DE2606961C3 - Verfahren zum Extrahieren von Phenolen und Oligosacchariden aus pflanzlichem Gewebe - Google Patents

Description

Es ist bekannt, daß im Pflanzenreich phenolische und polyphenolische Verbindungen weit verbreitet sind und sich in freier Form oder gebunden an proteinische und glucidische Bestandteile in verschiedenen Teilen der Pflanzen finden, aber hauptsächlich in Samen, Blättern, Stengeln und Wurzeln (Loomis, W. D. und Battaile, J. Phytochemistry. 5, 423 (1966) und Pierpoint, W. S, Biochem. J, 112, 609 (1969)). Diese natürlichen Substanzen besitzen die Eigenschaft, daß sie zu Chinonen oxidiert werden und diese wieder in alkalischer Umgebung schnell polymerisieren und mit Proteinen unter Bildung kovalenter und Wasserstoffbrückenbindungen reagieren.

Die Oxidation von Phenolen zu Chinonen findet in Gegenwart von Sauerstoff statt, aber auch durch Einwirkung einiger Enzyme, wie Phenoloxidase, Peroxi· dase und anderen.

Die Anwendung von aus Pflanzen extrahierten Proteinen für die menschliche Ernährung ist stark beschränkt durch das Vorhandensein phenolischer Bestandteile aus den folgenden wirtschaftlichen und ernährungstechnischen Gründen:

Die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen den Phenolen und einigen essentiellen Aminosäuren, die in den Isofaten vorhanden sind, setzt deren Nährwert so stark herab, wie die neuen Kondensattonsverbindungen gebildet werden und auf diese Weise können die Aminosäuren vom Menschen nicht metabolisiert werden. So stellen die phenolischen Substanzen, wenn sie nicht entfernt werden, Antinährstoffaktoren dar.

Die schnelle Oxidation solcher Verbindungen verleiht daher entsprechend dem pH-Wert den Proteinen eine grün-braune Farbe, die sie als Nährstoffe ungeeignet macht

Das Vorhandensein phenolischer Bestandteile setzt die Möglichkeit, Protein zu extrahieren, herab aufgrund ihrer Wechselwirkung mit den Proteinen selbst.

Einige Phenole sind toxisch, z. B. Gossypol, ein Phenolbialdehyd, das in Baumwollsamen enthalten ist.

Die Verfahren, die bisher zur Entfernung derartiger Verbindungen aus pflanzlichen Mehlen bekannt sind, sind nicht zufriedenstellend, da sie keine Extraktion ermöglichen, die ausreicht, farblose Produkte herzustel len (Smith, A. IC, und Johnsen, V. L Ceral. Chem. 25,339 (1948) und Pomenta, J, V. und Burns, E P, J. Food ScL₁ 36,490 (1971) oder zur mehr oder weniger ausgeprägten Denaturierung von Proteinen führen (Gheyasudding, S_n Cater, C M. und Mattil, K. F, Food TechnoL, 24, 242

ίο (1970); Sosulski, F.W, Mc Cleary, CM. und Soliman, F. S, J. Food ScL, 37, 253 (1972)). In Biochem. Biophys. Acta, 16, 520 (1955) ist in sehr allgemeiner Form angegeben, daß Chlorogensäure aus Sonnenblumenmehl entfernt werden kann durch wiederholte Extrak- tion mit einem Gemisch aus gleichen Anteilen Äthanol und Wasser. Ober die spezielle Arbeitsweise ist nichts angegeben. Auch dieses Verfahren führt wie die oben genannten nicht zu den erwünschten farbloses: Produkten.

Verbindungen, die in pflanzlichen Mehlen ebenfalls als unerwünscht angesehen werden, sind die fermentierbaren Oligosaccharide (Raffinose, Stachiose, Verbascose usw.), die zu Blähungen führen und damit die Anwendbarkeit der Mehle und Proteinkonzentrate für

Produkte zur menschlichen Ernährung begrenzen.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem unter Bedingungen, die für die Proteine nicht denaturierend sind, die phenolischen Pigmente und fermentierbaren Oligosaccharide, die in den Pflanzen vorhanden sind, gleichzeitig wirksam extrahiert werden können und bei dem ein farbloses, für Nahrungszwecke geeignetes Produkt erhalten wird.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man die entsprechenden Pflanzenteile oder daraus gewonnene Produkte mit einem Lösungsmittel das einen pH-Wert von 2,0 bis 6,0 hat und aus dem organischen polaren Lösungsmittel und einer wäßrigen Lösung eines sauren Elektrolyten besteht, in einem Gesamtverhältnis gelöste Stoffe zu Lösungsmittel von 1 :5 bis 1 :240 bei einer

■to Temperatur im Bereich von 4° C bis zu der Temperatur, bei der eine Denaturierung der Proteine beginnt behandelt Als polares organisches Lösungsmittel wird vorzugsweise ein Alkohol, ein Keton oder ein Ester, insbesondere n-Butylalkohol, verwendet Der Elektrolyt ist günstigerweise eine anorganische Säure, insbesondere Salzsäure.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Diffusion von Substanzen mit einem niederen Molekulargewicht in einem polaren lösungsmittel durch die

Membranen der Zellen und subzellulk/en Organellen ausgenutzt Das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren ergibt direkt ein Proteinkonzentrat mit einem hohen biologischen Wert, das im wesentlichen frei von unerwünschten Verbindungen (Chlorogensäure, Gossy·

$5 pol, Raffinose, Stachiose usw.) und das geeignet ist zur

Herstellung von Proteinisolaten mit einer hohen Reinheit, einer Farbe von weiß bis creme in dem

gesamten Bereich löslicher Proteine.

Durch den Elektrolyt wird die Wechselwirkung

μ zwischen den Proteinen und Phenolen geschwächt, während die schwach saure Umgebung, wie sie durch den Elektrolyten erzeugt wird, die Löslichkeit der

Phenole erhöht. Von den pflanzlichen Mehlen, die Phenole und

fermentierbare Oligosaccharide enthalten, wurden Sonnenblumenmehl, Sojabohnenmehl und Baumwollsamenmehl einer Behandlung mit einer sauren Lösung in n-Butanol unterworfen.

Sonnenblumensamenmehl

Chlorogensäure ßß'-Coffeylchininsäure) macht ungefähr 70% der phenolischen Verbindungen von Sonnenblumen aus und ist in unterschiedlichen Arten der Samen in Konzentrationen im Bereich von 1 bis 7% vorhanden. Die restlichen 30% bestehen aus sieben bekannten Phenolsäuren (Isochlorogensäure, Coffeinsäure, p-Cumarsäure, Isoferulinsäure, Ferulinsäure, Sinapinsäure und trans-Zimtsäure) und einigen noch nicht identifizierten Verbindungen (Sabir, M. A, Sosulski, F. W, und Kernan, J. A_n J. Agr. Food Chem, 22,572, (1974)).

Die Verwendung von Proteinisolaten aus Sonnenblumenmehl für die menschliche Nahrung wird stark behindert durch das Vorhandensein von Chlorogensäure, die in der leicht alkalischen Umgebung, wie sie für die Extraktion der Proteine angewandt wird, zu Chinon oxidiert wird und sowohl den Auszügen als auch den Proteinisolaten eine Farbe verleiht, die je nach dem pH-Wert von grünes braun variiert.

Sojabohnenmehl

Bei Sojabohnenmehl sind die zu Blähungen führenden Antinährstoff-Faktoren die fermentierbaren Oligosaccharide, Raffinose und Stachiose (Rackis, J.], et aL, J. Food Sei, 35, 634 (197O)X die im .Mittel 40% der wasserlöslichen niedermolekularen Kohlenhydrate ausmachen. Diese Verbindungen treten auch in Proteinkonzentraten auf, aber nicht in den Isolaten, da sie während des Proteinextraktionsverfahrens entfernt werden.

Baumwollsamenmehl

Die Hauptbegrenzung für die Verwendung von Baumwollproteinen als Nährstoff beruh* darauf, daß in der Proteinfraktion ein toxischer phenolischer Aldehyd, Gossypol (1,1 ',e.e'^'-Hexahydroxy-S.S'-diisopropyl-3,3'-dimethyl-2,2'-dinaphthalin-8,8'-dicarlx>xyaldehyd) enthalten ist Von dem gesamten Gossypol reagiert ein Teil mit den Baumwollsamenproteinen und ein Teil findet sich in freier Form. Die toxische Wirkung von Gossypol verhindert die Verwendung von Baumwollsamenproteinen in Nahrungsmitteln.

Es sind verschiedene Verfahren zur Entfernung oder Deaktivierung von Gossypol bekannt (Vaccarino, C, ]. Amen Oil Chem. Soc, 38,143 (1961); Damaty, S. M. und Hudson, B. J. F, J. Sei, Food Agric. 26,109 (1975)) und einige dieser Verfahren sind wirksam, aber es werden nur Baumwollsamenmehle mit einem geringen Gossypolgehalt angewandt

Zur genaueren Erläuterung des erfindungsgemäOen Verfahrens wird in der folgenden Beschreibung auf einige Beispiele hingewiesen, die die Extraktion von Chlorogensäure und Raffinose aus Sonnenblumenöl, von Gossypol als Bauntwollsäfneninehl und von Raffinose und Stachiose aus Sojabohnenmehl betreffen. FUr diese Beispiele wurden die folgenden Materialien angewandt und die Verfahren entsprechend angepaßt

Materialien

Chlorogen und Goffeitisäure in reiner Form, Sucrose. Raffinose und Stachiose in reiner Form, reine Salzsäure, n-Butylalkohol und n-Hexan, (reines Reagens) als Lösungsmittel, Gossypol-Essigsäure wurde hergestellt durch Extraktion aus geschältem Baumwollsamen nach dem Verfahren von King, W. H. und Thurber, F. H, J. Am. Oil Chem. Soc. 30, 70 (1953) und besaß eine Reinheit von 98%.

Verfahren

Zm* Bestimmung von Stickstoff wurde nach dem Makro-Kjeldahl-Verfahren gearbeitet und der Wert für den Proteinstickstoff erhalten durch Multiplikation des Gesamtstickstoffes mit 6,25,

Der Feuchtigkeitsgehalt, die Lipide und Rohfaser wurden nach den Standardverfahren nach A. O. A. C (Association Official Analytical Chemists, 12. Ausgabe (1975)) bestimmt

Die Bestimmung der Chlorogensäure in Beispiel 1 wurde nur nach A. O. A. Q method 14.025,11. Ausgabe (1970) durchgeführt

Chlorogensäure, Coffeinsäure, Sucrose und Raffinose wurden in den Beispielen 2 und 3 mit Hilfe gascaromatographischer Verfahren als silylierte Derivate bestimmt (Sabir, M. A. Sosulski, F. W, und Kernan, J. A, J. Agr. Food Chem, 22, 572 (1974)), während Sucrose, Raffinose und Stachiose in Beispiel 5 auf die gleiche Weise bestimmt wurden. Die Analyse von freiem und Gesamt-Gossypol wurde nach dem Standardverfahren A.O.CS. (Official and Tentative Methods of the American Oil Chemists' Society, 3. Ausgabe (1972)) Ba 8-58 bzw. Ba 8-55 durchgeführt

Gaschromatographische Verfahren (GLC)

Herstellung der Proben: Phenolische Verbindungen und Oligosaccharide, wie sie in dem entfetteten Mehl und dem Proteinkonzentrat vorhanden sind, werden mit 80%igem wäßrigem Methanol im Verhältnis 1:100 Mehl/Lösungsmittel durch 5 Stunden langes Erhitzen unter Rückfluß extrahiert (Mikolajczak, K. L, Smith Jr, CR.und Wolff, I. A.(1970) J. Agr. Food Chem. 18,27). Der methanolische Auszug wird im Vakuum bei 40⁰C zur Trockne eingedampft Der trockene Rückstand wird mit HCl, pH 2,0, gelöst und die entstehende Lösung durch Zugabe von verdünnter MaOH auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt Die Leamg wird im Vakuum bei 40" C zur Trockne eingedampft Die phenolischen Verbindungen und Oligosaccharide werden bei Raumtemperatur mit wasserfreiem Methanol in einer abgemessenen Menge extrahiert Die Suspension wird zentrifugiert und eine Fraktion der überstehenden Flüssigkeit unter Stickstoffstrom in Reaktionsfläschchen bei Raumtemperatur zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit einer bekannten Menge N-Trimethylsilylimidazol durch Inkubieren bei 60° C

so innerhalb von 2 Stunden silyliert

Gaschromatographie: Die Gaschromatographie wurde mit Hilfe eines HP 7620 A Gaschromatographen durchgeführt, der mit einem automatischen Integrator versehen war. Die Versuchsbedingungen waren folgen· de:

Glassäule
Stationäre Phase

Injektor-Temperatur
Detektor-Temperatur
Säule

Trägergas

Fließgeschwindigkeit

Detektor

032 mm χ 1823 cm

OV' 1,3% auf Chromosorb

WHP 0,177/0,149 mm

300^eC

300-C

4 min 150⁰C,

150° C bis 260° C

mit6°C/min

30 min 260" C

Helium

35 ml/min

Flammenionisation

Im Falle von Sojabohnenmehl wurden dte Analysen der Oligosaccharide mit den folgenden Änderungen durchgeführt;

Säulen-Temperatur

4 min 15O⁰C, 150°Cbis250°C mit 6° C/ min 10 min 250⁰C,

Injektor-Temperatur Detektor-Temperatur

mitl5°C/mm

320° C bis 340° C mit

10°C/min,

30 min 340° C

350⁰C

350⁰C

Die o-Biphenole und die Oligosaccharide der Auszüge wurden aufgrund der Retentionszeiten der entsprechenden reinen Verbindungen identifiziert Die quantitative Analyse der verschiedenen Peaks wurde mit dem automatischen Integrator durchgeführt Bekannte Mengen von Chlorogensäure, Coffeinsäure, Sucrose, Raffinose und Stachiose, die zu-den Auszügen zugegeben worden waren, wurden mit quantitativen Ausbeuten zurückgewonnen.

Elektrophorese

Die elektrophoretische Analyse auf 7,5% Polyacrylamid-Gel wurde in einer vertikalen Vorrichtung unter Verwendung von Trisglycin mit einem pH-Wert von 9,5 als Puffer durchgeführt (Davis, B, (1964) Ann. N. Y. Acad. Sei, 121,404).

Herstellung der pflanzlichen Mehle

Die Mehle, die der Extraktion der Phenole und Oligosaccharide unterworfen werden sollten, wurden folgendermaßen hergestellt: Sonnenblumensamen, Baumwollsamen und Sojabohnen, die vollständig von den Hüllen befreit waren, wurden bei +4"C in einem OMNI-MIXER-Homogenisator von Sörvall in Gegenwart von η-Hexan im Verhältnis von 1 Teil Samen zu 2 Teilen Lösungsmittel vermählen. Die Mehle wurden dann mit η-Hexan in einem Gewichisverhältnis von 1 :10 16 Stunden bei 25° C unter Rühren entfettet Das Lösungsmittel wurde mit Hilfe einer Filterpumpe unter Vakuum mit einem Büchner Porzellanfilter und Whatman Nr. 4-Filterpapier abfiltriert Die Mehle wurden unter Stickstoff strom 1 Stunde bei 25° C getrocknet und mit einer Bühler Vorrichtung auf eine Feinheit Nr. 2 vermählen. Die chemische Zusammensetzung des trockenen Produktes wurde nach Standardverfahren auf die Feuchtigkeit, Proteine, Lipide und Rollfeder bestimmt Der Gehalt an Phenolen und Oligosacchariden in dem Sonnenblumenmehl und Sojamehl wurde mit Hilfe gaschromatographischer Verfahren bestimmt

Extraktion von Chlorogensäure aus Sonnenblumenöl (Beispiel 1)

Die Herstellung des nach diesem Beispiel verwendeten Lösungsmittels zur Extraktton von Chlorogensäure aus Sonnenblumenöl wurde folgendermaßen durchgeführt: Ein Liter n-Butylalkoho! wird mit einem Liter einer wäßrigen Salzsäurelösung 0,5 χ 10-²n, pH 2,48 vermischt, wobei die Flüssigkeit gelegentlich gerührt und über Nacht in einem Scheidetrichter stehen gelassen wird. Die obere Phase, die nach dem Verwerfen der wä3 igen sauren Phase gesammelt wird, stellt das für das Extraktionsverfahren zu verwendende

Lösungsmittel dar.

Das auf die oben angegebene Weine hergestellte Sonnenblumenmehl wird mit Hilfe einer Siebevorrichtung auf eine Korngröße von 0,05 mm gesiebt und mit dem Lösungsmittel in einem Verhältnis (Gew/Vol.) von 1 :3030 Minuten bei 30⁰C unter Rühren vermischt

Die Suspension wird mit 500 UpM bei Raumtemper atur 10 Minuten zentrifugiert Nach dem Abdekantieren der überstehenden Flüssig keit wird die Extraktion mehrere Male (5 bis 10 Extraktionen) mit dem Lösungsmittel auf die oben beschriebene Weise wiederholt Der Verlauf der Extraktionen wird verfolgt durch Messung jedes Butanol-Auszuges bei 328 nm, d. h. bei der maximalen

Absorption von Chlorogensäure, die in dem Lösungsmittel gelöst ist Der Absorptionskoeffizient (Λ| Sf^ml)

von Chlorogensäure bei dieser Wellenlänge beträgt 513. Bei vollständiger Extraktion mit dem Lösungsmiitel wird die feste Phase unter StvcHstoffstrom 3 Stunden getrocknet und der Restgehalt an Chlorogensäure in diesem Material mit Hilfe des A. O. A. C 14.025-Verfahrens bestimmt

Extraktion von Phenolen und Oligosacchariden aus Sonnenblumenmehl, Baumwollsamenmehl

und Sojabohnenmehl

(Beispiele 2,3,4 und 5)

Das Lösungsmittel zur Extraktion von Phenolen und

Oligosacchariden aus den Mehlen von Sonnenblumensamen, Baumwollsamen und Sojabohnen wurden folgendermaßen hergestellt:

92 Teile n-Butylalkohol werden mit 8 Teilen einer wäßrigen Salzsäurelösung beim pH von 23 vermischt Bei diesen Verhältnissen ist das organische Lösungsmittel mit der wäßrigen Phase gründlich mischbar. Das entstehende Lösungsmittel wird zu dem zu extrahierenden Mehl in unterschiedlichen Verhältnissen Mehl zu Lösungsmittel unter 15 Minuten langem Rühren bei verschiedenen Temperaturen zugegeben. Der pH-Wert der Suspension wird konstant gehalten in dem Bereich der minimalen Löslichkeit der in dem Mehl enthaltenen

Proteine, der bestimmt wird. Die Konstanz des pH-Wertes wird erreicht durch

Zugabe von 0,5 η Salzsäure zu der Suspension/ die gerührt wird oder auch durch Zugabe einer pH 0,5 Lösung, bestehend aus 92 Teilen n-Butylalkohol und 8 Teilen einer wäßrigen Salzsäurelösung. Die Suspension wird über Whatman Nr. 3-Filterpapier filtriert und die

so Extraktion des Rückstandes auf die oben beschriebene Weise wiedeiftolt (2· bis 8mal). Nach vollständigen Extraktionen wird das so erhaltene Proteinkonzantrat mindestens 3 Stunden unter einem Stickstoffstrom getrocknet An verschiedenen Anteilen des trockenen Materials wird die chemische Zusammensetzung bezüglich Feuchtigkeit, Proteinen, Lipiden und Rohfaser bestimmt Bei einem derartigen Konzentrat werden die Restgehalte an Chlorogensäure, Coffeinsäure, Gossypol, Sucrose, Raffinose und Stachiose bestimmt.

Herstellung von Proteinisolaten

Die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltenen Proteinkonzentrate wurden zwei unterschiedlichen Proteineiiraktionsverfahren unterworfen: Einem einsteigen nicht-selektiven Extraktionsverfahren in einem alkalischen Medium und einem zweiten zweistufigen Verfahren, bei dem eine Fraktionierung zwischen den niedermolekularen wasserlöslichen Pro-

teinen mit einer hohen elektrophoretischen Mobilität und den Proteinen auftritt, die in einem alkalischen Medium löslich sind und ein hohes Molekulargewicht und eine geringe elektrophoretische Mobilität besitzen. Das zweite Verfahren ergibt zwei Isolate mit unterschiedlichen Zusammensetzungen und Eigenschaften.

Einstufige Extraktion

Ein Teil des bei dem Extraktionsverfahren erhaltenen Proteinkonzentrates wird in 15 Teilen Wasser aufgesch/ämmt, dessen pH-Wert mit 0,2 η NaOH auf 9,5 eingestellt ist (Mehl/Lösungsmittel 1 : 15Gew./Vol.)und 30 Minuten bei 25° C gerührt.

Die Aufschlämmung wird 20 Minuten bei 17000 UpM zentrifugiert. Der Rückstand wird nochmals unter den gleichen Bedingungen extrahiert. Die beiden überstehenden Flüssigkeiten werden zusammengegeben und die Proteine durch Zugabe von 0,5 η HCI bis zum isoelektrischen Punkt ausgefällt. Der Niederschlag wird durch 10 Minuten langes Zentrifugieren mit 17 000 UpM abgetrennt und mit einer sauren wäßrigen Lösung gewaschen. Der Proteinniederschlag wird mit einem wäßrigen Medium aufgenommen, auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert und gefriergetrocknet.

Die Bestimmung des Gesamtstickstoffes nach dem Kjeldahl-Verfahren wurde an dem Niederschlag der überstehenden Flüssigkeit und dem unlöslichen Rückstanddurchgeführt.

Zweistufige Extraktion

I. Ein Teil des Proteinkonzentrates wurde mit 15 Teilen Wasser mit einem pH-Wert von 6,5 30 Minuten unter Rühren bei 25°C behandelt (Mehl/Lösungsmitte! 1:15 GewVVol.). Die Suspension wird 20 Minuten mit 17 000UpM zentrifugiert und der Rückstand einer zweiten Extraktion unter den gleichen Bedingungen unterworfen. In den beiden zusammengegebenen überstehenden Flüssigkeiten werden die Proteine durch Einstellung des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt ausgefällt. Der Niederschlag wird mit einer sauren Lösung gewaschen, wieder in Wasser aufgeschlämmt, auf einen pH-Wert von 7.0 neutralisiert und gen ICt gCtTyA-iCii^x.

II. Der von dem ersten Extraktionsschritt kommende unlösliche Rückstand wird mit einem alkalischen Medium bei einem pH-Wen von 9.5 gelöst und wie bei dem einstufigen Verfahren extrahiert.

Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Extraktion von Chlorogensäure aus
Sonnenblumensamenmehl der Art Amiata (Jenisei)

Chemische Zusammensetzung der Samen

Feuchtigkeit

Bezogen auf Trockensubstanz:

Proteine (N. 6.25)

Lipide

Chlorogensäure

Rohfaser

Nichtstickstoffhaltiger Auszug

Substanzen

Aschen

3.8%

24.9%

58.7%

15%

2.4%

8.7%
3.4%

Feuchtigkeit

Bezogen auf Trockensubstanz:

Proteine (N. 6,25)

Lipide

Chlorogensäure

Rohfaser

8.8%

64,6%

<l,0%

4.8%

3,9%

10 g M*ehl mit einer Teilchengröße von 0,05 mm werden in einem Kolben mit 300 ml Lösungsmittel 30 Minuten bei 30°C unter Rühren vermischt. Das Gemisch wird mit 5000 UpM 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, dekantiert und mit weiteren 300 ml frischem Lösungsmittel erneut extrahiert. Diese Behandlung wird nacheinander insgesamt 8mal durchgeführt (Endverhältnis Mehl/Lösungsmittel 1 :240).

Der Chlorogensäuregehalt jedes Auszuges wurde spektrophotometrisch bei 328 nm gegen eine Lösungsmittel-Blindprobe bestimmt. Man erhielt die in Tabelle 1 angegebenen Werte.

Tabelle I	lixtruhicrtc Chlorogensäure
An/ahl der I:\truklioncn	(mg/KIg Mehl)
	203.5
1	99.2
2	53.8
	31.0
4	19.3
5	7.8
6	6.2
7	4.3
8

In dem Rückstand der 8 Extraktionen, der 3 Stunden unter Stickstoffstrom getrocknet war, wurde der Chlorogensäuregehalt nach dem A. O. A. C-Verfahren 14,025 bestimmt.

Nach 8 Extraktionen war der Gehalt an Chlorogensäure geringer als 0.2%.

Bei; pi?! 2

Herstellung von Proteinkonzentraten

und Isolaten aus Sonnenblumensamen

der Art Amiata (Jenisei), die frei sind von

chromogenen Verbindungen
und fermentierbaren Oligosacchariden

a) Herstellung von Proteinkonzentraten.

die frei sind von
o-Biphenolen und Oligosacchariden

Das angewandte Mehl besaß die folgende Zusammensetzung:

Feuchtigkeit	10.6%
Auf Trockenbasis:
Proteine (N.6.25)	58.7%
Lipide	<1.0%
Chlorogensäure	1.56»,;
Coffeinsäure	0.14°,
Sucrose	4.7%
RafTinose	3.32»,
Rohfaser	4.2%

Das wie oben hergestellte Sonnenblumenmehl besitzt die folgende Zusammensetzung:

20 g entfettetes Sojabohnensamenmehl werden in Kolben mit 400 ml Lösungsmittel, bestehend aus 92 Teilen n-ButylalkohoI und 8 Teilen einer wäßrigen

10

Salzsäurelösung, vermischt. Die Extraktion dauert 15 Minuten bei 25⁰C unter Rühren. Der Anfangs-pHWert der Suspension beträgt 6,2. Während der Extraktion wird er auf 5,0 eingestellt und durch Zugabe kleiner Mengen 0,5 η Salzsäure auf diesem Wert gehalten. Die Suspension wird über einen Büchnertrichter unter Vakuum mit Whatman Nr. 3-Filterpapier filtriert und die Extraktionen werden an dem festen Rückstand wiederholt (insgesamt 8 Extraktionen, Endverhältnis Mehl/Lösungsmittel I : 160).

Das entstehende Produkt wird 3 Stunden unter Stickstoffstrom getrocknet und besitzt folgende Zusammensetzung:

Feuchtigkeit	12,27,,	Werte geringer als die
Auf Trockenbasis:		Rmpflndlichkeitsgren/en
Proteine (N.6,25)	72,97,	des angewandten Verfahrens
C'hlorogensäure	<0.()5%
Coffeinsiiiire	< 0.057,,
Sucrose	<0.01%
Raffinose	< 0.05 7»
ftohfaser	4.87»

Dieses Produkt wird aufgrund seines Proteineehaltes (72,9%) als Proteinkonzentrat bezeichnet. Es ist im jo wesentlichen frei von Oligosacchariden und phenolischen Bestandteilen die für die grüne Farbe verantwortlich sind, die während der Extraktion von Proteinen in einem alkalischen Medium auftritt. Die elektrophoretische Analyse auf einem Polyacrylamid-Gel der aus dem y, Konzentrat extrahierten Proteine zeigt, daß sie das gleiche elektrophoretische Muster besitzen, wie die aus Sonnenblumensamenmehl extrahierten.

b) Herstellung von Proteinisolaten durch Extraktion in einer Stufe

10 g Proteinkonzentrat werden in 150 ml einer alkalischen wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von 9,5 (Verhältnis Mehl/Lösungsmittel 1:15 Gew7Vol.) 30 Minuten unter Rühren bei 25° C aufgeschlämmt. Der π pH-Wert der Suspension wird während der gesamten Extraktionszeit durch Zugabe kleiner Anteile verdünnter NaOH-Lösung konstant auf einem Wert von 9,5 gehalten. Die Suspension wird mit 17 000UpM 20 Minuten zentrifugiert und der Rückstand wieder unter den oben angegebenen Bedingungen extrahiert. Die beiden Proteinlösungen werden zusammengegeben und mit 0,5 η HCl bei pH 5,2 ausgetällt. uer Niederschlag wird durch Zentrifugieren bei 17 000UpM innerhalb von 10 Minuten abgetrennt, mit saurem Wasser, pH 5,2, 4-, gewaschen, wieder in Wasser aufgeschlämmt, auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert und gefriergetrocknet. Die Proteingehalte des Isolats, der überstehenden Flüssigkeit und des unlöslichen Rückstandes bei dem einstufigen Extraktionsverfahren sind in Tabelle Il angegeben.

Die Farbe des Isolats ist hellcremefarben-weiß.

c) Herstellung von Proteinisolaten durch zweistufige Extraktion

I) 10 g Proteinkonzentrat werden zur 150 ml einer wäßrigen Lösung, pH 63 gegeben (Mehl/Lösungsmittel 1:15 Gew7Vol.) und 30 Minuten bei 25°C gerührt. Der pH-Wert der Suspension wird konstant auf 6,5 gehalten durch Zugabe kleiner Mengen einer 0,02 η NaOH-Lösung. Die Suspension wird mit 17 000 UpM 20 Minuten zentrifugiert und der Rückstand wieder unter den gleichen Bedingungen extrahiert. Die beiden zusammengegebenen Proteinlösungen werden mit 0,5 η HCI bei einem pH-Wert von 4,0 ausgefällt. Der Niederschlag wird mit 17 000UpM 10 Minuten lang abzentrifugiert, mit saurem Wasser, pH 4,0, gewaschen, wieder in Wasser aufgeschlämmt, auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert und gegebenenfalls gefriergetrocknet.

Das Isolat I ist weiß.

II) Aus dem unlöslichen Rückstand aus der vorigen Verfahrensstufe werden die Proteine in alkalischer«. Medium bei einem pH-Wert von 9,5, wie für die einsTUTige Fruieiiiexu akiiuii bcsi-Mi ieben, extrahiert.

Die Proteingehalte des Isolats, der überstehenden Flüssigkeit und des unlöslichen Rückstandes für das zweistufige Extraktionsverfahren sind in Tabelle II angegeben.

Das Isolat II besitzt eine leicht cremefarbene-weiße Farbe.

Tabelle II Herstellung von Proteinisolaten nach einem ein- und zweistufigen Verfahren aus einem Sonnenblumensamen-

konzentrat, das frei ist von o-Biphenolen und fermentierbaren Oligosacchariden

Konzentrat

Protein- Extraktions-Stickstofi*) verfahren

pH

Isolat pH

Proteinausbeute Protein-Stickstoff

Farbe

Überstehende	Rückstand
Flüssigkeit
Protein	Protein
ausbeute	ausbeute

72,9 1 stufig

(I) NaOH 9,5

71,9 2stufig

(I) H₂O 6.5

ÖD NaOH 94 *) GesamtstickstofT X 6,25.

5,2	60,6	95,4	hellcreme	104
4,0	5,6	83,3	weiß	5,0
5,2	57,1	98,8	hellcreme	4,1

26,9

263

1ί

Beispiel 3 Optimierung des Extraktionsverfahrens von

o-Biphenolen und fermentierbaren Oligosacchariden

aus Sonnenblumensamen der Art Amiata (Jenisei)

zur Herstellung von Proteinkonzentraten

Das angewandte Sonnenblumenmehl besaß die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 2 angegeben.

20 g entöltes Mehl werden in einem Kolben zu 100 ml eines Lösungsmittels aus 92 Teilen n-Bu ty !alkohol und 8 Teilen einer wäßrigen Salzsäure-Ldsung gegeben. Die Extraktion wird 15 Minuten bei 25° C unter Rühren durchgeführt. Der Anfangs-pH-Wert der Suspension beträgt 6,2 und wird während der Extraktion durch Zugabe kleiner Anteile 0,5 η HCI auf 5,0 gehalten. Die Suspension wird unter Vakuum nitriert und es werden 8 Extraktionen an dem festen Rückstand durchgeführt (Endverhältnis Mehl/Lösungsmittel I : 40). Das entstehende Produkt besitzt nach 3stündigem Trocknen unter einem Stickstoffstrom die folgende Zusammensetzung:

Feuchtigkeit Auf Trockenbasis: Proteine (N 6,25) Chlorogensäure Coffeinsäure Sucrose Raffinose Rohfaser

10,8%

69,0% <0,05% <0,05% 138% 133% 4,6%

Feuchtigkeit Auf Trockenbasis:

Proteine (N. 6,25)

Lipide

freies Gossypol

Gesamt-Gossypol

Rohfaser

10,0%

47,6% 1,0% 1,45% 133% 1,0%

20 g entfettetes Baumwollsamenmehl werden in einem Kolben zu 400 ml eines Lösungsmittels aus 92 Teilen n-Butylalkohol und 8 Teilen wäßriger Salzsäure gegeben. Die Extraktion läuft innerhalb von 15 Minuten bei 25°C unter Rühren ab. Der Anfangs-pH-Wert der Suspension beträgt 6,1 und wird während der Extraktion durch Zugabe einzelner Anteile 03 η HQ konstant auf 4,0 gehalten. Die Suspension wird unter Vakuum auf einem Büchner Trichter mit Whatman Nr. 3-Filterpapier filtriert und der feste Rückstand unter den oben angegebenen Bedingungen 8mal extrahiert (Endverhältnis Mehl/Lösungsmittel 1 :16a Das entstehende Proteinkonzentrat wird unter einem Stickstoffstrom 3 Stunden getrocknet und besitzt die folgende Zusammensetzung:

Feuchtigkeit

AufTrockenbasis:

Proteine (N. 6,25)

Lipide

freies Gossypol

Gesamt-Gossypol

Rohfaser

Diese Ergebnisse zeigen, daß beim Übergang von einem Extraktionsverhältnis Mehl/Lösungsmittel von I : 160 (Beispiel 1) zu einem Verhältnis von 1 :40 der Restgehalt an Chlorogensäure und Coffeinsäure nicht verändert wird (weniger als 0,05%), während die Extrahierbarkeit von Sucrose und Raffinose abnimmt.

Beispiel 4 Herstellung von Proteinkonzentraten

mit niederem Gossypolgehalt aus enthülsten Baumwollsamen

Das angewandte Baumwollsamenmehl besaß die

10,5%

663% <0,5% 0,07% 034% 2,7%

Die Behandlung mit n-Butylalkohol und wäßriger Salzsäure ergab ein Proteinkonzentrat (663% Proteine) unter nicht-denaturierenden Bedingungen mit einem geringen Restgehalt an freiem und Gesamt-Gossypol. Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt den Vorteil, daß es auch auf Baumwollsamenmehle mit einem hohen Gossypolgehalt angewandt werden kann, wie sie bisher zur Herstellung von Proteinkonzentraten und Isolaten nicht geeignet waren.

Beispiel 5 Herstellung von Proteinkonzentraten

mit geringen Gehalten

an fermentierbaren Oligosacchariden aus

enthülsten Sojabohnen der Art Ada

Chemische Zusammensetzung des Mehls:

Feuchtigkeit 11,2% AufTrockenbasis:

Proteine (N 6,25) 533%

Lipide < 1,0%

Sucrose 8,24%

Raffinose 034%

Stachiose 4,7%

Rohfaser 13%

20 g entöltes Sojamehl werden in einem Kolben zu 400 ml eines Lösungsmittels, bestehend aus 92 Teilen n-Butylalkohol und 8 Teilen wäßriger HCl gegeben. Die Extraktion wird 15 Minuten bei 40⁰C unter Rühren durchgeführt.

rw Anf^ngc-nH-Wprt Her Suspension beträgt S3 und wird während der Extraktion durch Zugabe kleiner Anteile 03 η HCI auf einen Wert von 43 gebracht und auf diesem Wert gehalten.

Die Suspension wird unter Vakuum auf einem Büchner Trichter mit Hilfe von Whatman Nr. 3 Filterpapier nitriert und der feste Rückstand insgesamt 8mal extrahiert (Endverhältnis Mehl/Lösungsmittel 1 :160). Das entstehende Produkt besitzt nach 3 Stunden langem Trocknen unter Stickstoffstrom die folgende Zusammensetzung:

Feuchtigkeit AufTrockenbasis:

Proteine (N 6,25)

Sucrose

Raffinose

Stachiose

Rohfaser

93%

653% 0,41% 033% 232% 2,4%

Das Produkt ist aufgrund seines Proteingehalts (653%) ein Proteinkonzentrat und besitzt geringe Gehalte an fermentierbaren Oligosacchariden.

Claims (4)

Patentansprüche;

1. Verfahren zum Extrahieren von Phenolen und Oligosacchariden aus pflanzlichen Geweben mit Hilfe eines polaren organischen Lösungsmittels und Wasser, dadurch gekennzeichnet, daß man die entsprechenden Pflanzenteile oder daraus gewonnene Produkte mit einem Lösungsmittel, das einen pH-Wert von 2,0 bis 6,0 hat und aus dem organischen polaren Lösungsmittel und einer wäßrigen Lösung eines sauren Elektrolyten besteht, in einem Gesamtverhältnis gelöste Stoffe zu Lösungsmittel von 1 :5 bis 1 :240 bei einer Temperatur im Bereich von 4° C bis zu der Temperatur, bei der eine Denaturierung der Proteine beginnt, behandelt.

Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als polares organisches Lösungsmittel einen Alkohol, ein Keton oder einen Ester verwendet

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Elektrolyt eine anorganische Säure verwendet

4. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 3, auf die Extraktion von Sonnenblumensamenmehl, BaumwoIIsamenmchl und/oder Sojabohnenmehl.