SE432949B - Forfarande och reagens for bestemning av urinsyra - Google Patents

Description

lO 20 25 30 35 40 7803056-6 2 Bildningen av NAD(P)H, mätt på extinktionsökningen vid 340 nm, Hg 334 nm eller Hg 365 nm, är proportionell mot urin- syramängden.

Jämförd med den som referensmetod ansedda urikasmetoden kännetecknas detta.nyare förfarande enligt Haeckel av en mindre mottaglighet för störningar gentemot föroreningar i analyssatsen, enär mätningen sker i det långvågiga UV-området (334 till 365 nm i stället för 293 till 297 nm). I jämförelse med "urica-quant"- förfarandet är tidsåtgången per analys väsentligt mindre, vari- genom denna.nyare metod är synnerligen väl lämpad för snabb- o gående analysautomater. 7 _ Vid användning av ovan beskrivna.urinsyratest enligtf Haeckel visade det sig, att i många fall, isynnerhet vid serum från njursjuka eller leversjukdomar, väsentliga störningar av testen erhölls genom krypreaktioner. Vid arbete enligt slutvärde- metoden finner man redan före tillsatsen av urikas-lösningen, som skall igångsätta reaktionen, en NAD(P)H-ökning resp. NADH- minskning. Vidare avstannar reaktionen icke heller efter omsätt- ning ay hela.urinsyramängden, utan det bildas fortsättningsvis NAD(P)H. Dessa krypreaktioners hastighet utgör vid 25°C ca 0,001-0,004 A E/min, varvid dessutom hastigheterna.före starten och efter förloppet av urinsyrareaktionen ofta skiljer sig från varandra. Detta.försvârar mycket en noggrann utvärdering av mätresultaten, enär man endast mindre noggrant kan fastställa den extinktionsdifferens som motsvarar den omsatta.urinsyra- mängden. Av denna.extinktionsdifferens, av analyssatsen och av den molära extinktionskoeffícienten NADH skall dock analys- resultat beräknas. U Dessa krypreaktioner verkar vid urinsyrabestämningen på kinetisk bas ännu avsevärt mera.störande än vid bestämningen enligt slutvärde-förfarandet. Vid de kinetiska förfarandena måste man som känt för en alltid erforderlig kalibrering genom- föra.en standardbestämning, varför man i allmänhet insätter en vattenhaltig standard. LJ. Ziegenhorn i "Grundlagen der enzy- matischen Analyse" H. Bergmeyer, s. 81-85, Verlag Chemie (l977)].

Enär vid en sådan standardanalys inga krypreaktioner uppträder, erhåller man vid analys av ovan anförda sera, i vilka krypreak- tioner uppträder, felaktiga.positiva resp. negativa resultat, enär till den på urinsyraomsättningen àtergående reaktionen krypreaktionen överlagras. De kinetiska testerna är emellertid 10 15 25 30 35 40 7803056-6 3 av stor betydelse för det automatiserade laboratoriet. De möjlig- gör att tidsbehovet per analys drastiskt reduceras och utnyttjar sålunda analysautomaterna bättre. Därutöver är de i allmänhet mindre känsliga för störningar genom grumlingar eller provets egenfärg än slutvärde-förfarandet.

Såsom vid slutvärde-förfarandet kan visserligen även vid det kinetiska förfarandet de genom krypreaktioner betingade stör- ningarna till en viss grad beaktas genom bestämning av noll- värden för proverna. Detta innebär emellertid nackdelar, emedan prov-noll-värde-bestämningar betyder i regel en fördubbling av tids- och reagensbehovet vid genomföringen av analysen. Framför allt vid modärna, snabbgàende analysautomater ("Centrifugal Fast Analyzer" och liknande automater) inkräktar prov-noll- värde-analyser mycket pâ det optimala utnyttjandet av auto- materna.

Allt efter omfattningen av krypreaktionen fastställdes fel pä 5 till 20 % för analysreaktionen. Detta innebär en stark in- skränkning av användbarheten av metoden för urinsyrabestämning enligt Haeckel inom rutindiagnostiken, där som känt urinsyra- tester ofta maste utföras på serum från njursjuka. Speciellt vid gikt är en njursjukdom mycket vanlig.

Till grund för uppfinningen ligger sålunda uppgiften, att åstadkomma ett förfarande, vid vilket de beskrivna.störningarna vid urinsyrabestämningsmetoden enligt Haeckel kan undvikas.

Denna.uppgift löses enligt uppfinningen genom ett förfaran- de för bestämning av urinsyra i biologiskt material medelst urikas, katalas och aldehyddehydrogenas i närvaro av alkohol och nikotin- amid-adenin-dinukleotid resp. -fosfat [NAD(Pfl, som kännetecknas därav, att minst en förening ur gruppen oxalat, malonsyramono(låg)- alkylester, trihalogenetanol, eventuellt med en till flera låg- alkylgrupper eller/och halogenatomer substituerad pyrazol eller pyridin, eventuellt med en làgalkylgrupp substituerad pyridin- karbonsyra, dess amid eller lågalkylester, tiokarbamid, isobutyr- amid eller kelatbildande komplexeringsmedel, såsom nitrilotri- ättiksyra eller etylendiamintetraättiksyra tillsättes.

Som biologiskt material som avses bestämmas ifrågakommer isynnerhet serum och blod, men även serin, genom celluppslutning erhållna vätskor eller dylikt kan insättas som utgàngsmaterial.

Med lágalkylgrupper avses inom ramen för uppfinningen så- dana.med l-4 kolatomer. Halogenatomer bör inom ramen för upp- 10 15 20 25 30 35 40 7803056-6 4 finningen vara klor-, brom och Jodatomer. Av pyrazolderivat är sådana.att föredraga, vilka har en substituent 1 ställning 4.

Hos pyridinkarbonsyror förefinnes karboxylgruppen i ställning 3.

Typiska exempel på lämpliga föreningar är pyrazol, 4-brompyrazol, 4-jodpyrazol, 4-klorpyrazol, 4-metylpyrazol, 4-etylpyrazol, 4- propylpyrazol, 3,4-dibrompyrazol, pyridin, N-metylnikotinamid o.dyl. ' - De enligt uppfinningen för insättning avsedda tillsatsmed- len kan tillsättes enskilt eller i kombination. Medan i många fall ett enda tillsatsmedel är tillräckligt för att fullständigt undertrycka en krypreaktion, är dock en tillsats av minst två av medlen enligt uppfinningen att föredragas Speciellt att föredraga är användningen av ett medel ur gruppen oxalat och malonsyra- mono(lâg)alkylester tillsammans med ett eller flera.medel ur gruppen trihalogenetanoler, isobutyramid, tiokarbamid, substitu- erade eller osubstituerade pyrazoler, pyridiner eller pyridin- karbonsyror. Av oxalaterna är alkalisalter att föredraga.

Förfarandet kan genomföras enligt slutvärde-förfarandet, vid vilket koncentrationen av urinsyra efter reaktionens slut bestämmes ur den uppmätta.extiktionsdifferensen. Vidare kan kinetiska förfaranden användas, vid vilka reaktionens hastighet användes som mätstorlek. Uppgifter betr. huru sådana kinetiska testsystem vid förekomsten av kopplade enzymreaktioner skall' uppbyggas, är kända från DT-OS 25 58 536. Dessutom är det från DT-PS 24 40 011 redan känt, att den i och för sig för använd- ningen av kinetiska förfaranden för låga Michaelis-konstanten hos urikas med hänsyn till urinsyra synbarligen kan höjas genom tillsats av en kompetitiv inhibitor, så att kinetiska mätprin- ciper kan användas. En sådan kompetitiv inhibitor är t.ex. xantin.

De enligt uppfinningen tillsatta.föreningarna.användes i sådana mängder, att förekommande krypreaktioner fullständigt undertryckes. De erforderliga.mängderna.kan lätt bestämmas genom ett enkelt förförsök. I allmänhet är dock tillsatser mellan 0,005 och 0,5 mol tillsatsförening per liter reagens fullt till- räckliga. I enstaka fall kan större eller mindre tillsatsmängder komma i betraktande.

Förfarandebetingelserna med avseende på pH-värde, tid, tem- peratur och dyligt motsvarar de från DT-OS 24 50 726 kända. Före- trädesvis arbetas vid pH 8,0 till 9,0 under användning av en i detta område sin maximala kapacitet uppvisande buffert. Speciellt 10 15 35 40 7803056-'6 5 goda resultat har erhållits med difosfatbuffert (K4P207/H01).

Bestämningen sker lämpligen vid rumstemperatur.

Ett ytterligare föremål enligt uppfinningen är ett reagens för bestämning av urinsyra, innehållande urikas, katalas, aldehyd- dehydrogenas, alkohol, NAD(P) och buffert, vilket kännetecknas därav, att det innehåller minst en förening ur gruppen oxalat, malonsyramono(låg)alkylester, trihalogenetanol, eventuellt med en eller flera lågalkylgrupper eller/och halogenatomer substi- tuerad pyrazol eller pyridin, eventuellt med en lågalkylgrupp substituerad pyridinkarbonsyra, dess amid eller lågalkylester, tiokarbamid, isobutyramid eller kelatbildande komplexerings- medel, såsom nitrilotriättiksyra eller etylendiamintetraëttiksyra.

Ett föredraget reagens av ovan angivna slag innehåller ca 1 x 102 till 1 x 103 U/liter urikas, 500 till 1500 kU/liter katalas, 500 till 1000 U/liter aldehyddehydrogenas, 0,3 till 2 mol/liter etanol, 0,5 till 1,5 mmol/liter NAIÜ eller NADP+, 20 till 100 mmol/liter buffert pH 8,0 till 9,0 och 0,005 till 0,5 mol/liter tillsatsmedel enligt uppfinningen.

Enligt uppfinningen lyckas det, såsom ovan beskrivits, att utes1uta.störande krypreaktioner vid bestämingen och däri- genom att förbättra noggrannheten för förfarandet och att genom inbesparande av prov-nollvärde-bestämning nedsätta tids- och reagensbehovet.

Följande exempel åskådliggör ytterligare uppfinningen.

Exempel 1-27.

De i det följande beskrivna.exemplen genomfördes enligt slutvärde-förfarandet under användning av följande reagenser: Reagens 1.

K4P2OT/HC1-buffert (30 till 50 mmol/liter, pH BAD till 9,0), etanol (0,3 'C111 2 moi/liter), NAD* ( e 0,5 mmoi/liter), kataias ur nötlever (à 500 kU/liter), aldehyddehydrogenas från jäst (e 500 U/liter). ' Reagens 2.

Urikas ur svinlever (= 1,6 X 105 U/liter).

Genomföring av bestämningen Mätstrålning: Hg 334 nm, 340 nm, Hg 365 nm; skikttjocklek: l cm; inkubationstemperatur: rumstemperatur. 2,0 ml av reagens 1 pipetteras i kyvetten, 0,1 ml prov tillsättes och blandas. Extinktionen registreras under ca 3 min, tidpunkt för tillsats av reagens 2 extrapoleras och El bestämmes. kyvettens 10 15 7803056-6 6 10 p/liter av reagens 2 tillblandas. Extinktionen registreras ca 2 till 10 min, och genom extrapolering av tidpunkten för till- sats av reagens 2 bestämmes E22.

Beräkning av koncentrationen (c) av urinsyra i serum: c = (EQ-El) . 3,41 moi/liter (,\= Hg 3314 nm) c = (E2-El) . 3,35 mmol/liter (Å\= Hg 340 nm) å e = (EE-El) . óßommol/iiter t(,\ = Hg 365 nm, NAD) i e = (EE-El) . 6,03 moi/liner (Ä = Hg 365 nm, NADP) i Provmaterial § Serum; plasma, utspädd urin. (_ Vid det enligt beskrivningen ovan genomförda förfarandet insattes av följande tabell framgående tillsatsämnen enligt uppfinningen. Tabellen anger slaget av det använda provmateri- alet, det insatta koenzymet, användningen av tillsatsmedel ävensom den ospecifika extinktionsändringen (krypreaktion) i E per min. Exemplen 1, 4, 6, 8, 10, 13, 17, 22, 2Ä och 26 är jämförelseexempel och de övriga.exemplen åskådliggör uppfinningen. 7803056-'6 7 Exempel Prov Koenzym Tillsatsmedel Krypreaktion nr (mol/liter) A E/min l Uremikerserum nr 1 NAD - + 0,004 2 Uremikerserum nr 1 NAD pyrazol 0,000 (0,05-0,3) 3 Uremikerserum nr 1 NAD pyridin 0,000 (0,05-0,20) 4 Uremikerserum nr 2 NAD - + 0,002 5 Uremikerserum nr 2 NAD 4-metylpyrij 0,000 ann (o,1-o,3)- 6 Uremikerserum nr 3 NAD - + 0,003 7 Uremikerserum nr 3 NAD a)pyrazo1 0,001 <0,05-0,15) b) nafcrium- 0,000 oxalat (0,05-0,15) 8 Uremikerserum nr 4 NAD - + 0,002 9 ' Uremikerserum nr 4 NAD trikloretanol 0,000 (0,01-0,07) 10 Uremikerserum nr 5 NAD - - 0,003 ll Uremikerserum nr 5 NAD natriumoxalat 0,000 (O:O5"O: 12 Uremikerserum nr 5 NAD malonsyra- 0,000 monoetyl- ester (K-salt) (0,05-0,15) ' 13 ' Uremikerserum nr 6 NAD - + 0,003 14 Uremikerserum nr 6 NAD a) pyrazol 0,001 (0,05-0,15 b)ma1onsyra- 0,000 monoety1~ ester EK- saltš 0,05- 0,15 15 Uremikerserum nr 6 NAD a) pyrazol 0,001 (O: O5'O: b) pyriain o,ooo (0,05-0,10) 16 Uremikerserum nr 6 NAD tiokarbamid 0,000 (0,1-0,2) 17 Uremikerserum nr 6 NADP - + 0,002 18 Uremikerserum nr 6 NADP trikloretanol 0,000 (0.o1-0,07) 19 Uremixerserum nr 6 NADP a) pyrazol 0,001 (0,05-0,15) b) malonsyraf 0,000 monoetyl- ester (K- salt (0,05-O,l?) 10 7803056-6 8 Exempel Prov Koenzym Tillsatsmedel Krypreaktiøn nr (mol/liter) A E/min 20 Uremikerserum nr 6 NADP a) pyrazol 0,001 (0,05-0,15) b) natriumoxa- 0,000 lat (o,o5- 0,15) 21 Uremikerserum nr 6 NADP a) pyrazol 0,001 ~ (o: o5fo: 1-5) b) pyridín 0,000 (0,05-0,10) 22 Uremikerserum nr 7 NADP - + 0,003 23 Uremikerserum nr 7 NADP a)triklor- 0,001 etanol . _ (o:Ûl-O;O7) b) malonsyra- 0,000 monoetyl- ester K-salt _ (O, 1 24 Uremikerserum nr 8 NAD - + 0,002 25 Uremikerserum nr 8 NAD EDTA (0,05- 0,000 0,20) _ 26' Serum nr 9 NAD - + 0,001 27 Serum nr 9 NAD isobutyramid 0,000 0 (0,1-0,3) + = Extinktionsökning - = Extinktionsminskning Av exemplen 1 till 27 framgår, att enligt uppfinningen den störande krypreaktionen fullständigt kan undertryckas oberoende av, om det därvid rör sig om en extinktionsökning eller extink- tionsminskning.

Exempel 28.

För urinsyrabestämning på kinetisk bas kan följande rea- gens insättas.

K4P207/Hcl-buffert (30 till 50 mmol/liter, pH 8,0 till 9,0), etanol (0,3 till 2 mel/liter), NAD* (e 0,5 mmol/liter), katalas ur nötlever (à 500 kU/liter), aldehyddehydrøgenas ur jäst (à 500 U/liter), urikas (470 till 710 U/liter, xantin, K-salt (180 till 240 ymol/liner). “ 10 15 20 7803056~6 Genomföring av bestämningen Genomföring av analysen sker enligt kinetiska "fixed- nme-förfarandec" (Jämför Dr-os 25 58 536,8) under användning av "GEMSAEC" snabbanalysator.

Mätstrålning: 340 nm; inkubationstemperatur 2500.

Prov resp. standard 50 pl NaC1-lösning, 0,9 % 200 pl Reagens 500 pl Den första.aNläsningen El göres 35 till 100 s efter reak- tionsstarten och den andra avläsningen E2 150 till 200 s senare. Under beaktande av en standardberäkning uträknar auto- matens matematikmaskin urinsyrakoncentrationen (cprov) enligt formeln: cstandard '(E2'El)prov cprov = (E2'El)standard mmol/liter _ Material för undersökning Serum, plasma, utspädd urin.

Genomföringen av undersökningarna skedde analogt med exemplen l till 27 med och utan användning av tillsatsmedlen enligt uppfinningen. Resultaten motsvarade därvid fullstän- digt de, som erhölls med motsvarande tillsatser enligt exemplen l till 27. -----~~-_-_-____--_-

Claims (5)

7803056-6' fv Patentkrav

1. Förfarande för bestämning av urinsyra i biologiskt material medelst urikas, katalas och aldehyddehydrogenas i när- varo av alkohol och níkotinamid-adenin-dinukleotid resp. -fosfat [NAD(PIY, k ä n n e t e c k n a t därav, att minst en förening ur gruppen oxalsyra, malonsyramono(lâg)alkylester, trihalogen- etanol, eventuellt med en till flera lågalkylgrupper eller/och halogenatomer substituerad pyrazol eller pyridín, eventuellt med en lågalkylgrupp substituerad pyridinkarbonsyra, dess amid eller lågalkylester, tiokarbamid, isobutyramid eller nitrilotriättik- syra eller etylendiamintetraättiksyra tillsättes i en mängd av 0,005 till 0,5 mol/liter. '

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att minst ett tillsatsmedel ur gruppen oxalat och malon- syramono(lâg)alkylester tillsammans med minst ett tillsatsmedel ur gruppen tiokarbamíd, isobutyramid, komplexbildare tillsättes de substituerade pyrazolerna, pyridinerna eller pyridínkarbon- syrorna.

3. Förfarande enligt ett av föregående krav, k ä n n e - t e c k n a t därav, att man arbetar vid pH-värden av 8,0 till 9,0.

4. Reagens för bestämning av urinsyra, innehållande urikas, katalas, aldehyddehydrogenas, alkohol, NAD(P) och buffert, k ä n n e t e c k n a t därav, att det innehåller minst en för- ening ur gruppen oxalat, malonsyramono(låg)alkylester, trihalogen- etanol, eventuellt med en eller flera lågalkylgrupper eller/och halogenatomer substituerad pyrazol eller pyridin, eventuellt med en lågalkylgrupp substituerad pyrídinkarbonsyra, dess amid eller lågalkylester, tiokarbamid, isobutyramid eller nitrilotriättik- syra eller etylendiamintetraättiksyra i en mängd av 0,005 till 0,5 mol/liter.

5. Reagens enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t därav, ett det innehåller te 1 x 10.2 till 1 x 103 u/liter urlkee, 500 till 1500 kU/liter katalas, 500 till 1000 U/liter aldehyddehydro- genas, 0,3 till 2 mol/liter etanol, 0,5 till 1,5 mmol/liter NAD+ eller NAmW, 20 liter 100 mmel/llter buffert pu 8,0 till 9,0 och 0,05 till 0,5 mmol/liter tillsatsmedel enligt uppfinningen.