DE2606961A1 - Verfahren zum extrahieren von phenolen und oligosacchariden aus pflanzlichem gewebe - Google Patents

Verfahren zum extrahieren von phenolen und oligosacchariden aus pflanzlichem gewebe

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Description

Verfahren zum Extrahieren von Phenolen und Oligosa cchariden aus pflanzlichem Gewebe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Extrahieren von Phenolen und Oligosacchariden aus pflanzlichem Gewebe zur Herstellung von Proteinkonzentraten und Isolaten mit einem geringen Gehalt an Nicht-Bahrungsfaktoren und chromogenen Verbindungen.
Es ist bekannt, daß im Pflanzen^-reich phenolische und polyphenolische Verbindungen weit verbreitet sind und sich in freier Form oder gebunden an proteinische und glucidische Bestandteile in verschiedenen Teilen der Pflanzen finden, aber hauptsächlich in Samen, Blättern Stengeln und Wurzeln (Loomis, W.D. und Battaile, J. Phytochemistry, !5, 423 (1966) und Pierpoint, W.S., Biochem. J., 112, 609 (1969)}. Diese natürlichen Substanzen besitzen die Eigenschaft, daß sie zu Chinonen oxidiert werden und diese wieder in alkalischer Umgebung schnell polymerisieren und mit Proteinen unter Bildung kovalenter
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und Wasserstoffbrückenbindungen reagieren.
Die Oxidation von Phenolen zu Chinonen findet in Gegenwart von Sauerstoff statt, aber auch durch Einwirkung einiger Enzyme, wie Phenoloxidase, Peroxidase und anderen.
Die Anwendung von aus Pflanzen extrahierten Proteinen für die menschliche Ernährung ist stark beschränkt durch das Vorhandensein phenolischer Bestandteile aus den folgenden wirtschaftlichen und ernährungstechnischen Gründen:
Die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen den Phenolen und einigen essentiellen Aminosäuren, die in den Isolaten vorhanden sind, setzt deren nährwert so stark herab, wie die neuen Kondensationsverbindungen gebildet werden und auf diese Weise können die Aminosäuren vom Menschen nicht metabolysiert werden. So stellen die phenolischen Substanzen, wenn sie nicht entfernt werden, Antinährstofffaktoren dar.
Die schnelle Oxidation solcher Verbindungen verleiht daher entsprechend dem|pH-Wert den Proteinen eine grün-braune Farbe, die sie als Nährstoffe ungeeignet macht.
Das Vorhandensein phenolischer Bestandteils setzt die Möglichkeit Protein zu extrahieren herab aufgrund ihrer Wechselwirkung mit den Proteinen selbst.
Einige Phenole sind toxisch, z.B. Gossypol, ein Phenolbialdehyd, das in Baumwollsamen enthalten ist.
Die Verfahren, die bisher zur Entfernung derartiger Verbindungen aus pflanzlichen Mehlen bekannt sind, sind nicht zufriedenstellend, da sie keine Extraktion ermöglichen, die ausreicht, farblose Extrakte herzustellen (Smith, A.K., und Johnsen, V.L. Ceral. Ghem. 25, 399 (1948) und Pomenta,
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J.V. und Burns, E.P., J. Food Soi., 36, 490 (1971))oder zur mehr oder weniger ausgeprägten Denaturierung von Proteinen führen (Joubert, F.J., Biochem.Biophys. Acta, 1j6, 520 (1955); Gheyasudding, S., Cater, CM. und Mattil, K.F., Food Technol., 24, 242 (l970);Sosulski, F.W., Mc Cleary, CM. und Soliman, F.S., J. Food Sei., J57, 253 J
Verbindungen, die in pflanzlichen Mehlen ebenfaDLs als unerwünscht angesehen werden, sind die fermentierbaren Oligosaccharide (Raffinose, Stachiose, Verbascose usw.), die zu Blähungen führen und damit die Anwendbarkeit der Mehle und Proteinkonzentrate für Produkte zur menschlichen Ernährung begrenzen. Die Erfindung betrifft ein Verfahren bei dem unter Bedingungen, die für die Proteine nicht denaturierend sind, die phenolischen Pigmente und fermentierbaren Oligosaccharide, die in den Pflanzen vorhanden sind, wirksam extrahiert werden können. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Diffusion von Substanzen mit einem niederen Molekulargewicht in einem polaren Lösungsmittel durch die Membranen der Zellen und subzellulären Organellen ausgenutzt. Das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren ergibt direkt ein Proteinkonzentrat mit einem hohen biologischen Wert, das im wesentlichen frei ist v.on unerwünschten Verbindungen (Chlorogensäure, Gossypol, Raffinose, Stachiose usw.) und das geeignet ist zur Herstellung von Proteinisolaten mit einer hohen Reinheit, einer Farbe von weiß bis creme in dem gesamten Bereich löslicher Proteine»
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Anwendung eines orgnischen polaren Lösungsmittels, wie eines Alkohols, Ketons, Esters und einer wäßrigen Lösung eines sauren Elektrolyten, wie einer organischen und/oder anorganischen Saure oder deren saure Salze.
- 4 -b Π 9 8 3 7 / ü 6 9 8
Durch den Elektrolyt "wird die Wechselwirkung zwischen den Proteinen und Phenolen geschwächt, während die schwachsaure Umgebung, wie sie durch den Elektrolyten erzeugt wird, die Löslichkeit der Phenole erhöht. Das Extraktionsverfahren wird bei einer Temperatur im Bereich von 40C bis zu der Temperatur bei der eine Denaturierung der Proteine beginnt, durchgeführt,wobei so gearbeitet wird, daß das Endverhältnis von Mehl zu Lösungsmittel von 1:5 bis 1:240 variiert und der pH-Wert des Lösungsmittels 2 bis 6 beträgt.
Von den pflanzlichen Mehlen, die Phenole und fermentierbare Oligosaccharide enthalten, wurden Sonnenblumenmehl, Sojabohnenmehl und Baumwollsamenmehl einer Behandlung mit einer sauren Lösung in n-Butanol unterworfen.
Sonnenblumensamenmehl.
ChlorogensäureO^'-Coffeylchininsäure) macht ungefähr 70$ der phenolischen "Verbindungen von Sonnenblumen aus und ist in unterschiedlichen Arten der Samen in Konzentrationen im Bereich von 1 bis 7$ vorhanden. Die rest~ liehen 30$ bestehen aus sieben bekannten Phenolsäuren (Iso-chlorogensäure, Coffeinsäure, p-Cumarsäure, Isoferulinsäure, Perulinsäure, Sinapinsäure und t.rans-Zimtsäure) und einigen noch nicht identifizierten Verbindungen (Sabir, M.A., Sosulski, P.W· und Kernan, J.A., J.Agr. Pood Chem., 22j_ 572, (1974)-.
Die Verwendung von Proteinisolaten aus Sonnenblumenmehl für die menschliche Nahrung wird stark behindert durch das Vorhandesein von Chlorogensäure, die in der leicht alkalischen Umgebung, wie sie für die Extraktion der Proteine angewandt wird, zu Chinon oxidiert wird und sowohl den Auszügen als auch den Proteinisolaten eine Farbe verleiht, die je nach dem pH-Wert "von grün bis braun variiert.
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S ο ,j a b ohnenm ehl
Bei Sojabohnenmehl sind die zu Blähungen führenden Antinähr stoff-Faktor en die fermentierbaren Oligosaccharide, Raffinose und Stachiose (Rackis, J.J. et al., J. Food Sei., 55, 634 (197O)), die im Mittel 40$ der wasserlöslichen niedermolekularen Kohlenhydrate ausmachen. Diese Verbindungen treten auch in Proteinkonzentraten auf, aber nicht in den Isolaten, da sie -während des Proteinextraktionsverfahrens entfernt werden.
Baumwollsamenmehl
Die Hauptbegrenzung für die Verwendung von Baumwollproteinen als Nährstoff beruht darauf, daß in der Proteinfraktion ein toxischer phenolischer Aldehyd,Gossypol (1,1',6,6',7,7«-Hexahydroxy-5,5l-biisopropyl-3,3ldimethyl-2,2·-binaphthalin-8,8'-dicarboxyaldehyd) enthalten ist. Ton dem gesamten G-ossypol reagiert ein Teil mit den Baurawollsamenproteinen und ein Teil findet sich in freier Form. Die toxische Wirkung von Gossypol verhindert die Verwendung von Baumwollsamenproteinen in Nahrungsmitteln,
Es sind verschiedene Verfahren zur Entfernung oder Deaktivierung von G-ossypol bekannt (Vaccarino, C,J. Amer.. Oil Chem. Soc.,_38, 143 (1961);Damaty, S.M. und Hudson, B.J.E., J. Sei. Food Agric. 2_6, 109 (1975)) und einige dieser Verfahren sind wirksam, aber es werden nur Baumwollsamenmehle mit einem geringen Gossypolgehalt angewandt.
Zur genaueren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in der folgenden Beschreibung auf einige Beispiele hingewiesen, die die Extraktion von Chlorogensäure und Raffinose aus Sonnenblumenöl von Gossypol aus Baumwollsamenmehl und von Raffinose und Stachiose aus Sojabohnenmehl betreffen. Für diese Beispiele wurden die folgenden Materialien angewandt und die Verfahren entsprechend angepaßt.
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Materialien.
Chlorogen und Goffeinsäure in reiner Form (Fluka AG, Bucks SGr)7 Sucrose, Raffinose und Stachiose in. reiner Form (Sigma Chem. Co.)f
reine Salzsäure (Merck)
n-Butylalkohol und η-Hexan (Carlo Erba, RPE (Reattivo Puro Erba-Erbafreines Reagens)) als Lösungsmittel { Gossypol-Essigsäure wurde hergestellt durch. Extraktion aus geschältem Baumwollsamen nach dem Verfahren von King, W. H, und Ihurber, F. H., J. Am. Oil Chem. Soc, 50 1 70 (1953) und "besaß eine Reinheit von 98%.
Verfahren
Zur Bestimmung von Stickstoff wurde nach dem Macro-KjeldahlrVerfahren gearbeitet und der ¥ert für den Proteinstickstoff erhalten durch Multiplikation des Gesaratstickstoffes mit 6,25·
Der Feuchtigkeitsgehalt, die Lipide und rohen Fasern wurden nach den Standardverfahren nach A.O.A.C. (Association Official Analytical Chemists, 12. Ausgabe (1975)) bestimmt.
Die Bestimmung (Dosage) der Chlorogensäure in Beispiel 1 wurde nur nach A.O.A.C. method 14.025, 11. Ausgabe (1970) durchgeführt.
Chlorogensäure, Coffansäure, Sucrose und Raffinose wurden in den Beispielen 2 und 3 mit Hilfe gaschromatographischer Verfahren als silylierte Derivate bestimrat(Sabir, M.A. Sosulski, F.W., und Kernan, J.A., J. Agr. Food Chem., 22, 572 (1974)), während Sucrose, Raffinose und Stachiose in Beispiel 5 auf die gleiche Weise bestimmt wurden. Die Analyse von freiem und Gesamt-Gossypol wurde nach dem Standardverfahren A.O.C.S. (Official and Tentative Methods
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of tlie American Oil Chemists1 Society, 3. Ausgabe (1972)) Ba 8-58 "bzw.Ba 8-55 durchgeführt.
Gaschromatographysehe Verfahren (GLC).
Herstellung der Proben: Phenolische Verbindungen und Oligosaccharide wie sie in dem entfetteten Mehl und dem Proteinkonzentrat vorhanden sind, -werden mit 80%-igem wäßrigem Methanol im Verhältnis 1:100 Mehl/Lösungsmittel durch 5 Stunden langes Erhitzen unter Rückfluß extrahiert (Mikolajczak, Σ.Ι., Smith Jr., CR. und Wolff, I.Ä. (1970) J. Agr. Food Chem. 1_8,27). Der methanolische Auszug wird im Vakuum bei 400C zur Trockne eingedampft. Der trockene Rückstand wird mit HC1( pH 2,0 gelöst und die entstehende Lösung durch Zugabe von verdünnter NaOH auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die Lösung wird im Vakuum bei 400C zu Trockne eingedampft. Die phenolischen Verbindungen und Oligosaccharide werden bei Raumtemperatur mit wasserfreira Methanol in einer abgemessenen Menge extrahiert. Die Suspension wird zentrifugiert und eine Fraktion der überstehenden Flüssigkeit unter Stickstoffstrom in Reaktionsfläschchen bei Raumtemperatur zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit einer bekannten Menge IT-Ul rime thylsilylimida ζ öl (TRI-SIL 1Z' der Pierce Chemical Co.) durch Inkubieren bei 600C innerhalb von 2 Stunden silyliert.
Gaschromatographie: Die Gaschromatographie wurde mit Hilfe eines HP 7620 A Gaschromatographen durchgeführt, der mit einem automatischen Integrator HP 3380 A versahen war. Die Versuchsbedingungen waren folgende:
Glassäule 0,32 mm χ 182,9 cm (1/8 in. χ 6 feet)
Stationäre Phase OV-1, 3$ auf Chromosorb WHP 0,177/0,149 mm
(80/100 mesh)
1500C bis 2600C mit
Injektor-Temperatur f- 0 9 8 3000C
Detektor-Temperatur 3000C
Säule 4 min.1500C,
.6°C/min.
30 min. 2600C
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Trägergas Helium
Eließgeschwindigkeit 35ml/min Detektor Elammenionisation
Im Ealle von Sojabohnenmehl wurden die Analysen der Oligosaccharide mit den folgenden Änderungen durchgeführt:
Säulen-Temperatur 4 min. 15O0C, 1500C bis 2500C
mit 6 C/min. 10 min. 2500C, 1500C bis 3200C
mit 15 C/min. 32O0C bis 3400C mit 10°C/min.,
30 min. 3400C
Injektor-Temperatur 35O0C
Detektor-Temperatur 35O0C
Die o-Biphenole und die Oligosccharide der Auszüge wurden aufgrund der Retentionszeiten der entsprechenden reinen Verbindungen identifiziert. Die quantitative Analyse der verschiedenen Peaks wurde mit dem automatischen Integrator durchgeführt. Bekannte Mengen von ChIorοgensäure, Coffeinsäure, Sucrose, Raffinose und Stachiose, die zu den Auszügen zugegeben worden waren, wurden mit quantitativen Ausbeuten zurückgewonnen.
Elektrophorese
Die elektr ophor etische Analyse auf 7,5$ Polyacrylamid-G-el wurde in einer vertikalen Vorrichtung der Canalco Industrial Corporation, Rockville, Maryland unter Verwendung von Trisglycin mit einem pH-Wert von 9,5 als Puffer durchgeführt (Davis, B., (1964) Ann. Η".Y. Acad.Sci., J_2J_, 404).
Herstellung der pflanzlichen Mehle
Die Mehle, die der Extraktion der Phenole und Oligosaccharide unterworfen werden sollten, wurden folgendermaßen hergestellt: Sonnenblumensamen, Baumwollsamen und Sojabohnen, die vollständig von den Hüllen befreit waren, wurden bei +40C in
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-S-
einem OMNI-MIXER-Homogenisator von Sörvall in Gegenwart von η-Hexan im Verhältnis von 1 Teil Samen zu 2 Teilen Lösungsmittel vermählen. Die Mehle wurden dann mit η-Hexan in einem Gewichtsverhältnis von 1:10 16 Stunden hei 250C unter Rühren entfettet. Das Lösungsmittel wurde mit Hilfe einer Filterpumpe unter Vakuum mit einem Büchner Porzellanfilter und Whatman Nr. 4-Fi It er pa pi er abfiltriert. Die Mehle wurden unter Stickstoffstrom 1 Stunde hei 25°C getrocknet und mit einer Bühler Vorrichtung auf eine Feinheit Nr. 2 vermählen. Die chemische Zusammensetzung des trockenen Produktes wurde nach Standardverfahren auf die Feuchtigkeit, Proteine, Lipide und rohe Fasern "bestimmt. Der Gehalt an Phenolen und Oligosaccharidenin dem Sonnenblumenmehl und Sojamehl wurde mit Hilfe gaschromatographischer Verfahren bestimmt.
Extraktion von Chlorogensäure aus Sonnenblumenöl(Beispiel 1)
Die Herstellung des nach diesem Beispiel verwendeten Lösungsmittels zur Extraktion von Chlorogansäure aus Sonnenblumenöl wurde folgendermaßen durchgeführt: Ein Liter n-Butylalkohol wird mit einem Liter einer wäßrigen Salzsäurelösung 0,5 χ 10 η, pH 2,48 vermischt,wobei die Flüssigkeit gelegentlich gerührt und über Nacht in einem Scheidetrichter stehen gelassen wird. Die obere Phase, die nach dem Verwerfen der wäßrigen sauren Phase gesammelt wird , stellt" das für das Extraktionsverfahren zu verwendende Lösungsmittel dar.
Das auf die oben agegebenen Weise hergestellte Sonnenblumenmehl wird mit Hilfe einer Fritsch Analysette 3> einer Siebevorrichtung auf eine Korngröße von 0,05 mm gesiebt und mit dem Lösungsmittel in einem Verhältnis (Gew./Vol·) von 1:50 30 Minuten bei 300C unter Rühren vermischt.
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Die Suspension wird mit 500 UpM mit einer Sörvall RB-2-Zentrifuge mit einem Rotor SS-34 bei Raumtemperatur 10 Minuten zentrifugiert.
Nach dem Abdekantieren der Übersteheden Flüssigkeit wird die Extraktion mehrere Male (5 bis 10 Extraktionen) mit dem Lösungsmittel auf die oben beschriebene Weise widerholt. Der Verlauf der Extraktionen wird verfolgt durch Messung jedes Butanol-Auszuges bei 328 nm, d.h. bei der maximalen Absorption von Chlorogensäure, die in dem Lösungsmittel gelöst ist. Der Absorptionskoeffizient (-A-I^ ) von Chlor ogensäure bei dieser Wellenlänge beträgt 51»3. Bei vollständiger Extraktion mit dem Lösungsmittel wird die feste Phase unter Stickstoffstrom 3 Stunden getrocknet und der Restgehalt an Chlorogensäure in diesem Material mit Hilfe des A.O.A.C. 14.025-Verfahrens bestimmt.
Extraktion von Phenolen und Oligosacohariden aus Sonnen-r blumenmehl, Baumwollsamenmehl und Sojabohnenmehl (Beispiele 2, 3. 4 und 5).
Das Lösungsmittel zur Extraktion von Phenolen und Oligosacchariden aus den Mehlen von Sonnenblumensamen, Baumwollsamen und Sojabohnen wurden folgendermaßen hergestellt:
92 Teile n-Butylalkohol werden mit 8 Teilen einer wäßrigen Salzsäurelösung beim pH von 2,3 vermischt. Bei diesen Verhältnissen ist das organische Lösungsmittel mit der wäßrigen Phase gründlich mischbar. Das entstehende Lösungsmittel wird zu dem zu extrahierenden Mehl in unterschiedlichen Verhältnissen Mehl zu Lösungsmittel unter 15 Minuten langem Rühren bei verschiedenen Temperaturen zugegeben. Der pH-Wert der Suspension wird konstant gehalten in dem Bereich der minimalen Löslichkeit, der in dem Mehl enthaltenen Proteine, der bestimmt wird.
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Die Konstanz der pH-Wertes wird erreicht durch Zugabe von 0,5 η Salzsäure zu der Suspension, die gerührt wird oder auch durch Zugabe einer pH 0,5 Lösung, bestehend aus 92 Teilen n-Butylalkohol und 8 Teilen einer wäßrgien Salzsäurelösung. Die Suspension wird über Whatman Nr. 3-Filterpapier filtriert und die Extraktion des Rückstandes auf die oben beschriebene Weise widerholt (2 bis 8 mal). Nach vollständigen Extraktionen wird, das so erhaltene Proteinkonzentrat mindestens 3 Stunden unter einem Stickstoffstrom getrocknet. An verschiedenen Anteilen des trockenen Materials wird die chemische Zusammensetzung bezüglich Feuchtigkeit, Proteinen, lipiden und rohen Fasern bestimmt. Bei einem derartigen Konzentrat werden die Restgehalte an Chlorogensaure, Coffeinsäure, Gossypol, Sucrose, Raffinose und Stachiose bestimmt.
Herstellung von Proteinisolaten.
Die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltenen Proteinkonzentrate wurden zwei unterschiedlichen Proteinextraktionsverfahren unterworfen:
Einem einstufigen nicht-selektiven Extraktionsverfahren in einem alkalischen Medium und einem zweiten zweistufigen Verfahren, bei dem eine Fraktionierung zwischen den niedermolekularen wasserlöslichen Proteinen mit einer hohen elektrophoretischen Mobilität und den Proteinen auftritt, die in einem alkalischen Medium löslich sind und ein hohes Molekulargewicht und eine geringe elektrophoretische Mobilität besitzen. Das zweite Verfahren ergibt zwei Isolate mit unterschieälichen Zusammensetzungen und Eigenschaften.
Einstufige Extraktion.
Ein Teil des bei dem Extraktionsverfahren erhaltenen Proteinkonzentrates wird in 15 Teilen Wasser aufgeschlämmt, dessen pH-Wert mit 0,2 η NaOH auf 9,5 eingestellt ist (Mehl/Lösungsmittel 1:15 Gew./Vol.) und 30 Minuten bei 250C gerührt.
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Die Aufschlämmung wird 20 Minuten mit einer Sörvall RB-2-Zentrifuge mit einem SS-34-Roto± bei 17000 ITpM zentrifugiert. Der Rückstand wird nochmals unter den gleichen Bedingungen extrahiert· Die "beiden überstehenden Flüssigkeiten werden zusammengegeben und die Proteine durch Zugabe von 0,5 η HCl bis zum isoelektrischen Punkt ausgefällt. Der Niederschlag wird durch 10 Minuten langes Zentrifugieren mit 17000 TJpM abgetrennt und mit einer sauren wäßrigen Lösung gewaschen . Der Proteinr niederschlag wird mit einem wäßrigen Medium aufgenommen^ auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert und gefriergetrocknet ·
Die Bestimmung des Gesamtstiokstoffes nach dem Kjeldahl-Yerfahren wurde an dem niederschlag der überstehenden Flüssigkeit und dem unlöslichen Rückstand durchgeführt.
Zweistufige Extraktion.
I. Ein Teil des Proteinkonzentrates wurde mit 15 Teilen Wasser mit einem pH-Wert von 6,5 30 Minuten unter Rühren bei 250O behandelt (Mehl/Lösungsmittel 1:15 Gew./ToI.). Die Suspension wird 20 Minuten mit 17000 ITpM zentrifugiert und der Rückstand einer zweiten Extraktion unter den gleichen Bedingungen unterworfen. In den beiden zusammengegebenen überstehenden Flüssigkeiten werden die Proteine durch Einstellung des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt ausgefällt. Der Mlederschalg wird mit einer sauren lösung gewaschen, wieder in Wasser aufgeschlämmt, auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert und gefriergetrocknet.
II. Der von dem ersten Extraktionsschritt kommende unlösliche Rückstand wird in einem alkalischen Medium bei einem pH-Wert von 9,5 gelöst und wie bei dem einstufigen Verfahren extrahiert.
Die Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert.
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Beispiel 1
Extraktion von Chlorogensäure aus Sonnenblumensamenmehl derrimiata (Jenisei)
Chemische Zusammensetzung der Samen:
Feuchtigkeit 3,8
Bezogen auf Trockensubstanz:
Proteine (IT.6,25) 24,9
Lipide 58,7
Chlorogensäure 1,9
Rohe Faser 2,4
Nicht-stickstoffhaltiger Auszug
Substanzen 8,7
Aschen 3,4
Das wie oben hergestellte Sonnenblumensamenmehl besitzt die folgende Zusammensetzung:
Feuchtigkeit 8,8 % Bezogen auf Trockensubstanz:
Proteine (N.6,25) 64,6 <fo
Lipide < 1,0 %
Chlorogensäure 4,8 $
Rohe Fasern 3,9 #
10 g Mehl mit einer Teilchengröße von 0,05 mm v/erden in einem Kolben mit 300 ml Lösungsmittel 30 Minuten bei 300C unter Rühren vermischt. Das Gemisch wird mit 5000 UpM 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, dekantiert und mit weiteren 300 ml frischem Lösungsmittel erneut extrahiert. Diese Behandlung wird nacheinander insgesamt 8 mal durchgeführt (Endverhältnis Mehl/LÖsungsmittel 1:240).
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Der Chlorogensäuregehalt jedes Auszuges wurde spektrophotometrisch bei 328 nm gegen eine Lösungsmittel-Blindprobe bestimmt. Man erhielt die in Tabelle 1 angegebenen Werte.
Tabelle I
Anzahl der Extraktionen extrahierte Ohiorogensäure
(mg/10 g Mehl)
1 203,5
2 99,2
3 53,8
4 31,0
VJl 19,3
6 7,8
7 6,2
8 4,3
In dem Rückstand der 8 Extraktionen der 3 Stunden unter Stickstoffstrom getrocknet war, wurde der Ghlorogensäuregehalt nach dem A.O.A.C.-Verfahren 14,025 bestimmt.
Fach 8 Extraktionen war der Gehalt an Chlorogensäure geringer als 0,2 #.
Beispiel 2
Herstellung von Proteinkonzentraten und Isolaten aus Sonnenblumensamen der Art Atniata (Jenisei), die frei sind von chromogenen Verbindungen und fermentierbaren Ogliosacchariden.
a) Herstellung von Proteinkonzentraten, die frei sind von o-Biphenolen und Oligosaccharide^
Das angewandte Mehl besaß die folgende Zusammensetzung:
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Feuchtigkeit 10,6 % Auf Trockenbasis:
Proteine (N.6,25) 58,7 $
Lipide < 1,0 $
Chlorogensäure 1,56$
Coffeinsäure 0,14$
Sucrose 4,7 $
Raffinose 3,32$
rohe Faser 4,2 $
20 g entfettetes Sojabohnensamenmehl werden in Kolben mit 400 ml Lösungsmittel, "bestehend aus 92 Teilen n-Butylalkohol und 8 Teilen einer v/äßrigen Salzsäurelösung, vermischt· Die Extraktion dauert 15 Minuten "bei 250G unter Rühren, Der Anfangs-pH-Wert der Suspension beträgt 6,2. Während der Extraktion wird er auf 5»0 eingestellt und durch Zugabe kleiner Mengen 0,5 η Salzsäure auf diesem Wert gehalten. Die Suspension wird über einen Büchnertrichter unter Vakuum mit Whatman ITr. 3 -Filterpapier filtriert" und die Extraktionen werden an dem festen Rückstand wiederholt (insgesamt 8 Extraktionen Endverhältnis Mehl/ Lösungsmittel 1:160).
Das entstehende Produkt wird 3 Stunden unter Stickstoffstrom getrocknet und besitzt folgende Zusammensetzung:
Feuchtigkeit 12,2 $
Auf Trockenbasis:
Proteine (N.6,25) 72,9 $
Chlorogensäure <0,05$ ] Werte geringer als die
Goffeinsäure * <0,05$ ) EmpfindiicllkeitSgrenzen
Sucrose <0,01$ ) des angewandten Verfahrens
Raffinose <0,05$
rohe Fasern 4»8 $
Diese Produkt wird aufgrund seines Proteingehaltes (72,9$) als Proteinkonzentrat bezeichnet. Es ist im wesentlichen frei von Oligosacchariden und phenolischen Bestandteilen
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die für die grüne Farbe verantwortlich sind, die während der Extraktion von Proteinen in einem alkalischen Medium auftritt. Die elektrophoretisch^ Analyse auf einem Polyacrylamid-Gel der aus dem Konzentrat extrahierten Proteine zeigt, daß sie das gleiche elektrophoretische Muster "besitzen, wie die aus Sonnenblumensamenmehl extrahierten.
b) Herstellung von Proteinisolaten durch Extraktion in einer Stufe.
10 g Proteinkonzentrat werden in 150 ml einer alkalischen wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von 9,5 (Verhältnis Mehl/lösungsmittel 1:15 Gew./Vol.) 30 Minuten unter Rühren bei 25 C aufgeschlämmt. Der pH-Wert der Suspension wird während der gesamten Extraktionszeit durch Zugabe kleiner Anteile verdünnter NaOH-Lösung konstant auf einem Wert von 9,5 gehalten. Die Suspension wird mit 17000 UpM 20 Minuten zentrifugiert und der Rückstand wieder unter den oben angegebenen Bedingungen extrahiert. Die beiden Proteinlösungen werden zusammengegeben und mit 0,5 η HCl bei pH 5»2 ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren bei 17000 UpM innerhalb von 10 Minuten abgetrennt, mit saurem Wasser, pH 5,2, gewaschen, wieder in Wasser aufgeschlämmt, auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert und gefriergetrocknet. Die Proteingehalte des Isolats/der Übersteheden Flüssigkeit und des unlöslichen Rückstandes bei dem einstufigen Extraktionsverfahren sind in Tabelle II angegeben.
Die Farbe des Isolats ist helleremefarben-weiß.
c) Herstellung von Proteinisolaten durch zweistufige Extraktion.
11 10 g Proteinkonzentrat werden zur 150 ml einer wäßrigen Lösung pH 6,5 gegeben (Mehl/Lösungsmittel 1:15 Gew./Vol.) und 30 Minuten bei 250O gerührt, Der pH-Wert der Suspension
098 3 7/0698
•wird konstant auf 6,5 gehalten durch Zugabe kleiner Mengen einer 0,02 η NaOH-Lösung.Die Suspension wird mit 17000 UpM 20 Minuten zentrifugiert und der Rückstand wieder unter den gleichen Bedingungen extrahiat. Die beiden zusammengegebenen Proteinlösungen werden mit 0,5 η HCl bei einem pH'-Wert von 4,0 ausgefällt. Der Niederschlag wird mit 17000 UpM 10 Minuten lang ab-23ntrifugiert, mit saurem Wasser, pH 4»0, gewaschen, wieder in Wasser aufgeschlämmt, auf einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert und gegebenenfalls gefriergetrocknet.
Das Isolat I ist weiß.
II) Aus dem unlöslichen Rückstand aus der vorigen Verfahrensstufe werden die Proteine in alkalischem Medium bei einem pH-Wert von 9,5»wie für die einstufige Proteinextraktion beschrieben, extrahiert.
Die Proteingehalte des Isolats der überstehenden Flüssigkeit und des unlöslichen Rückstandes für das zweistufige Extraktionsverfahren sind in Tabelle II angegeben.
Das Isolat II besitzt eine leicht oremefarbene-weiße Farbe.
Tabelle II
609837/0698 - 18 -
Tabelle II
Herstellung von Proteinisolaten nach einem ein- und zweistufigen Verfahren aus einem
Sonnenblumensamenkonzentrat^ das frei ist von o-Biphenolen und fermentierbaren Oligosacchariden.
cn ο co oo u> -j
O CD CD OO
KONZENTRAT 9 pH PH ISOLAT Protein- Farbe überstehende
Flüssigkeit		 RÜCKSTAND I
CO
I
Protein- Extraktions- 6 Protein Stickstoff Protein Protein
Stickstoff'1"'' verfahren 9 ausbeute ausbeute ausbeute
72,9 1-stufig ,5 5,2 95,4 hell
creme
(I) NaOH
71,9 2-stufig		 ,5 4,0 60,6 83,3 weiß 10,5 26,9
(I) H2O ,5 5,2 5,6 98,8 hell
creme		 5,0
(II) NaOH 57,1 4,1 26,3
+) Gesamtstickstoff χ 6,25
ΚΩ
co CD
Beispiel 3
Optimierung des Extraktionsverfahrens von o-Biphenolen und feremtierbaren Oligosacchariden aus Sonnenblumensamen der Art Amiata (Jenisei) zur Herstellung von Broteinkonzentraten.
Das angewandte Sonnenblumenmehl besaß die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 2 angegeben.
20 g entöltes Mehl werden in einem Kolben zu 100 ml eines Lösungsmittels aus 92 !Teilen n-Butylalkohol und 8 Teilen einer wäßrigen SaIzsäure-Lösung gegeben. Die Extraktion wird 15 Minuten bei 250C unter Rühren durchgeführt. Der Anfangs-pH-Kert'der Suspension beträgt 6,2 und wird während der Extraktion durch Zugabe kleiner Anteile 0,5 η HCl auf 5,0 gehalten. Die Suspension wird unter Vakuum filtriert und es werden 8 Extraktionen an dem festen Rückstand durchgeführt (Endverhältnis Mehl/Lösungsmittel 1:40). Das entstehende Produkt besitzt nach 3-stündigem !Trocknen unter einem Stickstoff strom die folgende Zusammensetzung:
Feuchtigkeit 10,8 fo
Auf Trockenbasis:
Proteine (N 6,25) 69,0 %
Chlorogensäure < 0,05%
Coffeinsäure < 0,05%
Sucrose 1,38%
Raffinose 1,33%
rohe Fasern 4,6 %
Diese Ergebnisse zeigen, daß beim Übergang von einem Extraktionsverhältnis Mehl/Lösungsmittel von 1:160 (Beispiel 1) zu einem Verhältnis von 1:40 der Restgehalt an Chlorogensäure und Coffeinsäure nicht verändert wird (weniger als 0,05%), während die Extrahierbarkeit von
f. 0 98 3 7 / Π β 9 8 - 20 -
Sucrose und Raffinose abnimmt.
Beispiel 4
Herstellung von Proteinkonzentraten mit niederem Gossypolgehalt aus enthülsten Baumwollsamen.
Das angewandte Baumwollsamenmehl besaß die folgende Zusammensetzung:
Feuchtigkeit 10,0 % Auf Trockenbasis:
Proteine (N.6,25) 47,6 %
Lipide 1,0 i»
freies G-ossypol 1,45$
Gesamt-Gossypol 1,93%
rohe Fasern 1,0$
20 g entfettetes Baurawollsamenmehl werden in einem Kolben zu 400 ml eines Lösungsmittels aus 92 Teilen n-Butylalkohol und 8 Teilen wäßriger Salzsäure gegeben. Die Extraktion läuft innerhalb von 15 Minuten bei 250C unter Rühren ab. Der Anfangs-pH-Wert der Suspension beträgt 6,1 und wird während der Extraktion durch Zugabe einzelner Anteile 0,5 η HCl konstant auf 4,0 gehalten. Die Suspension wird unter Yakuum auf einem Büchner Trichter mit Whatman Mr. ^-Filterpapier filtriert und der feste Rückstand unter den oben angegebenen Bedingungen 8 mal extrahiert (Endverhältnis Mehl/Lösungsmittel 1:160. Das entstehende Proteinkonzentrat wird unter einem Stickstoffstrom 3 Stunden getrocknet und besitzt die folgende Zusammensetzung:
Feuchtigkeit 10,5 $ Auf Trockenbasis:
Proteine (N.6,25) 66,5 ?έ
Lipide < 0,5 $
freies Gossypol Q,07$
Gesamt-Gossypol 0,34$
rohe Fasern 2,7 $
60 9837/DR38
- 21 -
Die Behandlung mit n-Butylalkohol und wäßriger Salzsäure ergab ein Proteinkonzentrat (66,5% Proteine) unter nioht-denaturierenden Bedingungen mit einem geringen Restgehalt an freim und Gesamt-Gossypol. Das erfindungsgemäße Verfahren "besitzt den Vorteil, daßeluch auf Baumwollsamenmehle mit einem hohen Gossypolgehalt angewandt werden kann, wie sie "bisher zur Herstellung von Proteinkonzentraten und Isolaten nicht geeignet waren.
Beispiel 5
Herstellung von Proteinkonzentraten mit geringen Gehalten an fermentier "baren Oligosacchariden aus enthülsten Sojabohnen der Art Ada.
Chemische Zusammensetzung des Mehls:
Feuchtigkeit 11,2 io
Auf Trockenbasis:
Proteine (F 6,25) 53,8 %
Lipide < 1,0 /o
Sucrose 8,24%
Raffinose 0,94%
Stachiose 4,7"%
rohe Fasern 1,3 %
20 g entöltes Sojamehl werden in einem Kolben zu 400 ml eines Lösungsmittels, bestehend aus 92 Teilen n-Butylalkohol und 8 Teilen wäßriger HCl gegeben. Die Extraktion wird 15 Minuten bei 400C unter Rühren durchgeführt. Der Anfangs-pH-Wert der Suspension beträgt 6,3 und wird während der Extraktion durch Zugabe kleiner Anteile 0,5 η HCl auf einen Wert von 4,5 gebracht und auf diesem Wert gehalten.
Die Suspension wird unter Vakuum auf einem Büchner Trichter mit Hilfe von Whatman Nr. 3 Filterpapier filtriert und der feste Rückstand insgesamt 8 mal extrahiert (Endver-
609837/0698
- 22 -
tLältnis Mehl/Lösungsmittel· 1:160). Das entstehende Produkt besitzt nach 3 Stunden langem Trocknen unter Stickstoffstrom die folgende Zusammensetzung:
Feuchtigkeit 9.»3 $ Auf Trockenbasis:
Proteine (F 6,25) 65,9 $
Sucrose 0,4-1$
Raffinose 0,83$
Stachiose 2,82$
rohe Fasern 2,4 $
Das Produkt ist aufgrund seines Proteingehalts (65,9$) ein Proteinkonzentrat und besitzt geringe Gehalte an fermentierbaren Oligosacchariden.
PATENTANSPRÜCHE
609837/f)fi98

Claims (1)

  1. Patentansprüche
    1· Verfahren zur Extrahiern von Phenolen und Oligosacchariden aus pflanzlichen Geweben, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man die entsprechenden Pflanzenteile oder daraus gewonnene Produkte mit einem polaren organischen lösungsmittel, bestehend aus einem Alkohol, einem Keton oder einem Ester und mit einer wäßrigen Lösung eines sauren Elektrolyten, wie einer organischen oder anorganischen Säure und/oder einem sauren Salz davon behandelt.
    2. Verfahren nach Ansprch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man ein Gesamtverhältnis gelöste Stoffe zu Lösungsmittel von 1:5 bis 1:240" anwendet.
    3. Verfahren nach Ansprch 1 oder 2, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man bei einem pH-Wert der wäßrigen Lösung des Elektrolyten von 2,0 bis 6,0 arbeitet.
    4. Verfahren nach Ansprch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Temperatur im Bereich von 40C bis zu der Temperatur,bei der eine Denaturierung der Proteine beginnt, arbeitet.
    5ο Verfahren nach Ansprch 1 bis 4» dadurch g e k e η η zeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel n-Butyl-
    — 2 —
    O 9 8 3 7 / η R 9 8
    alkohol verwendet.
    6. Verfahren nach Anspruoh 1 bis 5, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man als Elektrolyt eine anorganische Säure verwendet.
    7. 7erfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säure Salzsäure verwendet.
    8. Verfahren nach Ansprch 1 bis 6, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man von Sonnenblumensamenmehl, Ba timwollsamenmehl und/oder Sojabohneniaehl ausgeht.
    6287
    609837/0698
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