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"Verfahren zur Messung einer Stoffkonzentration in einer Lösung"
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rie Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Stoffkonzentrationen
durch Messung von Sauerstoff und/oder H2O2 unter Anwesenheit eines spezifischen
Enzyms sowie eines Kofaktors (z.n. Coenzyms), welches im Verlaufe des Reaktionsumsatzes
reduziert wird und einer nachgeschalteten Reaktion, in der das Coenzym mit Hilfe
einer Oxydase zu seiner Ausgangsform aufoxydiert wird, wobei der Verbrauch von molekularem
Sauerstoff bzw. die Entstehung von H2O2 meßbar sind.
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Zur Veranschaulichung dieser Reaktionswege und zur Beschreibung des
Standes der Technik sei zunächst des Schema einer einf0chen enzymatischen Reaktion
zur Bestimmung einer Stoffkonzentration (Substrat) anhand des Umsatzes von ß-D-Glucose
zu D-Glucono- g -lacton durch Anwesenheit von Glucose-Oxydase (GCD) beschrieben.
Über diese Beschreibung hineusgehende Details können z.B. in "Methoden der enzymatischen
Analyse" Bd 1.3. Auflage S 486 hersusgegeben von Ulrich Berg er im Vermag Chemie
nechgelesen werden.
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GOD ß-D-Glucose + H2O + 1/2 O2
D-Glucono-#-lacton + H2O2.. (1) Wie dieses Reaktionsschema zeigt, wird das Substrat
ß-D-Glucose in wässeriger Lösung unter Aufnahme von Sauerstoff durch die Anwesenheit
der Glucoseoxydase in D-Glucono-#-lacton und Wasserstoffperoxyd umgesetzt. Aus der
Messung der bei der Reaktion erfolgenden Sauerstoffaufnahme bzw. der Produktion
von Wasserstoffperoxyd kann die umgesetzte Substratmenge bestimmt werden. Derartige
Verfahren zur Messung der Glucose sind bekennt und beispielsweise von George G.
Guilbault im Hanabook of encymatic methods of analysis, erschienen im Marcel-Decker-Verlag,
New Yorg S 264 ff näher be schrieben.
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In einer weiteren Gruppe von enzymatischen Reaktionen durch Enzyme
aus der großen gruppe der sog. Oxydoreduktasen oder Dehydrogenasen wird bcim Umsatz
des substrates ein Frotonentranafer an einer für die Reaktion notwendigen Coenzym
katalysiert. Das Coezym wird dabei i.s. in eine reduzierte Form übergeführt.
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Das am häufigsten engewandte Coenzym "ß-Nicotilnamid-adenindinucleotid",
abgekürat NAD. dessen reduzierte Form:"ß-Nicotinamid
-adenin-dinucleotid-reduziert"
abgekürzt NADH ist. Als Beispiel einer NAD-pflichtigen Reaktion sei der Umsatz von
Lactat unter Anwesenheit von Lactat-dehydrogenase (LDH) beschrieben. Dies erfolgt
nach folgendem Reaktionsschema: LDH Lactal + NAD
Pyruvate + NADH + H+ ......(2) Gemäß dieser Gleichung wird das Lacbat-Ion unter
Präsenz von NAD unter der Wirkung des Enzyms LDH zum Pyruvat-Ion sowie I zu NADH
reduziert, wobei ein Wssserstoffion frei wird.
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Der Ansatz gemäß dieser Reaktion ist bereits meßtachrisc verwertbar,
da die Produktion von NADH in der Reaktionslösung eine snektrophometrisch meßbare
Zunahme der Absorstion besi einer Wellenlänge von 340 nm hervorruft.
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Der Nachteil dieses einfachen Reaktionsansatzes basteht darin, daß
das aus einem Gemisch von LDH und RDH bestehende Reagens bei der Reaktion durch
irreversible Bildung von NADH (bei geeIgnetem pH-Wert der Lösung verläuft die Sektion
mit starker Präferenz von links nach rechts) "verbraucht wird und für eine neuerliche
Messung nicht mehr zur Verfügung steht.
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Es wurde daher versucht, eine Regenerierung des Coenzyas durch elektrochemische
Oxydation desselben an einer inerten Fleketrode durchzuführen. Ein derartiges Verfahren
bei dem das an der Oberflache einer als Anode wirkenden inerten Elektrode immobilisierte
reduzierte Coenzym NADH elektrochemisch zur Ausgangsform NAD bei einer Spannung
von + 1,35 V oxydiert wird, ist in der US-PS 752 421 vom 13. 12. 1976 beschrieben.
Wie MALI-NAUSKAS und in einem Artikel in Analytica Chimica Acta 98 (1978): auf S
36 der Arbeit ausführen, erfolgt diese elektrochemische Oxydation langsam und kann
somit den gesamten Meßprozeß verzögern. Dieser Nachteil konntae durch die obgenannten
Autoren verbessert werden, indem ein weiterer Zwaischenschritt unter Verwendung
von Phenacine methosulfat (PMS+) eingeschalte wurde.
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Währed die direkte elektrochemische Cxydation von NADH nach dem Schema:
NADH
NAD+ + H+ + 2e- ............(3)
abläuft, erfolgt die letztgenannte
Reaktion mit Zwischenschritt nach dem Schema: NADH + PMS+
NAD+ + PMSH PMSH
Pi.S+ + X + 2 e ............... (4) Nach Reaktion (4)'erfoLgt die Oxydation rasch.
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Dem Verfahren der elektrochemischen Regeneration haftet der Nachteil
an, daß die Selektivität der Reaktion in realen Lösungen durch die Anwesenheit anderer
elektroaktiver Verbindungen verringert werden kann und die inerte Elektrode nach
geringer Gebrauchszeit reaktiviert werden muß, was meist durch Abtragen einer dünnen
Oberflächenschichte erfolgt.
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Der vorliegenden Erfindung lagen folgende Aufgaben zugrunde: 1. Die
oben beschriebenen Nachteile der elektrochemischen Oxydation des Coenzyms sollen
vermieden werden.
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2. Reaktionen mit Oxydasen nach Gleichung (1) und Coenzympflichtige
Reaktionen nach dem Typus NAD+ -NADH nach Gleichung (2) sollten auf ein gemeinsames
Mefhilfsmittel zurückgeführt werden. das letztlich darin besteht, den Verbrauch
von Sauerstoff oder die Produktion von Wasserstoffperoxyd im Meßmedium als umsatzproportionale
Größe qualitativ oder kinetisch zu bestimmen.
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3. Die Messung des Sauerstoffverbrauches sollte nicht nur elektrochemisch
möglich sein sondern auch durch bekannte optische Methoden.
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Dies wird dadurch erreicht, daß gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Messung einer Stoffkonzentration (Substrat) unter Anwesenheit eines ersten spezifischen
Enzyms sowie eines Coenzyms, das bei der Reaktion in seinen reduzierten Zustand
übergeführt wird, das Coenzym in einem nachgeschalteten Reaktionsschritt durch die
gleichzeitige Anwesenheit eines Eilfsenzyms aus der Klasse der Oxydasen zu seinem
Ausgangszustand oxydiert wird und der in der nachgeschalteten Reaktion erfolgende
Verbrauch von Sauerstoff oder die Produktion von Wasserstoffperoxyd gemessen wird.
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Ohne nun die Allgemeingültigkeit auf bestimmte Substrate, Enzyme,
Coenzyme und Hilfsenzyme einzuschränken, sei das ober, beschriebene Verfahren am
Beispiel der Messung von Lactat mit Lactatdehydrogenase und NAD+ näher beschrieben.
Das Schema der Reaktion ird durch Gleichung (5) beschrieben:
In Gleichung 5 bedeuten: - Lactat .... das zu messende Substrat, das zu Pyruvat
umgesetzt wird - tDTt .... Lactatdehydrogenase ~NAD+ .... Coenzym -NADH .... Coenzym
reduziert -NADH-Oxydase .... Filfsenzym Als TlZilfsenzym kommt beispielsweise die
sogenannte Menadion-Reduktase in Frage, die aus Escherichia coli gewonnen wird und
die Sauerstoff als H+ -Akzeptor sowie NADH als H+ -Donator verwenden kann. Welters
könnte als Hilfsenzym auch das sogenannte alte gelbe Enzym bzw. Diaphorase dienen.
Weitere Beispiele NAD-pflichtiger Reaktionen sind in der eingangs erwähnten Literatur
tabellarisch aufgeführt.
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Es muß gesagt werden, daß sich das Verfahren nicht nur ausschließlich
auf Reaktionen mit dem Coenzym NAD anwenden läßt sondern generell auf alle jene
Reaktionen, bei denen ein Coenzym reduziert wird und für dessen Oxydation sich ein
geeignetes Hilfsenzym finden läßt. Um dafür weitere Beispiele zu nennen, können
Reaktionen mit dem System NADF/NAFPH (Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat) in
Frage, als zugehöriges Hilfsenzym das sogenannte "alte gelbe Enzym" aus Hefe.
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Ein weiteres Coenzymsystem ist FAD/FADH (Flavin-adenindinucleotid)
reduziert. Die meßtechnische Ausgestaltung des der Anmeldung zugrundeliegenden Verfahrensprinzips
soll anhand
einiger Beispiele beschrieben werden.
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Es wirt ein Gemisch vorgesehen, das in wässeriger I,nsung bestimmte
1:ingen des auf den zu bestimmenden Stoff spezifischen Enzyms sowie eines dafür
erforderlichen Coenzyms sowie weiters ein Hilfsanzym enthält, das die be, in der
Reaktion zwischen Coenzym sind dem zu bestimmenden Stoff entstehende reduzierte
Form des Coenzyms wieder zur Ausgangsfrom aufzuoxydieren im Stande ist.
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Wird einer abgemessenen Menge dieses Reagensgemisches eine abgemessene
enge einer den zu bestimmenden Stoff enthaltenden Lösung (Probe) durch intensives
Rühren beigemischt, so wird durch die Reaktion in der Gesamtlösung enthaltener Sauerstoff
verbraucht und Wasserstoffperoxyd produziert. Die Menge des verbrauchten Sauerstoffs
bzw. des produzierten aaserstoffperoxyds ist ein stöchiometrisches :aS für die konzentration
des zu bestimmenden Stoffes. Durch geeignete Bemessung der Mengenverhältnisse von
Reagens und probe kann in weitem Bereich ein linearer Zusammenhang erhalten werden.
Der Verbrauch von Sauerstoff im Reaktionsgemisch kann mittels einer Clark-Elektrode
oder nach DAS 25 08 637 auf optischem Wege durch die Änderung der Fluoreszenzintensitt
eines Fluoreszenzrarbstoffes (z.B. pyrenbuttersäure) mit Hilfe einer dort beschriebenen,
mit Optode bezeichneten Anordnung gemessen werden. Die Produktion von --S2°2 kann
ebenfalls polarographisch mit einer Elektrode nach bekanntem Verfahren gemessen
werden.
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Sollte die Produktion von H202 die Sauerstoffmessung stören, kann
das entstehende H2O2 durch eie Beimengung des Enzyms katalase sofort bei seiner
Entstehung in Wasser und Sauerstoff zerlegt werden.
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ist bei diese Verfahren ist erforderlich, absolute Werte der verbrauchten
Sauerstoffmenge oder produziertem 11202 zu bestimmen. Durch Eichung kann der Signalunterschied
des verwendeten meßfühlers zwischen dem Zustand vor Einbringen der probe in das
Reagens und dem Gleichgewichtszustand n7ch erfolgter Reaktion in Einheiten des zu
messenden Stoffes ausgedrückt werden.
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ist weiters bekannt, daß auch die Reaktionsgeschwindigkeit
ausgedrückt
durch das iqaximum der zeitlichen Änderung des des Sauerstoffverbrauches (also die
Grome d dt max PO2 = Sauerstoffpartialdruck in der Lösung) bzw. das Maximum der
Zunahme der H2O2-Produktion d H2O2/dt/max ein lineares maß für zu messende Stoffkonzentration
ist (US-PS 454 628).
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Die oben beschriebene Anwendung des Verfahrens ist aufwendig. Weiters
muß die Reagenslösung nach jeder Messung verworfen werden. Dadurch ist der Vorteil
der gekoppelten Reaktion nach Gleichung (5), daß das Reagens bezüglich des Coenzyms
regeneriert wird, nicht ausgenutzt.
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Tn einer weiteren Art der Ausbildung kann ein Reaktionsraun geschaffen
werden, der in der dünnen Schichte ein Gel versieht, in dem das spezifische Enzvm,
des Coenzym, und das Hilfsenzym in geeigneter Konzentration in wässeriger Phase
vorhanden sind. Diese Schichte kann auch so ausgeführt sein.
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das sie aus einem organischen (polymeren) oder anorganischen Träger
besteht, in dem eine oder mehrere der genannten Substanzen nach bekannten Verfahren
immobilisiert sind. Geeignete Träger und Immobilisierungsverfahren sind in "Handbook
of encymatic methods of analysis" von George G. Guilbault (Marcel Decker-Verlag)
Seite 445 bis 530 beschrieben. tie dort beschriebenen Verfahren können ohne Einschränkung
auf das erfindungsgemäße Meßverfahren angewandt werden. Eine derartige Reagensschichte
kann, falls erforderlich, gegen die Probe hin durch eine semipermeable Membran abgetrennt
sein, durch die die Moleküle des zu messenden Stoffes in die Reagensschichte diffundieren
können. Die Reagensachichte kann direkt mit einer Clark-Elektrode oder einer wie
oben erwahnten Optode oder einer w202-Elektrode in Kontakt gebracht weraen. wodurch
Sauerstoff oder H2O2 in der Reagensschichte meßbar sind.
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Die vorhin beschriebene Reagensschichte kann auch in mehrere Einzelschichten
unterteilt sein, die jeweils nur eines der Enzyme bzw. das Coenzym enthalten. Reiters
kann die Reaktionsschichte so aufgebeut sein. daß eine Teilschicht des spezifische
rnzv: sowie oae Coenzyr enthält diese können unter
ein der durch
semipermeable Membranen getrennt sein.
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In einer weiteren Ausführugsform kann in die Reagensschlichte bzw.
einer ihrer Teilachichten ein Fluoreszenzfarb-Stoff eingelagert sein, dessen Fluoreszenzintensität
durch molekularen Sauerstoff veranuDrt wird. Als Fluoreszenzfarbstoff kommt z.».
Pyrenbuttersäure in Frage. Dieser Fluoreszenzfarbstoff kann entweder in Lösung also
molekular dispers oder in Form von kleinsten Kapseln mit einem Durchmesser von wenigen
µm und einer umgebenden Polymerhülle in die Reagensschichte eingelagert sein.
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(Vergl. US-PS 4 021 364 Speiser et al: Microcapsules in the manometric
range and a method for their production).