CN114908139B - 线粒体异柠檬酸脱氢酶的活性检测系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种线粒体异柠檬酸脱氢酶的活性检测系统及其应用。系统包括：提取液一：包括蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和缓冲液一；提取液二：包括蛋白酶抑制剂溶液；提取液三：包括表面活性剂和缓冲液一；试剂一：包括氯化镁、异柠檬酸和缓冲液一；试剂二：包括烟酰胺腺嘌呤双核苷酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、牛血清白蛋白、叠氮钠、乙二胺四乙酸二钠和蒸馏水；试剂三：包括2,4‑二硝基苯肼、盐酸和蒸馏水；试剂四：包括水溶性无机碱和蒸馏水；标准品：包括α‑酮戊二酸和蒸馏水；以及分光光度计或者酶标仪。本发明系统还具有准确度、精密度高、稳定性好等优势。

Description

线粒体异柠檬酸脱氢酶的活性检测系统及其应用
技术领域
本发明涉及生化检测领域，具体而言，涉及一种线粒体异柠檬酸脱氢酶的活性检测系统及其应用。
背景技术
异柠檬酸脱氢酶是参与三羧酸循环最重要的酶之一，其催化异柠檬酸转化为α-酮戊二酸，是在三羧酸循环酶促反应中的限速步骤。根据异柠檬酸脱氢酶的2种辅酶-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP），分为NAD-依赖性异柠檬酸脱氢酶和NADP-异柠檬酸脱氢酶，其中，线粒体异柠檬酸脱氢酶为NAD-依赖性异柠檬酸脱氢酶，只存在于真核细胞里。
线粒体异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase, ICDHm），广泛存在于动物、植物的线粒体中，与线粒体基因表达及线粒体其他的功能有关，对生物体的整个生物的生命代谢有很大影响。其表达活性需要二价金属离子的参与，如镁离子、锰离子、铁离子、镊离子、锌离子和钴离子等金属离子，离子半径决定了反应效率，其中锰离子和镁离子是天然的配体，钙离子是抑制剂。
目前检测ICDHm的方法是NAD和异柠檬酸会被ICDHm催化生成NADH和α-酮戊二酸，通过检测NADH的生成量来计算酶活。但是NADH的变化通常比较小，尤其是当样本酶活性较小时，很容易发生逆反应或其他反应而产生负值变化。此反应物无颜色变化，无法从颜色变化上判断酶活。
发明内容
本发明旨在提供一种线粒体异柠檬酸脱氢酶的活性检测系统及其应用，以提供一种准确、便捷测定线粒体异柠檬酸脱氢酶活性的方法。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种线粒体异柠檬酸脱氢酶的活性检测系统。该活性检测系统包括： 提取液一：包括蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和缓冲液一；提取液二：包括蛋白酶抑制剂溶液；提取液三：包括表面活性剂和缓冲液一；试剂一：包括氯化镁、异柠檬酸和缓冲液一；试剂二：包括烟酰胺腺嘌呤双核苷酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、牛血清白蛋白、叠氮钠、乙二胺四乙酸二钠和蒸馏水；试剂三：包括2,4-二硝基苯肼、盐酸和蒸馏水；试剂四：包括水溶性无机碱和蒸馏水；标准品：包括α-酮戊二酸和蒸馏水；以及分光光度计或者酶标仪，设置为检测505nm下的吸光度。
进一步地，提取液一由0.1~0.5g蔗糖、1~5 mg 乙二胺四乙酸二钠、0.1~1g 氯化钠、0.01~0.1g 牛血清白蛋白、0.1~1g 聚乙烯吡咯烷酮和50mL pH为7.0~7.4之间的缓冲液一组成。
进一步地，提取液二包括选自由苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸二钠、亮抑蛋白酶肽、抑糜朊酶素、(3S)-7-氨基-1-氯-3-磺酰氨基-2-庚酮盐酸盐和L-1，4'-甲基磺酰基-2-苯基乙基氯甲基酮组成的组中的一种或多种，浓度为0.1~1mol/L。
进一步地，提取液三由10~50μL表面活性剂和50mL pH为7.0~7.4之间的缓冲液一组成；表面活性剂为曲拉通X-100、吐温80和聚乙二醇中的一种或多种。
进一步地，试剂一由10~20mg氯化镁、2~20mg异柠檬酸和50mL pH为7.0~7.4之间的缓冲液一组成。
进一步地，缓冲液一为 pH值为中性的缓冲液，优选为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、磷酸盐缓冲液或4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液；更优选的，缓冲液一为0.01~0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液。
进一步地，试剂二由5~30mg烟酰胺腺嘌呤双核苷酸、0.1~1g磷酸氢二钾、0.05~0.5g磷酸二氢钾、0.1~1g牛血清白蛋白、0.01~0.1g叠氮钠、0.005~0.05g乙二胺四乙酸二钠和50mL蒸馏水组成；可选的，磷酸氢二钾由磷酸氢二钠代替，磷酸二氢钾由磷酸二氢钠代替；优选的，试剂三由10~50mg 2,4-二硝基苯肼、2~10mL盐酸和20mL蒸馏水组成；优选的，试剂四由2~20g水溶性无机碱和50mL蒸馏水组成；可选的，水溶性无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾和/或碳酸钠中一种或多种；优选的，标准品由5~20mg α-酮戊二酸和1mL蒸馏水组成。
根据本发明的另一方面，提供了一种上述任一种线粒体异柠檬酸脱氢酶的活性检测系统在线粒体异柠檬酸脱氢酶活性检测中的应用。
进一步地，包括以下步骤：利用标准品绘制标准曲线；对待测样本和对照样本进行吸光度测定，根据待测样本和对照样本的吸光度对应标准曲线计算出生成的α-酮戊二酸的产量，进而计算出线粒体异柠檬酸脱氢酶活性。
进一步地，包括以下步骤：将标准品稀释成不同浓度，分别和试剂一、试剂二、试剂三混合反应，再加入试剂四发生颜色反应，最后测定在505nm下的吸光度，根据稀释的不同浓度的标准品和对应的吸光度绘制标准曲线；在待测样本中加入提取液一冰浴匀浆，离心取上清，将上清离心取沉淀加入提取液二和提取液三，超声波破碎，记为粗酶液；在粗酶液中加入试剂一、试剂二发生酶促反应，再加入试剂三反应，再加入试剂四显色，最后测定505nm下的吸光度；同时设置对照：用蒸馏水替代试剂二进行测定吸光度，根据两个吸光度的差值对照标准曲线算出生成的α-酮戊二酸的产量，从而计算线粒体异柠檬酸脱氢酶活性。
应用本发明的技术方案，通过检测由酶促反应生成的α-酮戊二酸发生显色反应的红棕色产物计算出线粒体异柠檬酸脱氢酶活力高低，消除酶活低时逆反应的影响，使酶活可视化，同时本发明系统还具有准确度、精密度高、稳定性好等优势。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
为了提供一种准确、便捷测定线粒体异柠檬酸脱氢酶活性的方法，本发明提出了下列技术方案。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种线粒体异柠檬酸脱氢酶的活性检测系统。该活性检测系统包括： 提取液一：包括蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和缓冲液一；提取液二：包括蛋白酶抑制剂溶液；提取液三：包括表面活性剂和缓冲液一；试剂一：包括氯化镁、异柠檬酸和缓冲液一；试剂二：包括烟酰胺腺嘌呤双核苷酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、牛血清白蛋白、叠氮钠、乙二胺四乙酸二钠和蒸馏水；试剂三：包括2,4-二硝基苯肼、盐酸和蒸馏水；试剂四：包括水溶性无机碱和蒸馏水；标准品：包括α-酮戊二酸和蒸馏水；以及分光光度计或者酶标仪，设置为检测505nm下的吸光度。
应用本发明的技术方案，通过检测由酶促反应生成的α-酮戊二酸发生显色反应的红棕色产物计算出线粒体异柠檬酸脱氢酶活力高低，消除酶活低时逆反应的影响，使酶活可视化，同时本发明系统通过检测505nm下的吸光度，还具有准确度、精密度高、稳定性好等优势。
为了进一步提高系统检测的准确度、精密度高或稳定性，在本发明一实施方式中，申请人对系统中的试剂做了进一步优化，包括提取液一由0.1~0.5g 蔗糖、1~5 mg 乙二胺四乙酸二钠、0.1~1g 氯化钠、0.01~0.1g 牛血清白蛋白、0.1~1g 聚乙烯吡咯烷酮和50mLpH为7.0~7.4之间的缓冲液一组成。提取液二包括选自由苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸二钠、亮抑蛋白酶肽、抑糜朊酶素、(3S)-7-氨基-1-氯-3-磺酰氨基-2-庚酮盐酸盐和L-1,4'-甲基磺酰基-2-苯基乙基氯甲基酮组成的组中的一种或多种，浓度为0.1~1mol/L。提取液三由10~50μL表面活性剂和50mL pH为7.0~7.4之间的缓冲液一组成；表面活性剂为曲拉通X-100、吐温80和聚乙二醇中的一种或多种。试剂一由10~20mg氯化镁、2~20mg异柠檬酸和50mLpH为7.0~7.4之间的缓冲液一组成。缓冲液一为pH值为中性的缓冲液，优选为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、磷酸盐缓冲液或4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液；更优选的，缓冲液一为0.01~0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液。试剂二由5~30mg烟酰胺腺嘌呤双核苷酸、0.1~1g磷酸氢二钾、0.05~0.5g磷酸二氢钾、0.1~1g牛血清白蛋白、0.01~0.1g叠氮钠、0.005~0.05g乙二胺四乙酸二钠和50mL蒸馏水组成；可选的，磷酸氢二钾由磷酸氢二钠代替，磷酸二氢钾由磷酸二氢钠代替；优选的，试剂三由10~50mg 2,4-二硝基苯肼、2~10mL盐酸和20mL蒸馏水组成；优选的，试剂四由2~20g水溶性无机碱和50mL蒸馏水组成；可选的，水溶性无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾和/或碳酸钠中一种或多种；优选的，标准品由5~20mg α-酮戊二酸和1mL蒸馏水组成。这些组分相互支持相互影响，作为一个有机的整体，使得系统具有非常好的准确度、精密度和稳定性。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种上述线粒体异柠檬酸脱氢酶的活性检测系统在线粒体异柠檬酸脱氢酶活性检测中的应用。
典型的，该应用包括以下步骤：利用标准品绘制标准曲线；对待测样本和对照样本进行吸光度测定，根据待测样本和对照样本的吸光度对应标准曲线计算出生成的α-酮戊二酸的产量，进而计算出线粒体异柠檬酸脱氢酶活性。在本发明一实施方式中，该应用，包括以下步骤：将标准品稀释成不同浓度，分别和试剂一、试剂二、试剂三混合反应，再加入试剂四发生颜色反应，最后测定在505nm下的吸光度，根据稀释的不同浓度的标准品和对应的吸光度绘制标准曲线；在待测样本中加入提取液一冰浴匀浆，离心取上清，将上清离心取沉淀加入提取液三和提取液二，超声波破碎，记为粗酶液；在粗酶液中加入试剂一、试剂二发生酶促反应，再加入试剂三反应，再加入试剂四显色，最后测定505nm下的吸光度；同时设置对照：用蒸馏水替代试剂二进行测定吸光度，根据两个吸光度的差值对照标准曲线算出生成的α-酮戊二酸的产量，从而计算线粒体异柠檬酸脱氢酶活性。
在本发明一实施例中，该应用具体包括：
步骤一：将标准品稀释成不同浓度，将其和试剂一、试剂二试剂三混合反应，再加入试剂四发生颜色反应，最后测定在505nm下的吸光度，以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的吸光度为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b；
步骤二：在样本中加入提取液一冰浴匀浆，离心去上清，取沉淀加入提取液三和提取液二，超声波破碎，记为粗酶液。在粗酶液中加入试剂一、试剂二发生酶促反应，再加入试剂三反应，再加入试剂四显色，最后测定505nm下的吸光度；
步骤三：同时设置对照：用蒸馏水替代试剂二进行步骤二测定吸光度，根据两个吸光度的差值带入上述步骤一中的标准曲线得到x，从而计算线粒体异柠檬酸脱氢酶活性；
步骤四：将线粒体异柠檬酸脱氢酶活性定义为：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1 nmol α-酮戊二酸定义为一个酶活性单位，计算公式为：ICDHm（U/mg prot）= x×V样本÷（Cpr×V样本）÷T。其中V样本为反应中加入的样本体积，Cpr为样本的蛋白浓度，T为反应的酶促反应时间。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
检测线粒体异柠檬酸脱氢酶活性的系统的制备，包括以下步骤：
提取液一：称取0.2g蔗糖，2 mg 乙二胺四乙酸二钠，0.5 g 氯化钠，0.05g 牛血清白蛋白，0.8g 聚乙烯吡咯烷酮，加入50mL 0.08mol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液（pH7.4）溶液，4℃保存；
提取液二：称取30mg苯甲基磺酰氟加入10mL异丙醇，-20℃保存；
提取液三：吸取200μL表面活性剂加入50mL 0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液（pH7.4），4℃保存；
试剂一：称取12mg氯化镁、11mg异柠檬酸，加入50mL 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液（pH7.4）；
试剂二：称取25mg烟酰胺腺嘌呤双核苷酸（NAD）、0.58g磷酸氢二钾、0.075g磷酸二氢钾、0.5g牛血清白蛋白、0.08g叠氮钠、0.045g乙二胺四乙酸二钠，加入50mL蒸馏水混匀，4℃保存；
试剂三：称取35mg 2,4-二硝基苯肼，加入8mL盐酸和20mL蒸馏水，4℃保存；
试剂四：称取8g氢氧化钠，加入50mL蒸馏水混匀；
标准品：称取14.6 mg α-酮戊二酸，加入1 mL蒸馏水，配成100 mmol/L标准液，4℃保存。
实施例2
为验证本发明系统的检测准确度、可行性和精密度，本实施例以本发明的系统和传统方法测定已知酶活性的异柠檬酸脱氢酶来进行对比。
步骤一：按上述实施例1配制相关试剂。
步骤二：将标准品用提取液三稀释至0.6、0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875 μmol/mL，取0.2mL不同浓度的标准溶液和0.4mL试剂一、0.05mL试剂二和0.15mL试剂三混合37℃反应1h，待至少反应30min再加入0.4mL试剂四显色（显色后颜色不再变化即可），最后测定在505nm下的吸光度，以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的吸光度为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b。
步骤三：将20U/mg异柠檬酸脱氢酶（sigma公司订购）用提取液三稀释0.5、2、20U/mg 不同酶活性。分别取0.2mL加入0.4mL试剂一、0.05mL试剂二发生37℃反应1h，待至少反应30min再加入0.15mL试剂三37℃反应10min，再加入0.4mL试剂四显色（显色后颜色不再变化即可），最后测定505nm下的吸光度；每个样本做3次重复。
步骤四：同时设置对照：用蒸馏水替代试剂二进行步骤二测定吸光度A2，根据两个吸光度的差值（A1-A2）带入上述步骤一中的标准曲线得到x，从而计算线粒体异柠檬酸脱氢酶活性。
步骤五：将线粒体异柠檬酸脱氢酶活性定义为：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1 nmol α-酮戊二酸定义为一个酶活性单位，计算公式为：线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm）（U/mg prot）= x×V样本÷（Cpr×V样本）÷T。其中V样本为反应中加入的样本体积，0.2mL；Cpr为样本的蛋白浓度；T为反应的酶促反应时间，1h。
以传统方法测定线粒体异柠檬酸脱氢酶，方法如下：将20U/mg异柠檬酸脱氢酶（sigma公司订购）用本发明实施例1中的提取液三稀释至0.5、2、20U/mg 不同酶活性，分别取0.2mL依次加入0.4mL本发明实施例中的试剂一、0.05mL本发明实施例中试剂二发生37℃反应1h，待至少反应30min测定并计算反应前后340nm吸光度的变化ΔA。将线粒体异柠檬酸脱氢酶活性定义为：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1 nmol α-酮戊二酸（即产生1nmol NADH）定义为一个酶活性单位，计算公式为：线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm）（U/mgprot）= ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷(V样本×Cpr)。其中V样本为反应中加入的样本体积，0.2mL；Cpr为样本的蛋白浓度；T为反应的酶促反应时间，1h；ε为NADH的摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d为光径，1cm；V反总为反应体系总体积，0.001L。
实验结果如表1：
表1
Figure 216915DEST_PATH_IMAGE001
如表1所示，当用本发明方法检测不同活性的线粒体异柠檬酸脱氢酶时，计算的酶活无显著差异并和实际活性相当，相对误差在±5~6% 之内，准确度较好，变异系数也在5%以内，精密度较好；用传统方法检测线粒体异柠檬酸脱氢酶，计算结果和真实值相差很大，酶活性越低，误差越大，并且由于酶活低时容易引起逆反应还会出现负值；由于测得的结果是由时间段的吸光度差值得来，开始和结束时间不准确也会造成实验重复性不好，变异系数大，综合而言，本发明检测方法可以更为真实的测定线粒体异柠檬酸脱氢酶活性，并且具有较好的准确度和精密度。
以下实施例中，动物样本1代表小鼠肾脏；动物样本2代表小鼠肝脏、植物样本1代表黑麦草叶片、植物样本2代表拟南芥叶片。
实施例3
检测线粒体异柠檬酸脱氢酶活性的系统的应用，包括以下步骤：
步骤一：按上述实施例1配制相关试剂。
步骤二：将标准品用提取液三稀释至0.6、0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875 μmol/mL，分别取0.2mL不同浓度的标准溶液和0.4mL试剂一、0.05mL试剂二和0.15mL试剂三混合37℃反应1h，待至少反应30min再加入0.4mL试剂四显色（显色后颜色不再变化即可），最后测定在505nm下的吸光度，以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的吸光度为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b。
步骤三：取3份0.1g动物样本1、3份0.1g动物样本2，3份0.1g植物样本1、3份0.1g植物样本2，分别加入1mL提取液一冰浴匀浆，离心弃上清液，取沉淀加入0.6mL提取液三和0.006mL提取液二，超声波破碎，记为粗酶液。在不同的粗酶液中分别加入0.4mL试剂一、0.05mL试剂二发生37℃反应1h，待至少反应30min再加入0.15mL试剂三37℃反应10min，再加入0.4mL试剂四显色（显色后颜色不再变化即可），最后测定505nm下的吸光度A1；
步骤四：同时设置对照：用蒸馏水替代试剂二进行步骤二测定吸光度A2，根据两个吸光度的差值（A1-A2）带入上述步骤一中的标准曲线得到x，从而计算线粒体异柠檬酸脱氢酶活性。
步骤五：将线粒体异柠檬酸脱氢酶活性定义为：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1 nmol α-酮戊二酸定义为一个酶活性单位，计算公式为：ICDHm（U/mg prot）= x×V样本÷（Cpr×V样本）÷T。其中V样本为反应中加入的样本体积，0.2mL；Cpr为样本的蛋白浓度；T为反应的酶促反应时间，1h。
实验结果如表2：
表2
Figure 432258DEST_PATH_IMAGE002
实施例4
本实施例进行加标实验以验证本发明方法的可靠性和提取方式的准确性。
步骤一：按上述实施例1配制相关试剂。
步骤二：将标准品用提取液三稀释至0.6、0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875 μmol/mL，分别取0.2mL不同浓度的标准溶液和0.4mL试剂一、0.05mL试剂二和0.15mL试剂三混合37℃反应1h，待至少反应30min再加入0.4mL试剂四显色（显色后颜色不再变化即可），最后测定在505nm下的吸光度，根据稀释的不同浓度的标准品和对应的吸光度绘制标准曲线。
步骤三：测定样本中的本身存在的线粒体异柠檬酸脱氢酶活性，其实验步骤同实验实施例中3的步骤三、步骤四和步骤五；
步骤四：取3份0.1g动物样本1（小鼠肾脏），分别加入0.5、2、5U异柠檬酸脱氢酶（sigma公司订购）；3份0.1g动物样本2（小鼠肝脏），分别加入0.5、2、5U异柠檬酸脱氢酶（sigma公司订购）；3份 0.1g植物样本1（黑麦草叶片），分别加入0.5、2、5U异柠檬酸脱氢酶（sigma公司订购）；3份0.1g植物样本2（拟南芥叶片），分别加入0.5、2、5U异柠檬酸脱氢酶（sigma公司订购），按照实施例3中的步骤三、步骤四、步骤五来测定，计算加标回收率。
实验结果如下表3：
表3
Figure 743154DEST_PATH_IMAGE003
如表3所示，本发明的加标回收率均在96%-105% 以内，偏差均在5%以内，说明该方法可靠合适，并且提取方式有效，能够将样本内的线粒体异柠檬酸脱氢酶全部提取出来。
实施例5
本实施例通过使用存放了不同时间的本系统测定线粒体异柠檬酸脱氢酶活性以验证本发明方法良好的稳定性。
步骤一：按实施例2中本发明的系统进行检测。
步骤二：将提取液一、提取液二、提取液三、试剂一、试剂二、试剂三、试剂四、标准品分别放于4℃、-20℃、4℃、4℃、-20℃、4℃、4℃保存。
步骤三：将上述所有试剂按时间0天、1个月、2个月、4个月、8个月、12个月取出并进行实验。按本发明专利实施例2步骤进行实验，对比不同存放时间的数据变化，已验证本系统的稳定性。
实验结果如下表4：
表4
Figure 935101DEST_PATH_IMAGE004
如表4所示，当用本发明方法检测不同酶活性的线粒体异柠檬酸脱氢酶时，本发明系统放置0天、1个月、2个月、4个月、8个月、12个月的数值无显著差异并和实际活性相当，相对误差在±6% 之内。本系统至少可以保存一年，稳定性良好。
实施例6
本实施例验证本发明方法良好的重复性
步骤一：按上述实施例1配制相关试剂。
步骤二：批内重复试验：选取实施例3中的动物样本1，取10份0.1g 动物样本1使用相同方法、同批试剂、相同的实验操作人员和同一仪器连续10天每天测定一份动物样本1测定线粒体异柠檬酸脱氢酶活性，其实验步骤同实验实施例中的步骤二、步骤三、步骤四和步骤五。
步骤三：批间重复试验：选取实施例3中的动物样本1，取10份0.1g 动物样本1使用相同方法、相同的实验操作人员和同一仪器连续10天每天测定一份动物样本1的线粒体异柠檬酸脱氢酶活性，每次所使用试剂均为当天新配制，其实验步骤同实验实施例中的步骤三、步骤四和步骤五。
批内重复性实验结果如下表5：
表5
Figure 280631DEST_PATH_IMAGE005
批间重复性实验结果如下表6：
表6
Figure 634252DEST_PATH_IMAGE006
如表5和表6所示，用本发明方法进行批内重复性试验和批间重复性试验时，标准偏差很小，标准偏差在9%以内，变异系数在4% 之内，说明本系统有良好的批内重复性和批间重复性，本系统精密度高。
实施例7
本实施例进行对本发明方法和紫外比色（309nm）方法进行的对比实验。
本发明方法：
步骤一：取3份0.1g动物样本1（同实施例2）、3份0.1g动物样本2（同实施例2）、3份0.1mL正常人血清样本1、3份0.1mL正常人血清样本2、3份0.1mL肝硬化病人血清样本3、肝硬化病人血清样本4，按照上述实验实施例3进行实验。
步骤二：取步骤一中相同样本按照紫外比色（309nm）方法进行实验，实验方法见表7。
表7
Figure 635706DEST_PATH_IMAGE007
实验原理
ICD被锰离子激活后，在辅酶Ⅱ参与下，催化异柠檬酸的脱氢、脱羟反应，产生α一酮戊二酸与2.4一二硝基苯肼形成苯腙，在碱性溶液中比色，其浓度与样品中 ICD 活性成正比。
试剂
1. 辅酶II（NADPH）溶液称取辅酶II 50毫克，溶于 10ml 0.9%生理盐水中，4℃冰箱存放。
2. Tris -HCl缓冲液PH 7.5，4℃冰箱存放。
3. 底物缓冲液称取1.0克异柠檬酸三钠，用Tris缓冲液溶解到50毫克升容量瓶内，4℃冰箱存放。
4. 0.9%生理盐水。
5. MnCl2溶液 称MnCl2-4H2O 0.6克用0.9%生理盐水溶解到100毫升容量瓶内备用。
6. 底物应用液 临用前将试剂3、4、5以5：3：1混合即可。
7. EDTA溶液 称EDTA·Na2 6.4克用蒸馏水溶至100毫升。
8. 2，4一二硝基苯肼。
9. 0.4N NaOH。
10. α-酮戊二酸标准液(1ml=0.5μmol)，精称α-酮戊二酸73毫克，用蒸馏水定溶到100毫升容量瓶内，用前做10倍稀释。
实验结果如下表8：
表8
Figure 896924DEST_PATH_IMAGE008
如表8所示，当用本发明方法检测不同样本的线粒体异柠檬酸脱氢酶时，计算的酶活无显著差异，变异系数大概在0.9%-6%之间；用紫外比色（309nm）法检测线粒体异柠檬酸脱氢酶，计算结果不稳定，同一样本实验结果相差很大，尤其酶活性越低，误差越大，变异系数在4%-11%之间；由于测得的结果是由时间段的吸光度差值得来，开始和结束时间不准确也会造成实验重复性不好，变异系数大。综合而言，本发明检测方法实验结果更为稳定，并且检测波长在可见光区，可以对实验结果进行定性，而紫外比色法检测波长在紫外光区，无法通过肉眼进行定性。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
1）检测2,4-二硝基苯肼和酶促反应生成的α-酮戊二酸的红棕色产物（在505nm处有吸光度变化）可以计算出线粒体异柠檬酸脱氢酶活力高低，检测该产物在505nm处吸光值的变化可以避免酶活较低时产生负值，也可以让数值变化更明显，使得实验结果准确可靠。
2）此反应为显色反应，相较于传统的无颜色变化的测定方法，能从颜色变化、深浅上对酶活有初步的判断，既可以进行定性，亦可以进行定量。
3）所述系统稳定性、精密度和准确度均良好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (18)

1.一种线粒体异柠檬酸脱氢酶的活性检测系统，其特征在于，包括：
提取液一：包括蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和缓冲液一；
提取液二：包括蛋白酶抑制剂溶液；
提取液三：包括表面活性剂和缓冲液一；
试剂一：包括氯化镁、异柠檬酸和缓冲液一；
试剂二：包括烟酰胺腺嘌呤双核苷酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、牛血清白蛋白、叠氮钠、乙二胺四乙酸二钠和蒸馏水；
试剂三：包括2,4-二硝基苯肼、盐酸和蒸馏水；
试剂四：包括水溶性无机碱和蒸馏水；
标准品：包括α-酮戊二酸和蒸馏水；以及
分光光度计或者酶标仪，设置为检测505nm下的吸光度。
2.根据权利要求1所述的活性检测系统，其特征在于，所述提取液一由0.1~0.5g蔗糖、1~5 mg 乙二胺四乙酸二钠、0.1~1g 氯化钠、0.01~0.1g 牛血清白蛋白、0.1~1g 聚乙烯吡咯烷酮和50mL pH为7.0~7.4之间的缓冲液一组成。
3.根据权利要求1所述的活性检测系统，其特征在于，所述提取液二包括选自由苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸二钠、亮抑蛋白酶肽、抑糜朊酶素、(3S)-7-氨基-1-氯-3-磺酰氨基-2-庚酮盐酸盐和L-1,4'-甲基磺酰基-2-苯基乙基氯甲基酮组成的组中的一种或多种，浓度为0.1~1mol/L。
4.根据权利要求1所述的活性检测系统，其特征在于，所述提取液三由10~50μL表面活性剂和50mL pH为7.0~7.4之间的缓冲液一组成。
5.根据权利要求4所述的活性检测系统，其特征在于，所述表面活性剂为曲拉通X-100、吐温80和聚乙二醇中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的活性检测系统，其特征在于，所述试剂一由10~20mg氯化镁、2~20mg异柠檬酸和50mL pH为7.0~7.4之间的缓冲液一组成。
7.根据权利要求1所述的活性检测系统，其特征在于，所述缓冲液一为 pH值为中性的缓冲液。
8.根据权利要求7所述的活性检测系统，其特征在于，所述缓冲液一为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、磷酸盐缓冲液或4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液。
9.根据权利要求8所述的活性检测系统，其特征在于，所述缓冲液一为0.01~0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液。
10.根据权利要求1所述的活性检测系统，其特征在于，所述试剂二由5~30mg烟酰胺腺嘌呤双核苷酸、0.1~1g磷酸氢二钾、0.05~0.5g磷酸二氢钾、0.1~1g牛血清白蛋白、0.01~0.1g叠氮钠、0.005~0.05g乙二胺四乙酸二钠和50mL蒸馏水组成。
11.根据权利要求10所述的活性检测系统，其特征在于，所述磷酸氢二钾由磷酸氢二钠代替，所述磷酸二氢钾由磷酸二氢钠代替。
12.根据权利要求1所述的活性检测系统，其特征在于，所述试剂三由10~50mg 2,4-二硝基苯肼、2~10mL盐酸和20mL蒸馏水组成。
13.根据权利要求1所述的活性检测系统，其特征在于，所述试剂四由2~20g水溶性无机碱和50mL蒸馏水组成。
14.根据权利要求13所述的活性检测系统，其特征在于，所述水溶性无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠中一种或多种。
15.根据权利要求1所述的活性检测系统，其特征在于，所述标准品由5~20mg α-酮戊二酸和1mL蒸馏水组成。
16.一种如权利要求1至15中任一项所述的线粒体异柠檬酸脱氢酶的活性检测系统在线粒体异柠檬酸脱氢酶活性检测中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
利用标准品绘制标准曲线；
对待测样本和对照样本进行吸光度测定，根据所述待测样本和对照样本的吸光度对应所述标准曲线计算出生成的α-酮戊二酸的产量，进而计算出线粒体异柠檬酸脱氢酶活性。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
将标准品稀释成不同浓度，分别和试剂一、试剂二、试剂三混合反应，再加入试剂四发生颜色反应，最后测定在505nm下的吸光度，根据稀释的不同浓度的标准品和对应的吸光度绘制标准曲线；
在待测样本中加入提取液一冰浴匀浆，离心取上清，将上清离心取沉淀加入提取液二和提取液三，超声波破碎，记为粗酶液；
在粗酶液中加入所述试剂一、所述试剂二发生酶促反应，再加入所述试剂三反应，再加入试剂四显色，最后测定505nm下的吸光度；同时设置对照：用蒸馏水替代所述试剂二进行测定吸光度，根据两个吸光度的差值对照标准曲线算出生成的α-酮戊二酸的产量，从而计算线粒体异柠檬酸脱氢酶活性。
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