테스트)
분석에서 다음을 함유한 이외에 실시예 D와 같이 나트륨이온농도를 분석한다 :
Figure kpo00044
반응물에 대한 측정에 의해 나트륨이온의 측정후에, 배양혼합물의 pH를 염산일정량으로 pH 7.4로 낮춘다.
그 다음에 지시된 최종농도를 얻기 위하여 다음 성분을 가한다 :
Figure kpo00045
그 다음에 반응율은 340nm에서 조정할 수 있지만 나트륨이온 지시반응에서 유리된 2-니트로페놀에 의해서 가능한 방해를 최소화하기 위해 약간 더 높은 파장에서 측정될 수도 있다.
[실시예 H]
칼파인 I을 사용한 칼슘이온농도의 측정
이 실시예에서, 혈장을 얻기 위해서 소량의 혈액시료를 원심분리한다. 칼슘이온의 측정을 위해 50 밀리몰/ℓ의 이미다졸-HCl완충액 pH 7.3, 5 밀리몰/ℓ의 L-시스테인, 2.5 밀리몰/ℓ의 2-머캅토에탄올, 0.1 밀리몰/ℓ의 EGTA 및 5 밀리몰/ℓ의 Suc-Leu-Met-p-니트로아닐리드를 함유하는 혼합물과 함께 시료를 30℃에서 배양한다. 405nm에서의 흡수증가를 5분간격으로 관찰했다. 이 비율은 시료의 칼슘이온농도에 비례한다.
[실시예 I]
카텝신 C를 이용한 염소이온농도의 측정
이 실시예에서, 혈장을 얻기 위해서 소량의 혈액시료를 원심분리한다(5㎕). 염소이온의 측정을 위한 배양혼합물은 0.05몰/ℓ 시트레이트 완충액 pH-5.0, 10 밀리몰/ℓ의 시스테아민 및 4 밀리몰/ℓ의 glt-age-p-니트로아닐리드 및 0.01 U/ml의 카텝신 C를 함유한다. 후자는 염소이온을 제거하기 위해 10 밀리몰/ℓ의 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 및 43%(v/v)의 글리세롤에 투석시킨 것을 사용했다.
[실시예 J]
α-아밀라아제를 사용한 염소이온농도의 측정
5㎕의 혈장시료에 대한 억제혼합물은 다음을 함유한다 :
Figure kpo00046
유리-4니트로페놀의 형성비율 및 이에따라 최초시료중 염소이온의 농도를 측정하기 위해 반응을 405nm(또는 근처)파장에서 관찰한다.
[실시예 K]
β-D-갈락토시다아제를 사용한 중탄산이온농도의 측정
변형 a : 최종 배양혼합물은 다음을 함유한다 :
Figure kpo00047
Figure kpo00048
EATA는 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)-테트라아세트산을 의미한다. 시료의 pH를 4.5로 낮추기 위해 시료를 같은 부피의 HCl(혈장용, 75 밀리몰/ℓ)을 가해 사전배양한다. 유리 2-니트로페놀의 형성 및 이에따는 최초시료중 중탄산 이온의 농도를 측정하기 위해 이 반응을 420nm(또는 근처)파장에서 관찰한다. 최초표본에서 나트륨이온농도에 대해 보정을 실시한다.
변형 b : 피리독살 키나아제, 피리독살 및 아연이온을 β-갈락토시다아제 및 GP로 치환한다.

Claims (41)

  1. 방해이온에 대한 차폐를 위해 결합제를 첨가하여, 효소의 활성에 대한 이온의 영향을 측정함으로써 유체중에 있는 이온을 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 유체가 생물학적 또는 비-생물학적 유체임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 생물학적 유체가 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 땀, 뇌척수액, 림프 또는 장분비물, 추출액 또는 누출액이고 비-생물학적 유체가 물 또는 수성추출물 또는 혼합물임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 효소가 트랜스퍼라아제, 히드롤라아제, 옥시도리독타아제 또는 리아제임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 트랜스퍼라아제가 전이인 함유그룹이고 히드롤라아제가 글루코시다아제 또는 펩티드 결합에 작용하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서. 히드롤라아제가 α-또는 β-D-갈락토시다아제, 카복시펩티나아제 A, 콜라게나아제, 아밀라아제, 칼파인 I, 칼파인Ⅱ, 디펩티딜 아미노펩티다아제 Ⅰ(카펩신 C) 또는 포스포글리콜레이트 포스포타아제임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 트랜스퍼라아제가 피루베이트 키나아제, 헥소 키나아제, 아데닐레이트 키나아제, 피리독살 키나아제 또는 아세테이트 키나아제이고 히드롤라아제는 α-또는 β-D-갈락토시다아제 또는 카복시펩티다아제 A임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제4항에 있어서, 옥시도리덕타아제가 공여체분자의 CH-OH 그룹에 또는 알데히드에 또는 공여체의 옥소그룹에 작용함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제4항에 있어서, 옥시도리덕타아제가 글리세롤 디하이드로게나아제, 아세트알데히드 디하이드로게나아제 또는 티로시나아제(카테콜 옥시다아제)임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제4항에 있어서, 라아제가 탄소-탄소리아제 또는 탄소-산소 리아제임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 라아제가 알돌라아제 또는 탄소안하이드라아제임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 이온이 칼륨, 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 망간, 리튬, 납, 아연, 구리, 철 또는 기타 중금속이거나 또는 양성자, 중탄산 이온, 염소, 암모늄으로 이루어지는 비-금속이온이거나 또는 암모늄은 제공하는 물질임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 시료를 희석하는 것이 불가능할 경우에 측정될 이온을 결합제에 의해 측정에 적합한 수준의 농도로 감소시키거나 측정될 이온에 대한 효소의 감도를 감소시킴을 특징으로 하는 방법.
  14. 제5항, 7항 또는 12항중의 어느 한 항에 있어서, 피루베이트 키나아제, 글리세롤 디하이드로 게나아제 또는 아세트알데히드 디하이드로 게나아제를 사용하여 칼륨이온을 측정함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제5항,7항 또는 12항중의 어느 한 항에 있어서, 효소 피루베이트 키나아제 또는 β-D-갈락토시다아제를 사용하여 나트륨이온을 측정함을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 방해이온 또는 검체가 크립탄드, 코로난드, 포단드, 크라운 에테르, 스페란드, 헤미스페란드, 칼릭사렌 또는 이들의 조합물, 천연적으로 존재하는 이온공여체, 시클릭펩티드, 콤플렉손 또는 킬레이트제 및 이들의 유도체, 또는 주기율표상의 1족 또는 2족 금속에 의해 결합됨을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 칼륨이온을 측정하는 경우에 방해하는 나트륨 이온은 Kryptofix
    Figure kpo00049
    221에 의해 결합되고 나트륨이온을 측정하는 경우에 방해하는 칼륨이온이 Kryptofix
    Figure kpo00050
    222에 의해 결합됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 제13항에 있어서,β-갈락토시다아제를 사용하여 나트륨이온을 측정하는 경우에 유리나트륨이온의 농도를 결합제로 감소시킴을 특징으로 하는 방법.
  19. 제13항에 있어서, 결합제가 Kryptofix
    Figure kpo00051
    221임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제13항에 있어서, 크립탄드, 코로난드, 포단드, 크라운 에테르, 스페란드, 헤미스페란드, 칼릭사렌 또는 이들의 조합물, 천연적으로 존재하는 이온공여체, 시클릭펩티드, 콤플렉손 또는 킬레이트제 및 이들의 유도체, 또는 주기율표상의 1족 또는 2족 금속으로 구성되는 결합제가 존재하고, 이것이 지시이온과 함께 착체를 형성하고 이로부터 측정될 이온에 의해 지시이온이 대체되고 효소의 활성에 대한 대체된 지시이온의 영향을 분석하고, 이에 의해 검체농도가 간접적으로 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 효소가 피루베이트 키나아제이고, 지시이온이 칼륨이고, 결합제가 Kryptofix
    Figure kpo00052
    221이고 측정될 이온이 나트륨임을 특징으로 하는 방법.
  22. 제20항에 있어서 효소가 카나아제이고, 지시이온이 Mg2+이고, 결합제가 킬레이트제이고 이온이 금속임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제20항에 있어서, 효소가 피리독살키나아제이고, 지시이온이 Zn2+이고 결합제가 Kryptofix
    Figure kpo00053
    221이고 이온이 중금속임을 특징으로 하는 방법.
  24. 제20항에 있어서, 측정될 이온이, 착물로부터 pH민감성 결합제로 지시이온을 대체하는 pH값의 변화를 유발함을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 효소가 β-갈락토시다아제이고, pH-민감성 결합제가 Kryptofix
    Figure kpo00054
    221이고, 지시이온이 나트륨이고, 측정될 이온이 중탄산이온임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제13항에 있어서, 효소가 α-아밀라아제 또는 카텝신 C이고, 결합제가 Ag 또는 Hg이고 측정될 이온이 염소임을 특징으로 하는 방법.
  27. 제13항에 있어서, 효소가 콜라게나아제 또는 칼파인 Ⅰ 또는 Ⅱ이고, 결합제가 킬레이트제이고 측정될 이온이 칼슘임을 특징으로 하는 방법.
  28. 제1항에 있어서, 민감한 지시효소의 경쟁적 억제제인 이온이 분석중에 포함됨에 특징으로 하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 측정될 이온이 나트륨 또는 칼륨이고 경쟁적 억제제가 리튬이온임을 특징으로 하는 방법.
  30. 활성이 이온 및 결합제에 의해 영향을 받는, 효소를 포함하는 유체중의 이온 측정용 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 피루베이트 키나아제와 크립탄드를 포함하는, 칼륨이온 측정용 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 크립탄트가 Kryptofix
    Figure kpo00055
    221임을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제30항에 있어서, 피루베이트 키나아제와 크립탄드를 포함하는 나트륨이온 측정용 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 크립탄드가 Kryptofix
    Figure kpo00056
    222임을 특징으로 하는 조성물,
  35. 제30항에 있어서, β-D-갈락토시다아제와 크립탄드를 포함하는 나트륨이온 측정용 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 크립탄드가 Kryptofix
    Figure kpo00057
    221임을 특징으로 하는 조성물.
  37. 제30항에 있어서, 37℃에서 사용되는 다음을 포함하는 조성물.
    Figure kpo00058
  38. 제30항에 있어서 37℃에서 사용되는 다음을 포함하는 조성물 :
    Figure kpo00059
  39. 제30항에 있어서, 37℃에서 사용되는 다음을 포함하는 조성물 :
    Figure kpo00060
    Figure kpo00061
  40. 제30항에 있어서, 37℃에서 사용되는 다음을 포함하는 조성물 :
    Figure kpo00062
  41. 제30항에 있어서, 37℃에서 사용되는 다음을 포함하는 조성물 :
    Figure kpo00063
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