PL100130B1 - Sposob ekstrakcji fenoli i oligosacharydow z materialow bialkowych ziarna roslin - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób ekstrakcji fenoli i oligosacharydów z materialów bialkowych ziarna roslin, zawierajacych fenole i oligosacha- rydy, w celu otrzymania koncentratów bialkowych i preparatów bialkowych o niskiej zawartosci czynników antyodzywczych i zwiazków chromo- gennych.

W publikacji Z. Jerzmanowska pt. „Substancje roslinne metody wyodrebniania", PWN, W-wa, 1967 omówiono sposób wyodrebniania zwiazków wystepujacych w roslinach na drodze ekstrakcji materialu roslinnego rozpuszczalnikami organicz¬ nymi, na przyklad eterem naftowym, eterem ety¬ lowym, acetonem, chloroformem* metanolem albo 96 lub 70°/c( etanolem, badz woda, rozcienczonymi roz¬ tworami kwasu, np. 2% roztworem kwasu octo¬ wego^ lub rozcienczonymi roztworami zasady, ta¬ kiej jak soda lub wodorotlenek sodu. Publikacja ta dotyczy metod analityczno-badawczych i nie nadaje sie do stosowania w technice.

Znana z opisu patentowego Stanów Zjednoczo¬ nych Ameryki -nr 3168406 metoda ekstrakcji ma¬ terialu roslinnego w celu poprawienia jakosci pro¬ duktów roslinnych wytwarzanych nastepnie z tego materialu polega na dzialaniu na make roslinna roztworem wodnym o wartosci pH = 4—6, a na¬ stepnie lotnym, polarnym, mieszajacym sie z woda rozpuszczalnikiem organicznym.

Znane metody wytwarzania koncentratów bial¬ kowych z bialkowego materialu roslinnego pole- gaja na wyplukiwaniu rozdrobnionego materialu roslinnego roztworem wodnym o wartosci pH 4—5 podczas ogrzewania (opis patentowy Stanów Zjed¬ noczonych Ameryki nr 3365440) albo na dzialamiu na (rozdrobniona i odsiana make woda o wartosci pH 4—6 lub 20—80%| wodnym roztworem alkoholu (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3895003).

Zadna ze znanych metod nie dotyczy wyodreb¬ niania z materialu bialkowego pochodzenia roslin¬ nego fenoli i oligosacharydów.

Z publikacji Looimis, W.D., i Battaile, J. Phy- tochemistry, 5, 423 (1966) oraz „Pierpoint, W.S., Biochem. J., 112,609 (1969) wiadomo, ze w swiecie roslinnym zwiazki fenolowe i polifenolowe sa sze¬ roko rozpowszechnione i wystepuja zarówno w po¬ staci wolnej jak i zwiazanej ze skladnikami bialko¬ wymi gliicydowymii, wystepujacymi w róznych czesciach roslin, lecz glównie w nasionach, lisciach, lodygach i korzeniach. Te zwiazki naturalne ule¬ gaja utlenianiu do chinonów, które z kolei w sro¬ dowisku alkalicznym szybko polimeryzuja i rea¬ guja z bialkami tworzac wiazania kowalencyjne i wodorowe.

Utlenianie fenoli do chinonów nastepuje w obec¬ nosci tlenu lub takze przy udziale niektórych enzymów, takich jak fenoloksydaza, peroksydaza i inne. Z uwagi na zawartosc w nich zwiazków fenolowych, uzycie bialek wyodrebnionych metoda ekstrakcyjna z roslin w pokarmach dla ludzi jest 100 130100 130 ii i -: . *i\i* z r /?¦& ¦¦¦¦¦ /¦ ,;, . ". $ bardzo ograniczone. Powodem tego sa nastepujace wzglady ekonomiczne i zywieniowe: ""*"— tworzenie wiazan kowalencyjnych pomiedzy fenolami a .niektóorymi walnymi aminokwasami zawartymi w preparatach bialkowych obniza ich 5 wartosc odzywcza, poniewaz utworzone w ten spo¬ sób nowe zwiazki kondensacyjne nie moga byc metabolizowane przez ludzi, a wiec zwiazki feno¬ lowe, nie oddzielone od preparatów bialkowych stanowia czynnik antyodzywczy, — szybkie utlenianie omawianych zwiazków na¬ daje bialkom zabarwienie zielono-brazowe zaleznie od wartosci pH, przez co tak zabarwione preparaty sa nie do przyjecia jako zywnosc, — wydajnosc ekstrakcji bialek w obecnosci zwiazków fenolowych ze wzgledu na oddzialywa¬ nia pomiedzy tymi zwiazkami a bialkami, — niektóre fenole sa zwiazkami toksycznymi, przykladowo gosipol, fehol dwualdehydowy, wy- stepujacy w rztiarnach- bawelny.-- Dotychczasowe sposoby usuwania tych zwiazków z maczki roslinnej dawaly niezadowalajace wyniki, poniewaz nie umozliwialy uzyskania na drodze ekstrakcji bezbarwnych, preparatów (A.Kt Smith ^ i V.L. Johnsen, Ceral. Chem. ?25, 399 (1948), oraz J.V. Pomenta i E.P. Burns, J; Food Sci., 36, 490 (1971) lub prowadzily w imnliejszym lub wiekszym stopniu do denaturacji ^c^szic^iaihyjch' bialek (F.J. Joubert, Biochem. Biop^ys., Act^, lfi, ,52Q ,m (1955), S. Gheyasudding, CM. Carter i K.F. Mattil, Food Techno!., 24, 242 (1970), F.W. Sosulski, CM.

Mc Cleary i F.S. Soliman, J. Food Soi., 37, 253 (1972).

Podobnymi' zwiasfcami, ' których obecnosc* 35 w maczce (roslinnej jest tndepozajdana, sa ulegajace fermentacji oligosacharydy (rafinoza, stachioza,' werbaskóza itfr.) wywolujace wzdecia i parcia.

Obecnosc tych zwiazków ogranicza równiez mozli¬ wosc wykorzystania takiej maki i koncentratów 40 bialkowych w produktach przeznaczonych do spo¬ zycia przez ludzi.

Sposób wedlug wynalazku pozwala wydzielic ekstrakcyjnie barwniki fenolowe i ulegajace fer¬ mentacji oligosacharydy wystepujace w materiale 45 roslinnym w warunkach, w których nie nastepuje denaturacja bialek. Oparty jest on na zjawisku dyfuzji zwiazków o niskim ciezarze Czasteczkowym w rozpuszczalniku polarnym poprzez scianki ko¬ mórek i wewnatrzkomórkowych organelli. so Sposób wedlug wynalazku prowadzi bezposrednio do otrzymania koncentratów bialkowych o wyso¬ kich wartosciach biologicznych, zasadniczo wolnych od'niepozadanych zwiazków (kwtfs chlorogenowy, gosipol, tafliioza, stachioza itp.) i jest przystoisio- w wany do wytwarzania wysoce czystych preparatów bialkowych o barwie od bialej do kremowobdalej w calym pirzedziale rozpuszczalnosci bialek.

Sposób ekstracjifenoli i oligosacharydów z ma^ terialów bialkowych ziarna roslin zawierajacych fenole i óLLgosacharydy wedlug wyirialazku polega na tym, ze iriaterialy bialkowe zdam roslin pod¬ daje sie dzialaniu zapewniajacej ekstrakcje ilosci normalnego alkoholu butylowego w polaczeniu z mieszajacym sie z nim wodnym roztworem elek- 65 trolitu o charakterze kwasnym, takiego jak kwas organiczny lub nieorganiczny lub ich kwasne sole.

Obecnosc elektrolitu z jednej strony oslabia oddzialywamie pomiedzy bialkami a fenolami, z drugiej zas powoduje slabe zakwaszenie srodo¬ wiska, dzieki czemu zwieksza rozpuszczalnosc fenoli. Ekstrakcje prowadzi siie w temperaturze od +4°C do temperatury w której rozpoczyna sie proces denaturacji bialka, przy czym wartosc osta¬ teczna stosunku ilosci maczki do ilosci rozpuszczal¬ nika zawiera sie w granicach od 1:5—1:240, zas pH rozpuszczalnika wynosi 2,0—6,0.

Kwasnym roztworem zawierajacym n-butanol ekstrahuje sie nastepujace rodzaje maczki roslin¬ nej zawierajace fenole i ulegajace fermentacji oligosiacharydy: maczke z nasion slonecznika, maczke sojowa oiraz maczke z nasion bawelny.

W maczce z nasion slonecznika okolo 70% za¬ wartych w tym materiale zwiazków fenolowych stanowi kwas.chlorogenowy (kwas 3,3— kefeilo- chinowy) wystepujacy w wielu rodzajach ziarn w ilosci od 1—7%<,Pozostale 30Vc( obecnych w tym materiale zwiazków fenolowych wedlug publikacji H.A. Sabira, F.W. Sokulstoiego i J.A. Kermana, J» Agr. Food. Chem; 22, 572 (1974) stanowi siedem kwasów fenolowych: kwas izochlorogenowy, kwas kofeinowy, kwas p-kurnarowy, kwas izoferulowy, kwas farulowy, kwas synapinowy, kwas trans cynamonowy, oraz kilka niezidentyfikowanych zwiazków.

Zastosowanie preparatów bialkowych z maczki z nasion slonecznika w zywieniu ludzi jest bardzo utrudnione ze wzgledu na obecnosc kwasu, który w srodowisku slabo alkalicznym, stosowanym przy ekstrakcyjnym wydzielaniu bialek, ulega utlenie¬ niu do chinonu i nadaje zarówno ekstraktom jak i preparatom bialkowym zabarwienie od zielonego do brazowego w zaleznosci od wartosci pH.

W maczce sojowej wystepuja zwiazki powodu jace wzdecia i parcia bedace równoczesnie czyn¬ nikami antyodzywczymi, takie jak ulegajace fer¬ mentacji oligosacharydy: rafinoza i Sitachioza (J.J. Rackis i linni, J. Food Soi., 35, 634 (1970), które stanowia okolo 40% zawartych w tym materiale rozpuszczalnych w wodzie weglowodanów o niskim ciezarze czasteczkowym. Zwiazki te wystepuja równiez w koncentratach bialkowych, lecz prepa¬ raty bialkowe sa od nich wolne, gdyz sa one od¬ dzielane podczas ekstrakcyjnego wydzielania bia¬ lek.

Glównym ograniczeniem wykorzystania bialek wyodrebnionych z maczki z nasion bawelny jako pozywienia jest fakt tworzenia asocjatów pomiedzy toksycznym aldehydem polifenolowym, (1,1', 6,6', 7,7'-szesciohydrofcsy-5,5'-dwuizopropylo-3,3/-dwume- tylo-2,2'-^dwunaftaleno-8,8'^wu!karboksyaldehyd) a zwiazkami bialkowymi. Czesc obecnego w tym materiale gosipolu ulega reakcji z bialkami za¬ wartymi w nasionach bawelny, a czesc pozostaje w postaci niezwiazanej. Toksyczne dzialanie go¬ sipolu uniemozliwia wykorzystanie bialek z nasion bawelny w produktach zywnosciowych.

Opracowano szereg sposobów usuwania lub de- zaktywowania gosipolu (C. Vaccarino, J. Amer, Oil.5 100 130 Chem. Soc, 38, 143 (1901), S.M. Damaty i B.J.F.

Hudson, J. Sci. Food Agrie., 26, 109 (1975). Nie¬ które z tych sposobów sa skuteczne, ale moga byc stosowane jedynie w przypadku maczki z nasion bawelny o niskiej zawartosci gosipoiu. 5 W celu dokladnego wyjasnienia sposobu wedlug wynalazku wykonano szereg przykladowych eks¬ trakcji kwasu chlorogenowego i rafdinozy z oleju slonecznikowego!, gosipoiu z maczki z zdairen ba¬ welny oraz irafdnozy i stachiozy z maczki sojowej. 10 W przykladowych ekstrakcjach stosowano na¬ stepujace materialy: kwas chloirogenowy i kwas kofednowy, w stanie czystym — produkcji firmy Fluka AG, Bucks SG; sacharoze, rafinoze d sta- chinoze, w stanie czystym — pinodukcjd fiirmy 15 Sigma Chem. Co., kwas solny, czysty — produkcji formy Merck, alkohol n-butylowy i n-heksain — produkcji firmy Carlo Erba jako RPE (Reattivo Puro Erba-Erba czysty zwiazek) stosowane jako rozpuszczalniki. Kwas gosipolo-octowy przygoto- **' wano laboratoryjnie na drodze ekstrahowania lusz^ czonych nasion bawelny w sposób opisany przez W.H. King i F.H. Thurber, J. Ara. Oil Chem. Soc., 03, 70 (1953), otrzymujac produkt o czystosci po¬ wyzej98%;. M W doswiadczeniach tych- wykorzystano nastepu¬ jace techniki oznaczen. Oznaczanie zawartosci azo¬ tu prowadzono wedlug sposobu KjeLdahla na skale techniczna, a zawartosc azotu bialkowego wyzna¬ czano mnozac calkowita zawartosc azotu przez 6,25.

Zawartosc wilgoci, tluszczów i surowych wl6kien okreslano wedlug standardowych metod A.O.A.C.

(Association Official Analytical Chemists, wydanie 12(1975).

Dozowanie kwasu chlorogenowego w przykla¬ dzie I prowadzano wedlug sposobu 14.025 A.O.A.C. — wydanie 11 (1970).

Kwas chloDTOgenowy, kwas kofeinowy, sacharoze i rafinoze oznaczano w przykladach II i III me- 40 toda chromatografii gazowej w postaci pochodnych sililowych (M.A. Sabdr, F.W. Sasulski i J.A. Ker- man, J. Agr. Food Chem., 22, 572 (1974), a w przy¬ kladzie V, wykorzystujac te sama technike ozna¬ czano stachioze, sacharoze i rafinoze. Oznaczenie 45 wolnego gosipoiu d calkowitej zawartosci gosipoiu prowadzono wedlug standardowych metod Ba 8—58 i Ba 8—55, odjpowiedndo, A.O.C.S. (Official and Tentative Methods of the America! Oil Chemists' Society — wydanie 3 (1972). 10 Próbki do oznaczen technika chromatografii gazo¬ wej przygotowywano w nastepujacy sposób: zwiazki fenolowe i oligbsacharydy zawarte w koncentra¬ tach bialkowych i odtluszczonej maczce ekstraho¬ wano 80%j wodnym roztworem metanolu utrzymu- w jac stosunek maczki do rozpuszczalnika równy 1:100, ogrzewajac calosc w ciagu 5 godzin w wa¬ runkach wrzenia pod chlodnica zwrotna (K.L. Mi¬ kolajczak, CR. Smith Jir i I.A. Wolff, J. Agr. Food Chem, 18, 27 (1970). Ekstrakt metanolowy bdparo- *> wywano do sucha pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 40°C. Sucha pozostalosc rozpusz¬ czano w kwasie solnym, przy wartosci pH równym 2,0 i otrzymany roztwór doprowadzono do wartosci pH 6,0 dodajac rozcienczony roztwór wodorotlenku M sodu. Roztwór odparowano do sucha pod zmniej¬ szonym cisnieniem w temperaturze 40°C. Zwiazki fenolowe i oMgosacharydy ekstrahowano w tem¬ peraturze pokojowej bezwodnym metanolem w od¬ mierzonej ilosci, zawiesine poddano odwirowaniu i warstwe cieczy z nad osadu odparowano do sucha w strumieniu azotu w temperaturze poko¬ jowej w naczyniu reakcyjinym z wywinietym kol¬ nierzem, a otrzymana pozostalosc sililowano znana iloscia TRI-SIL „Z", termostatujac mdeszaoine w ciagu 2 godzin w temperaturze 80°C (TRI-SIL oznacza N-trójmetylosiUloimidazol — produkt fir¬ my Pierce Chemicad Co.).

Analize chromatograficzna prowadzono stosujac chromatograf gazowy HP 7620 A wyposazony w automatyczny integrator HP 3380 A. W podanych nizej warunkach: kolumna szklana 3,19 mm Xl82,4 cm faza stala OV-l, 3%;, na Chromosorb WHP o rozdrobnieniu 80—100 mesh temperatura 300°C w anijektorze temperatura 300°C w detektorze temperatura 150°C w ciagu 4 minut w kolumnie 150°C—260°C przy wznoscie 6°C na minute, 260°C w ciagu 30 minut gaz inosny hel szybkosc przeplywu 35 ml na minute detektor jonizacja plomieniowa.

W przypadku oznaczania oligosacharydów w maczce sojowej wprowadzono nastepujace zmiany t temperatura 150°C w ciagu 4 mdnut,< w kolumnie: 150°^250°C przy waroscie 6°C ina minute, 250°C w ciagu 10 minut, 250--32CPC przy wzroscie °C na minute, 320—340°C przy wzroscie °C/minutej 340°C w ciagu 30 minut temperatura w injektorze 350°C temperatura w detektorze 350°C.

O-Dwufenole i oligosacharydy zawarte w eks¬ traktach identyfikowano na podstawie czasu retencji odpowiadajacych im czystych zwiazków.

Dokonano analizy ilosciowej kilku pilców przy po¬ mocy, automatycznego integratora. Znane ilosci kwasu chlorogenowego, kwasu kofeinowego, sacha¬ rozy, rafcinozy i\ stachiozy wprowadzone do eks¬ traktów odzyskano ajoacio^o.

Elektroforeze na 7,5°/* zelu po&akiryloamidowym prowadzono w pionowym aparacie fermy Cawalco Industrial Corporation, Rockyilje, Maryland, sto¬ sujac trisglicyne o pH 9,5 jako bufor (B. Davis, Ann. N.Y. Acad. Sci., Ul, 404 (1964 <—),100 130 Maczki roslinne poddawane ekstrakcyjnemu wy¬ dzielaniu fenoli i oligosacharydów przygotowywano w nastepujacy sposób: luskane nasiona slonecznika, bawelny i soi mielono w temperaturze -h4?C w homogenizerze OMNI-MIXER firmy S6rvaiil 5 w obecnosci n-heksanu przy stosunku nasion do rozpuszczalnika równym 1:2. Maczki odtluszczano n-heksanem stosowanym w ilosci 1 czesc wagowa maczki na 10 czesci objetosciowych rozpuszczal¬ nika, przez mieszanie w ciagu 10 godzin w tempe- 10 raiurze 25°C. Rozpuszczalnik odpedzano podczas saczenia pod zmniejszonym cisnieniem przy uzyciu pompy ssacej na porcelanowym lejku Buchnera stosujac bibule filtracyjna Whatman Nr 4. Maczki suszono w strumieniu azotu w temperaturze 25°C 15 w ciagu, 1 godziny i mielono w aparacie Bucnnera do wielkosci Nr 2. Sklad chemiczny suchego pro¬ duktu ustalono wedlug standardowych metod oznaczania zawartosci wilgoci, bialek, tluszczów i surowych wlókien. Zawartosci fenoli i' oligosa- ** charydów w maczce sojowej i w maczce z na¬ sion slonecznika oznaczano stosujac technike chro¬ matograficzna.

Rozpuszczalnik do przeprowadzenia ekstrakcyj¬ nego wydzielania kwasu chlorogonowego z oleju ^ slonecznikowego (uzywany jak opisano dalej w przykladzie I) przygotowuje sie nastepujaco.

Miesza sie 1 litr alkoholu n-butylowego z 1 litrem wodnego roztworu kwasu solnego o stezeniu 0,5X10—2 N i pH 2,48. Mieszanine miesza sie od w czasu do czasu i pozostawia na noc w rozdzielaczu.

Górna faza oddzielona od kwasnej fazy wodnej, stanowi rozpuszczalnik stosowany do ekstrakcji kwasu chlorogenOwego z oleju slonecznikowego.

Maczke,. z ziarn slonecznika przygotowana jak 3* opisano poprzednio przesiewa sie na przesiewairce Fritsch Analysette 3, otrzymujac produkt o wiel¬ kosci ziarna 0,050 mm, który miesza sie z roz- puszczalnifeiem w stosunku 1 czesc wagowa maczki na 30 czesci objetosciowych rozpuszczalnika 40 w ciagu 30 minut w temperaturze 30°C. Zawiesine odwirowuje sie pszy predkosci 5000 obrotów na minute stosujac wirówke, Sórvall RB-2 z wirnikiem SS-34. Odwirowanie prowadzi sie w temperaturze pokojowej w ciagu 10 minut.

Po zdekantowaniu cieczy znad osadu powtarza sie ekstrakcje wielokrotnie (5—10 razy) prowadzac ja jak opisano poprzednio. Postep ekstrakcji sledzi sie mierzac absorpcje kolejno uzyskiwanych ekstraktów butanolowych przy dlugosci fali 328 nm, to jest w maksiimum absorpcjii kwasu chlorogenowego. rozpuszczonego w (rozpuszczalniku.

Wspólczynnik absorpcji genowego pTzy tej dlugosci *aiLi wynosi 51,3. Po w zakonczeniu ekstrakcji iroAprttózczalnikiem faze stala suszy sie W strumieniu azotu w ciagu 3 gadzin i oznacza pozostala W materiale ilosc kwasai chlo¬ rogenowego wedlug metody A.O.A.C. 14.025.

Rozpuszczalnik do ekstrakcyjnego wydzielania go fenoli i oligosaeharydów a maczki z nasion slo¬ necznika, z maczki z nasion bawelny oraz z maczki sojowej (stosowany jak opisano dalej w przykla* dach II, III, IV, V) przygotowuje sie nastepujaco: Miesza sie 92,;l czesci alkoholu n>-butylowego w 45 50 z 8 czesciami wodnego iroztworu kwasu solnego o wartosci pH 2,3. Przy tych proporcjach rozpusz¬ czalnik organiczny calkowicie miesiza sie z faza wodna. Otrzymany rozpuszczalnik miesza sie z kilkoma próbkami poddawanej ekstrakcji maczki przy zachowaniu róznych wartosci stosunku maczki do rozpuszczalnika, po czym wszystkie próbki miesza sie w ciagu 15 minut w róznych temperaturach. Utrzymuje sie stala wartosc pH zawiesiny w przedziale minimalnej rozpuszczal¬ nosci bialek zawartych w ekstrahowanym ma¬ teriale. Stala wartosc pH utrzymuje sie, dodajac 0,5 N roztwór kwasu solnego oraz roztwór o war¬ tosci pH 0,5 otrzymany przez zmieszanie 92 czesci in-butanoilu i 8 czesci wodnego roztworu kwasu solnego. Zawiesine przesacza sie przez saczek z bibuly filtracyjnej Whatmana Nr 3 i powtarza wielokrotnie ekstrakcje (2^-8 razy), az do uzytska- nria stalej pozostalosci, jak opisano poprzednio. Po zakonczenu ekstrakcji otrzymany koncentrat bial¬ kowy suszy sie w ciagu 3 godzin w strumieniu azotu. Ustala sie sklad chemiczny róznych porcji suchego produktu oznaczajac zawartosc wilgoci, bialek, tluszczów i surowych wlókien. W otrzy¬ manym koncentracie oznacza sie zawartosc kwasu chlorogenowego, kofeinowego, gosipolu, sacharozy, rafinozy i st&tchiozy* Z koncentratów bialkowych otrzymanych jak opisano poprzednio, sporzadza sie preparaty bialko¬ we ipoddajac koncentraty dwóm róznym procesom ekstrakcji bialkowej: jednoetapowej, nieselektyw- nej ekstrakcji w srodowisku alkalicznym oraz dwuetapowej ekstrakcji w wyniku której nastepuje rozfrakcjonowanie bialek na rozpuszczalne w wo¬ dzie bialka o niskim ciezarze czasteczkowym i duzej ruchliwosci elektroforetyicznej oraz na bialka rozuszczalne w srodowisku alkalicznym o duzym ciezarze czasteczkowym i o malej ruchli¬ wosci elektirpforetycznej. W wyniku dwuetapowej ekstrakcja otrzymuje sie dwa preparaty bialkowe o róznym skladze i róznych wlasciwosciach.

Ekstrakcje jednoetapowa prowadzi sie w na¬ stepujacy sposób: Czesc koncentratu bialkowego otrzymanego w, wyniku ekstrakcyjnego wydziela¬ nia fenoli i Oiligosacharydów przeprowadza sie w stan zawiesiny w 15 czesciach wody i pH za¬ wiesiny doprowadza sie do wartosci 9,5 dodajac 0,2 N wodorotlenek sodu (stosunek ilosci maczki w czesciach wagowych (do F objetosci rozpuszczal¬ nika wynosi 1:15), po czym calosc miesza sie w ciagu 30 minut w temperaturze 25°C.

Zawiesine odwirowuje sie stosujac wirówke Sorvall RB-2 z wirnikiem SS-34 przy predkosci 17.000 obrotów na minute. Pozostalosc po odwiro¬ waniu poddaje sie powtórnej ekstrakcji prowadzo¬ nej w takich samych warunkach. Z obu polaczo¬ nych ekstraktów wytraca sie bialko, dodajac 0,5 N kwas solny do punktu izoelektrycznego. Osad poddaje vsie sedymentacji , w wirówce w ciagu minut, przy predkosci 17.000 obrotów ma minute, a nastepnie przemywa kwasnym roztworem wod¬ nym. Osad bialka rozpuszcza sie w srodowisku wodnym, neutralizuje do wartosci pH 7,0 i wy- mraza. Calkowita zawartosc azotu w osadzie, roz-9 100 130 tworze .macierzystym i .nierozpuszczalnej pozosta¬ losci oznacza sie metoda Kjeldahla.

Ekstrakcje dwuetapowa prowadzi sie nastepu¬ jaco: 1) Czesc koncentratu bialkowego zadaje sie czesciaimi wody o iwartosci pH 6,5(stosunek masy maczki do objetosci rozpuszczalnika wynosi 1:15) i w ciagu 30 minut miesza w temperaturze 25°C.

Zawiesine odwirowuje, sie przy predkosci 17.000 obrotów na minute w ciagu 20 minut i stala poao>- stalosc poddaje powtórnej ekstrakcji prowadzonej w tych samych warunkach. . Z obu polaczonych ekstraktów wytraca sie bialko zobojetniajac roz¬ twór do punktu izoelektrycznegOi Osad przemywa sie kwasnym roztworem, zadaje woda i uzyskana zawiesine zobojetnia sie do wartosci pH 7,0 i wy- mraza. 2) Nierozpuszczalna pozostalosc z pierwsze¬ go etapu dwuetapowej ekstrakcji rozpuszcza sie w srodowisku alkalicznym o wartosci pH 9,5 w sposób opisany dla ekstrakcji jednoetapowej.

Dalsze szczególy sposobu wedlug wynalazku zilu¬ strowano w ponizszych przykladach.

Przyklad I. Ekstrakcyjne wydzielanie kwasu chlorogenowego z nasion slonecznika odmiany Amiata (Jemisei).

Sklad chemiczny nasion: zawartosc wilgoci 3,8°/o W suchej masie nasion: bialka (NX6,25) 24,9% tluszcze 58,7% kwas chlorogenowy 1,9%, surowe wlókna 2,4% ekstrakt substancji .nie zawierajacych azotu 8,7% popiól 3,4%; Maczka z nasion slonecznika otrzymana jak opisano poprzednio ma nastepujacy sklad: zawartosc wilgoci w suchej masie maczki 8,8%| bialka (NX6,25) 64,6% tluszczeponizej 1,0% kwas chlorogenowy 4,8% surowe wlókno 3,9% gramów maczki o wielkosci ziaren 0,05 mm zadaje sie w kolbie 300 ml rozpuszczalnika i calosc miesza sie w ciagu 30 minut w temperaturze 30°C.

Mieszanine odwirowuje sie (5.000 obrotów na minute) w ciagu 10 minut w temperaturze po¬ kojowej, dekantuje i powtórnie ekstrahuje dalszy¬ mi 300 ml swiezego rozpuszczalnika. Postepowanie takie powtarza sie osmiokrotnie (koncowa wartosc stosunku maczki do rozpuszczalnika wynosi 1:240).

Kwas chlorogenowy zawarty w poszczególnych ekstraktach oznacza sie spektrofotometrycznie przy dlugosci fali 328 mm w porównaniu z czystym rozpuszczalnikiem, otrzymujac wyniki podane w tablicy I.

W pozostalosci po osmiu ekstrakcjach, suszonej w strumieniu azotu w ciagu 3-ch godzin, oznacza sie kwas chlorogenowy wedlug metody A.O.A.C. 14.025. Po ósmej ekstrakcji zawartosc kwasu m chlorogenowego w pozostalosci wynosi mniej niz 0,2%.

Przyklad II. Otrzymywanie koncentratów bialkowych i preparatów bialkowych z nasion slonecznika odmiany Amiata (Jenisei) wolnych od « Tablica I 45 50 55 Numer ekstrakcji. 1 2 3 . 4 6 7 8 Ilosc wyekstrahowanego kwasu chlorogenowego w mg na 10 g maczki 203,5 99,2 53,8 31,0 19,3 7,8 «,2 4,3 zwiazków chromogennych i od oligosacharydów ulegajacych fermentacji. a) Otrzymywanie koncentratów bialkowych wol¬ nych od o-dwufenoli i oligosacharydów.

Stosowana maczka ma nastepujacy sklad: wilgotnosc 10,6% w suchej masie maczki: bialka (NX6,25) 58/7% tluszcze mniejniz 1,0% kwas chlorogenowy 1,56% kwas kofeinowy 0,14% sacharoza 4,70% rafinpza 3,32% surowewlókna 4,2% gramów odtluszczonej maczki z nasion slo¬ necznika miesza sie w kolbie z 400 ml rozpuszczal¬ nika skladajacego sie z 92 czesci alkoholu n-bu- tylowego i 8 czesci wodnego roztworu kwasu sol¬ nego. Ekstrakcje prowadzi sie w ciagu 15 minut w temperaturze 25°C z jednoczesaiym mieszaniem.

Poczatkowo pH mieszaniny ma wartosc 6,2, pod¬ czas ekstrakcji doprowadza sie pH do wartosci ,0 i utrzymuje na tym poziomie dodajac nie¬ wielkie ilosci 0,5 N roztworu kwasu solnego. Mie¬ szanine saczy sie na lejku Buchnera pod .zmniej¬ szonym cisnieniem, stosujac saczek z bibuly filtra¬ cyjnej Whatmaina Nr 3 i powtarza sie pnoces ekstrakcji osmiokrotnie (koncowa wartosc stosunku ilosci maczki do ilosci rozpuszczalnika wynosi 1:160). Koncowy produkt suszy sie w strumieniu azotu w ciagu 3 godzin.

Produkt ten ma .nastepujacy sklad: 12,2% zawartosc wilgoci w suchej masie: bialka (NX6,25) kwas chlorogenowy mniej niz kwas kofeinówy mniej niz sacharoza mniej niz rafinoza mniej niz surowe wlókna Produkt ten, z uwagi na zawartosc w nim sub¬ stancji bialkowych (72,9%) okresla sie jako kon- 72,9%! 0,05% 0,05% 0,01% 0,05% 4,8% Wartosci mniejsze od dolnej granicy wykry¬ walnosci stosowa¬ nych metod11 100 130 12 cemtrat bialkowy. Jest oin zasadniczo wodny od oligosacharydów i zwiazków fenolowych powodu¬ jacych zielone zabarwienie bialek w trakcie eks¬ trakcji w srodowisku alkalicznym. Elektroforeza bialek ekstrakcji w srodowisku alkalicznymi. 5 Elektroforeza Cialek ekstrahowanych z tego kon¬ centratu na zelu poliakryloamidowym wykazuje, ze bialka te zachowuja sie podczas elektroforezy tak samo jak bialka wyodrebnione z maczki z zia¬ ren slonecznika*.¦'> 10 b) Otrzymywanie preparatów bialkowych na drodze jednoetapowej ekstrakcji. 10 .gramów kon¬ centratu bialkowego (przeprowadza sie w stan za¬ wiesiny w 150 ml wodnego roztworu alkalicznego o wartosci pH «= 9,5 (stosunek ilosci maczki w czes- 15 ciach wagowych do objetosci rozpuszczalnika 1:15) i miesza w ciagu 30 minut w temperaturze 25°C.

Odczyn zawiesiny utrzymuje sie na poziomie pH = 9,5 w ciagu calego okresu trwania ekstrakcji, dodajac niewielkie ilosci rozcienczonego roztworu 20 wodorotlenku sodu. Nastepnie zawiesine odwiro¬ wuje sie w ciagu 20 minut przy predkosci 17$00f obrotów/minute. Pozostalosc ekstrahuje sie ponownie w takich samych warunkach jak opisano pppirzednio. Oba otrzymane ekstrakty bialkowe laczy sie i wytraca bialka 0,5 N roztworem kwasu solnego przy wartosci pH = 5,2. Osad odwirowuje sie w ciagu 10 minut z predkoscia 17.000 obrotów/ mjnu^e, przemywa zakwaszona woda o wartosci pH = 5,2, ponownie rozprowadza w wodzie, alkali- zuje do wartosci pH = 7,0 i wymraza. Zawartosc bialek w preparacie lugu macierzystym i nieroz¬ puszczalnej pozostalosci przedstawiono w tablicy II.

Barwa otrzymanego preparatu jest jasnokremowo- fcwatai :.,,- c) Otrzymywanie preparatów bialkowych na drodze ekstrakcji dwuetapowej.

I. 10 gramów koncentratu bialkowego dodaje sie do 150 ml wodnego troztworu o wartosci pH = 6,5. (stosunek ilosci maczki w czesciach wagowych do 40 n 3& objetosci rozpuszczalnika 1:15) i calosc miesza sie w ciagu 30 minut w temperaturze 25°C. Odczyn zawiesiny utrzymuje sie na stalym poziomie pH — 6,5 dodajac niewielkie ilosci 0,02 N roztworu wodorotlenku sodu. Zawiesine odwirowuje sie w Ciagu 20 minut z riredkoscia 17.000 obrotów/ minute, a pozostalosc ekstrahuje powtórnie w ta¬ kich samych warunkach. Oba ekstrakty bialkowe laczy sie i wytraca bialka za pomoca 0,5 N kwasu solnego przy wartosci pH — 4,0. Osad oddziela sie na wirówce przy predkosci 27.000 obrotów/minute w oiagu 10 minut, przemywa zakwaszona woda o wartosci pH = 4,0, rozprowadza ponownie w wo¬ dzie, neutralizuje do wartosci pH — 7,0 i ewentual¬ nie wymraza. Otrzymany preparat bialkowy (pre¬ parat I) ma biala barwe.

II. Z nierozpuszczalnej pozostalosci z etapu I wydziela sie ekstrakcyjnie bialko w srodowisku alkalicznym o wartosci pH = 9,5 w warunkach opisanych poprzednio dla otrzymywania prepara¬ tów bialkowych na drodze jednoetapowej ekstrak¬ cji. Zawartosc bialek w preparacie bialkowym, lugu macierzystym i nierozpuszczalnej pozostalosci otrzymywanych w wyniku dwuetapowej ekstrakcji podano w tablicy II. Otrzymany preparat bialkowy (preparat II) ma barwe jasnokremowo-biala.

Przyklad III. Optymalizacja procesu ekstrak¬ cji o-dwufenoili i oligosacharydów ulegajacych fermentacji z nasion slonecznika odmiany Amiata (Jenisei) w :elu otrzymania koncentratów bial¬ kowych. Uzyta do badan maczka z nasion slonecz¬ nika ma taki sam sklad jak maczka uzyta w przy¬ kladzie II. 20 gramów maczki pozbawionej oleju umieszcza sie w kolbie wraz ze 100 ml rozpuszczal¬ nika skladajacego sie z 92 czesci alkoholu n-bu- tylowego i 8 ml wodnego roztworu kwasu solnego.

Ekstrakcje prowadzi sie w ciagu 15 minut w tem¬ peraturze 25°C jednoczesnie mieszajac zawiesine.

Poczatkowa wartosc pH zawiesiny wynosi 6,2, pod¬ czas reakcji utrzymuje sie wartosc pH na poziomie Tablica II Otrzymywanie preparatów bialkowych na drodze jednoetapowej i dwuetapowej ekstrakcji z koncentratów bialkowych otrzymywanych z maczki z nasion slonecznika, wolnych od o-dwufenoli i oligosacharydów ulegajacych fermentaieji 1 Koncentrat zawartosc azotu w bialkach, •/< 72,9 71,9 ! rodzaj ekstrakcji jednoetapowa (I) NaOH \>. dwuetapowa (I) HbO (II) NaOH 1 PH 9,5 6,5 9,5 Preparat pH ,2 4,0 ,2 j zawartosc bialek, 60,6 '6. 57,1 zawartosc azotu w bialkach, 95,4 $3,3 98,8 barwa jasno- kremowa bialka jasno- kremowa iii zawartosc bialek, •/*, ,5 ,0 4,1 Pozostalosc (Zawartosc bialek, °/tf . 26,9 26,3 o) calkowita ilosc azotu X6,25100131} 13 U ,0, dodajac niewielkie ilosci 0,5 N kwasu sokie^o.

Mieszanine przesacza sie pod zmniejis^onym cisnie¬ niem i powtórnie ekstrahuje w ten sam sposób jeszcze siedmiokrotnie tak, ze koncowa tfrópoiricja maczki do rozpuszczalnika wynosi 1:40.

Otrzymany produkt po wysuszeniu w ciagu 3 go¬ dzin w strumieniu azotu ma nastepujacy sklad: zawartosc wilgoci 10,8% w suchej masie: bialka kwas chlorogenowy mniej niz 0,05% kwas kofeinowy mniej niz 0,05% sacharoza u 1,38% rafinoza ^ v 4 v 1»33% surowe wlókno 4,6°/o( Wyniki te wykazuja, ze zmniejszenie stosunku ekstrakcyjnego maczki do irozpuszczalnika z war¬ tosci 1:160 (przyklad I) do 1:40 nie pogarsza stopnia wyekstrahowania kwasu chlccogenowego i kwasu kofeimowego (w obu przykladach zawartosc tych kwasów w produkcie koncowym byla mniejsza miiz 0,05%, natomiast zmniejsza sie ilosc wyekstraho¬ wanej sacharozy i irafinozy.

Przyklad IV. Otrzymywanie koncentratów bialkowych ze zlusizczonych naisiion bawelny o niskiej zawartosci gosipolu.

Do badan stosuje siie maczke z nasion bawelny o nastepujacym skladzie: zawartosc wilgoci 10,0% w suchej •masie maczki: bialka tluszczu mniejniz l,0%j wolnygosipol 1,45% calkowita zawartosc gosipolu 1,93% surowe wlókna 1,0% gramów odtluszczonej maczki z nasion ba¬ welny miesza sie w kolbie z 400 ml rozpuszczaanijka skladajacego sie z 92 czesci alkoholu n-butylowego i 8 czesci wodnego iroztworu kwasu solnego. Eks¬ trakcje prowadzi sie w ciagu 15 minut w tem¬ peraturze 25°C z jednoczesnym mieszaniem. Po¬ czatkowa wartosc pH mieszaniny wynosi 6,1, na¬ tomiast podczas ekstrakcji utrzymuje sie je na po¬ ziomie wartosci 4,0 za pomoca dodawania nie¬ wielkich .ilosci 0,5 N kwasu solnego. Mieszanine odsacza sie pod zmniejszonym cisnieniem na lejku Biicknera uzywajac saczka z bibuly filtracyjnej Whatmana Nr 3, a pozostalosc ekstrahuje sie w ten sam sposób jeszcze siedmiokrotnie tak, ze koncowy stosunek maczki do rozpuszczalnika wynosi 1:160.

Otrzymany koncentrat bialkowy, suszony w ciagu 3 godzin w strumieniu azotu ma nastepu¬ jacy sklad: zawartosc wilgoci 10,5% w suchej masie koncentratu: bialka (NX6,25) 66,5% tluszcze mniejniz 0,5% wolny gosipol 0,07% calkowita zawartosc gosipofu 0,34% surowe wlókna 2,7% Jak widac, ekstrahowanie mieszanina alkohol * n-butylowy — wodny roztwór kwasu solnego, po¬ il zwala" otrzymac w warunkach niedenaturujacych koncentrat bialkowy (zawierajacy 66,5% bialek) o niewielkiej zawairtosci wolnego oraz calkowitego gosipolu. Sposób wedlug wynalazku ma te zalete, • ze równiez maczka z ziarn bawelny o wysokiej zawartosci gosipolu, dotychczas nieuzyteczna do tego celu, moze byc wykorzystania do otrzymywa¬ nia koricenliiratów" bialkowych i preparatów bialko¬ wych. 11 Przyklad V. Otrzymywanie koncentratów bialkowych ze zluszczonych nasion soi odmiany Ada zawierajacych niewielkie dlpsci zdolnych do fermentacji oligosacharydów.

Skiad chemicznymaczjri: zawartosc wilgoci 11,2% w suchej masie maczki: bialka (NX6,25) 53,8%[ tluszcze (mniejniz # 1,0% M sacharoza 8,24% rafinoza 0,94% stachioza 4,70% surowe wlókna 1,30% gramów pozbawionej oleju maczki sojowej li miesza sie w kolbie z 400 ml rozpuszczalnika skla¬ dajacego sie z 92 czesci alkoholu n-butylowego i 8 czesci wodnego roztworu kwasu solnego.

Ekstrakcje prowadzi sie w ciagu 15 minut w tem¬ peraturze 40°C z jednoczesnym mieszaniem. Po- 50 czatkowa wartosc pH roztworu wynosi 6,3, a pod¬ czas ekstrakcji utrzymuje sie je na poziomie 4,5 dodajac niewielkie ilosci 0,5 N kwasu solnego.

Zawiesine przesacza sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem na lejku Buchnera uzywajac saczka z bibuly M filtracyjnej Whatmana Nit 3 otrzymujac stala po¬ zostalosc. Ekstrakcje powtarza sie siedmiokrotnie tak, ze koncowy stosunek maczki do rozpuszczal¬ nika wynosi 1:160.

Koncowy produkt suszony w ciagu trzech godzin w strumieniu azotu, ma nastepujacy sklad: zawartoscwilgoci 9,3%i w suchej masie: bialka (NX6,25) 65,9%( sacharoza 0,41% 45 rafinoza 0,83% stachioza 2,82% surowe wlókna 2,4%| Produkt ten z powodu zawartosci bialek (65,9%) 50 nazwano koncentratem bialkowym. Zawdeca on niewielkie ilosci oligosacharydów zdolnych do fermentacji. 40 55

Claims (10)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób ekstrakcji fenoli i oligosacharydów z materialów bialkowych ziarna roslin zawieraja¬ cych fenole i oldgosacharydy przy uzyciu cieklego ukladu ekstrakcyjnego, znamienny tym, ze ma- 60 terialy bialkowe ziarn roslin poddaje sie dzialaniu zapewniajacej ekstrakcje ilosoi nonmalnego alko¬ holu butylowego w polaczeniu z mieszajacym sie z nim wodnym roztworem elektrolitu o charakterze kwasnym, takiego jak kwas organiczny lub nie¬ ci organiczny lub ich kwasne sole.100 130 15

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze rozpuszczalnik stasuje sie w takiej -ilosci, aby sto¬ sunek masy ekstrahowanej do rozpuszczalnika za¬ wieral sie w granicach 1:5—1:240.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie wodny roztwór elektrolitu o wartosci pH równej 2,0—6,0.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ekstrakcje prowadzi sie w temperaturze od tempe¬ ratury 4°C do temperatury, w której rozpoczyna sie proces deoaturacji bialka.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako elektrolit stosuje sie kwas nieorganiczny.

6. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze jako kwas nieorganiczny stosuje sie kwas solny. 10 15 18

7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ekstrakcji poddaje sie maczke z ziarn slonecznika, maczke z ziarn bawelny lub maczke sojowa.

8. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze maczke sojowa, maczke z ziarn slonecznika lub maczke z ziarn bawelny poddaje sie dzialaniu za¬ pewniajacej ekstrakcje ilosci mieszaniny normal¬ nego alkoholu butylowego, wody i kwasu solnego.

9. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze rozpuszczalnik stosuje siie w takiej ilosci, aby stosunek masy ekstrahowanej do rozpuszczalnika zawieral sie w granicach 1:5—1:240.

10. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze stosuje sie wodny roztwór elektrolitu o wartosci pH równej 2,0—6,0. LZGraf. 2-d Nr 2 — 1484/79 90 egz. A-4 Cena 45 zl