DE69921778T2

DE69921778T2 - Verfahren zur herstellung von isoflavonverbindungen

Info

Publication number: DE69921778T2
Application number: DE69921778T
Authority: DE
Inventors: Minoru Takebe; Jitsuo Shiraishi
Original assignee: Nichimo Co Ltd
Current assignee: Nichimo Co Ltd
Priority date: 1998-01-12
Filing date: 1999-01-12
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2019-01-13
Also published as: EP1054008A4; EP1054008B1; ES2232107T3; WO1999035138A1; ATE282032T1; JP4397525B2; EP1054008A1; US6410699B1; DE69921778D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Erfindungsgebiet
Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen aus Materialien, die Isoflavonverbindungen enthalten, insbesondere aus denjenigen Pflanzen, die Glieder einer solchen Familie wie Leguminosae, Rosaceae, Iridaceae, Morus und Amarantus inamoenus sind. Insbesondere betrifft vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen aus Hülsenfrüchten, insbesondere Isoflavonaglycone, die Hydrolysate von Isoflavonglycosiden sind.
HINTERGRUNDTECHNIK
Isoflavon wird durch folgende Formel (I) wiedergegeben:
Insoweit wurde bekannt, dass Isoflavon natürlich in solchen Pflanzen vorliegt, die zu den Familien Leguminosae, Rosaceae, Iridaceae, Morus und Amarantus inamoenus gehören, insbesondere in Hülsenfrüchten.
Isoflavonverbindungen oder deren Vorläufer besitzen die durch die obige Formel (I) wiedergegebene Grundstruktur sowie verschiedene Substituenten, wie z. B. Alkyl-, Hydroxyl- oder Alkyloxylgruppen.
Isoflavonverbindungen sind durch folgende Formel (II) wiedergegeben:
Repräsentative Beispiele solcher Isoflavonverbindungen sind in Tabelle A gezeigt. Tabelle A
Unter den Isoflavonverbindungen, welche die obige Formel (II) besitzen, werden diejenigen, deren Substituent R₁ Glucose ist, als Isoflavonglycoside bezeichnet, während Hydrolysate von Isoflavonglycosiden als Isoflavonaglycone bezeichnet werden.
In jüngeren Jahren wurde bekannt, dass Isoflavonverbindungen Estrogenwirkung, Antiestrogenwirkung, antioxidierende Wirkung, antihämolytische Wirkung, antibakterielle Wirkung, antilipämische Wirkung, Anticholesterinwirkung, anticonvul sive Wirkung, eine die Differenzierung von Krebs befallenen Zellen induzierende (cancered-cell-differentiation-inducing)-Wirkung, Oncogen-blockierende Wirkung, carcinostatische Wirkung und andere biologischen Aktivitäten besitzen, und ihre Brauchbarkeit zieht nun öffentliche Aufmerksamkeit auf sich.
Es gibt viele Berichte über die pharmakologischen Wirkungen von Isoflavonverbindungen, insbesondere Isoflavonaglyconen, die Hydrolysate von Isoflavonglycosiden sind.
Beispielsweise wurde Genistein, welches ein Aglycon ist, das gebildet wird, wenn glucosehaltiges Genistin, das entsprechende Glycosid, hydrolysiert wird, als eine Substanz identifiziert, welche der Hemmung von Tyrosinkinase (TK-Inhibitor), fähig ist, wobei Tyrosinkinase für die Einleitung einer Krebsbildung durch ein Onkogen wesentlich ist, und es wurde bestätigt, dass es eine carcinostatische Wirkung besitzt (Akiyama, u.a. Biochemistry, Bd. 59, Nr. 9, S. 1016 (1987)).
Ferner zeigt unter den Isoflavonverbindungen Genistein besonders eine Estrogenwirkung und es wurde bestätigt, dass es eine therapeutische Wirkung für Osteoporose und immunsupressive Wirkung besitzt.
Osteoporose nach der Menopause ist nun ein großes Problem für die Frauen. Die Hauptursache der Osteoporose dieser Art ist die Verringerung der Knochendichte, begleitet von einem übermäßigen Stoffwechselumsatz von Knochen, eingeleitet durch Estrogenarmut.
Jedoch hat die direkte Verarbeichung von Estrogen, das ein typisches Mittel zur Behandlung von Osteoporose ist, die Gefahr von Nebenwirkungen auf Genitalorgane, unter Verursachung von beispielsweise Gebärmutter- oder Brustkrebs. Es ist infolgedessen auch unter dem Gesichtspunkt der Sicherheit von Vorteil, wenn Isoflavonverbindungen wirksam aus essbaren Hülsenfrüchten, insbesondere aus Sojabohnen extrahiert und für die Gesundheit oder prophylaktische Lebensmittel verwendet werden können.
Da Isoflavonverbindungen, wie zuvor erwähnt, pharmakologische Wirkungen besitzen, gibt es nunmehr ein steigendes Bedürfnis für die Zufuhr von Isoflavonverbindungen in der Medizin und in der Nahrungsmittelindustrie. Jedoch liegen Isoflavonverbindungen in natürlichen Substanzen lediglich in geringen Mengen vor; insbesondere sind Isoflavonaglycone in natürlichen Substanzen in extrem geringen Mengen enthalten.
Beispielsweise sind 95% oder mehr Isoflavonverbindungen, die in Sojabohnen, welche zu der Familie Leguminosae gehören, Isoflavonglycoside, und Isoflavonaglycone machen lediglich 5% oder weniger der Isoflavonverbindungen aus. Aus diesem Grund besteht nunmehr ein Bedürfnis für ein einfaches Verfahren zur wirksamen Gewinnung von Isoflavonverbindungen, insbesondere Isoflavonaglyconen, aus Materialien mit einem Gehalt an Isoflavonverbindungen in wirksamen Mengen.
Um dieses Bedürfnis zu befriedigen, wurde beispielsweise von einem Verfahren zur Gewinnung von Isoflavonverbindungen aus Saft von mit Wasserdampf behandelten Sojabohnen unter Verwendung verschiedener synthetischer Absorptionsharze berichtet (Zenzo KITADA, u.a., The Journal of the Japan Society for Food Industry, Bd. 33, Nr. 12, S. 821-825, Dezember 1986).
Dieser Bericht lehrt ein solches Verfahren, bei dem Saft von mit Wasserdampf behandelten Sojabohnen als Ausgangsmaterial in eine Säule eingeführt wird, die mit einem Harz befüllt ist, woran sich die Elution mit einem wasserhaltigen Alkohol anschließt, um die Isoflavonverbindungen zu gewinnen. Jedoch sind die erhaltenen Prozentsätze der Gewinnung von Isoflavonverbindungen außerordentlich gering.
Es ist möglich, Isoflavonverbindungen nach dem in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 126186/1987 beschriebenen Verfahren zur erhalten. Jedoch sind die meisten der nach diesem Verfahren erhältlichen Isoflavonverbindungen Daidzin und Genistin und Isoflavonaglycone, welche erwünschte Isoflavonverbindungen sind, und sie können lediglich in geringen Gewinnungsprozentsätzen erhalten werden.
Ferner gibt es einen Bericht mit dem Titel „Shoyu/miso no seizo-kotei ni okeru Isoflavone oyobi sono haitotai no bunpu jotai kenkyu-ho (oder: Verfahren zur Untersuchung der Verteilung von Isoflavon oder seiner Glycoside beim Verfahren der Herstellung von Sojasoße/Miso) (erster Bericht)", Kiyoshi KIHARA, Shoken, Bd. 16, Nr. 5, S. 190-194, 1990.
Dieser Bericht beschreibt, dass während der Fermentation von Sojabohnen zur Herstellung von Sojasoße oder Miso Isoflavonglycoside unter Bildung von Isoflavonaglyconen völlig hydrolysiert werden. Jedoch lehrt dieser Bericht lediglich ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Analyse von Isoflavonverbindungen, um das Fortschreiten der Hydrolyse von Isoflavonglycosiden zu Isoflavonaglyconen in jeder Stufe der Herstellung von Sojasoße oder dergl. zu zeigen. Dieses Verfahren ist überhaupt nicht für die industrielle Herstellung von Isoflavonaglyconen geeignet.
Die offen gelegte Japanische Patenveröffentlichung Nr. 170756/1993 beschreibt ein Verfahren zum Extrahierung von Isoflavonaglyconen aus Isoflavonverbindungen, die in Sojasoßekuchen oder Sojasoßeöl enthalten sind. Um Isoflavonaglycone in erhöhten Gewinnungsprozentsätzen zu erhalten, wird die in dem zuvor erwähnten Bericht beschriebene Tatsache, dass Isoflavonglycoside unter Bildung von Isoflavonaglyconen im Verlauf der Herstellung von Sojasoße hydrolysiert werden, auf dieses Verfahren angewandt. Jedoch sind die Gewinnungsprozentsätze von Isoflavonaglyconen, welche nach diesem Verfahren erreichbar sind, noch nicht in hohem Maße zufriedenstellend.
Die offen gelegte Japanische Patentveröffentlichung Nr. 258669/1989 offenbart ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Isoflavonaglyconen, bei dem Isoflavonglycoside mit Hilfe von β-Glucosidase, einem der Enzyme hydrolysiert werden, welche Sojabohnen selbst besitzen. In der Praxis sind jedoch die Ausbeuten an nach diesem Verfahren hergestellten Isoflavonaglyconen gering.
Die Beschreibungen der Japanischen Patentanmeldungen Nrn. 32385/1994, Nr. 179111/1995, Nr. 26888/1995, Nr. 88552/1996, Nr. 83036/1997 usw., welche der Anmelder vorliegender Erfindung zuvor beim Japanischen Patentamt einreichte, offenbaren Verfahren zur Herstellung konzentrierter Isoflavonverbindungen mit einem Gehalt an Isoflavonaglyconen in großen Mengen. Bei diesen Verfahren werden Isoflavonglycoside, welche in Hülsenfrüchten in großen Mengen vorliegen, durch Inokulieren von Körnern (Sojabohnen usw.) mit Mikroorganismen wie koji-kin, ein Pilz, der zur Gattung Aspergillus oryzae gehört, hydrolysiert. Diese sind verbesserte oder modifizierte Verfahren, die auf der Grundlage der Tatsache begründet sind, dass Isoflavonaglycone wirksam aus Isoflavonglycosiden erhältlich sind.
Zweifelsohne sind die zuvor genannten Verfahren gemäß dem Stand der Technik verbesserte Verfahren, die zum Abtrennen und Gewinnen von Isoflavonverbindungen, insbesondere Isoflavonaglyconen, als Ausgangsmaterialien brauchbar sind (Verfahren zum Erhöhen des Gehalts von Isoflavonaglyconen, indem man Isoflavonglycoside der Hydrolyse durch verschiedene Mittel unterzieht). Jedoch können, so weit wir wissen, Isoflavonaglycone nicht in genügend hohen Gewinnungsprozentsätzen auch nach diesen herkömmlichen Verfahren erhalten werden.
Bei den meisten der zuvor genannten Verfahren gemäß dem Stand der Technik, insbesondere den Verfahren, welche durch das in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 170756/1993 beschriebene Verfahren wiedergegeben sind, werden Isoflavonverbindungen zuerst mit einem Alkohol extrahiert, gewaschen und sodann der Fettentfernung unterzogen, unter Verwendung eines Kohlenwasserstoffs oder dergl. und Anwendung eines solchen Verfahrens, bei dem Fett zuallererst von einem Ausgangsmaterial vollständig entfernt wird, ein Verfahren, das insoweit überhaupt nicht bekannt war.
Dies muss der Grund sein, warum die Gewinnung von Isoflavonglycosiden, insbesondere Isoflavonaglyconen, die Hydrolysate von Isoflavonglycosiden sind, nicht verbessert wurde.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Wir zollten unsere Aufmerksamkeit einem Verfahren, bei dem Fett zuallererst aus einem Ausgangsmaterial vollständig entfernt, und das entfettete Material in der nächsten Stufe einer Lösungsmittelextraktion zur Herstellung von Isoflavonverbindungen in hohen Gewinnungsprozentsätzen unterzogen werden, und vorliegende Erfindung schließlich erreicht wird. Vorliegende Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung spezieller Isoflavonaglycone in hohen Gewinnungsprozentsätzen. Indem man auch die Anwendung von Isoflavonaglyconen in Lebensmittelprodukten, Arzneimitteln und dergl. in Betracht zieht, werden sichere Lösungsmittel beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet.
ZUSAMMENFASSUNG
Vorliegende Erfindung besteht nämlich in einem Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen, umfassend die Abtrennung von Isoflavonverbindungen vom Ausgangsmaterial mit einem Gehalt an Isoflavonverbindungen und/oder ihren Vorläufern mittels Extraktion, bei dem das Ausgangsmaterial der Fettentfernung unter Verwendung eines nicht-polaren Lösungsmittels vor der Abtrennung der Isoflavonverbindungen mittels Extraktion unterzogen wird.
Typischerweise besteht vorliegende Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen, umfassend die folgenden Stufen (1), (2), (3) und (4):

(1) Entfernung von Fett aus dem Ausgangsmaterial mit einem Gehalt an Isoflavonverbindungen und/oder deren Vorläufer unter Verwendung eines nicht-polaren Lösungsmittels und Trocknen des entfetteten Materials;
(2) Unterziehen des getrockneten, in der Stufe (1) erhaltenen entfetteten Materials der Extraktion mit einem Lösungsmittel und Einengen des Isoflavonverbindungen enthaltenden Extrakts zur Trockne;
(3) Auflösen des Extrakts, das in Stufe (2) zur Trockne eingeengt wurde; in einem Lösungsmittel, Verdünnung dieser Lösung mit Wasser und Abtrennen der unlöslichen ausgefällten Bestandteile von der verdünnten Lösung; und
(4) gegebenenfalls Waschen der in der Stufe (3) erhaltenen unlöslichen Bestandteile sowie deren Trocknung zur Entfernung des Lösungsmittels, wobei Isoflavonverbindungen erhalten werden.

WIRKUNG
Beim Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen gemäß vorliegender Erfindung wird insbesondere beim Verfahren zur Herstellung von Isoflavonaglyconen durch Hydrolyse von Isoflavonglycosiden Fett aus dem Ausgangsmaterial entfernt, bevor Isoflavonverbindungen mittels Extraktion davon abgetrennt werden. Indem man derart vorgeht, ist es möglich, verschiedene Probleme im Stand der Technik erfolgreich zu lösen.
Nunmehr wurde folgendes gefunden: wie im Fall des Verfahrens, bei dem ein Ausgangsmaterial mit einem Gehalt an Isoflavonverbindungen zuerst der Extraktion mit einem Alkohol unterzogen wird (vgl. offen gelegte Japanische Patent veröffentlichung Nr. 170756/1993), wenn ein Isoflavonverbindungen enthaltendes Ausgangsmaterial (wie z. B. Sojasoßenkuchen) direkt einer Extraktion mit einem polaren Lösungsmittel unterzogen wird, werden auch im Ausgangsmaterial enthaltene Lipide extrahiert; deshalb ist es, auch wenn Fett entfernt ist, nach der Extraktion aus dem Extrakt unter Verwendung eines nicht-polaren Lösungsmittels (wie z. B. n-Hexan) nicht leicht, Lipide von den Isoflavonverbindungen abzutrennen, und dies macht die Wiedergewinnungsprozentsätze von Isoflavonverbindungen, insbesondere Isoflavonaglyconen, nicht so hoch.
Die Ursache für dies ist wie folgt: da Isoflavonaglycone weniger polar als Isoflavonglycoside sind, (beispielsweise kann die Veränderung der Polarität bei einer Dünnschichtchromatogramm-Analyse einer Probe von Isoflavonverbindungen, umfassen sowohl Isoflavonglycoside als auch Isoflavonaglycone, gut bestätigt werden, wenn eine Vielzahl von fettlöslichen Komponenten zwischen den Flecken der beiden Komponenten vorliegen), neigen Isoflavonaglycone zum Vermischen mit fettlöslichen Komponenten, was es schwierig macht, Isoflavonaglycone von Lipiden zu trennen.
Demgegenüber zeichnet sich das Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen gemäß vorliegender Erfindung dadurch aus, dass zuerst Fett vom Ausgangsmaterial, wie weiter oben erwähnt, vollständig entfernt wird. Infolgedessen ist das erfindungsgemäße Verfahren fast frei von dem weiter oben beschriebenen Problem und kann zu den erwünschten Substanzen, Isoflavonaglyconen, in hohen Gewinnungsprozentsätzen führen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Vorliegende Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Isoflavonverbindungen, umfassend die Abtrennung von Isoflavonverbindungen aus einem Ausgangsmaterial mit einem Gehalt an Isoflavonverbindungen und/oder deren Vorläufern mittels Extraktion, wobei das Ausgangsmaterial der Entfernung von Fett unter Verwendung eines nicht-polaren Lösungsmittels vor der Abtrennung der Isoflavonverbindungen mittels Extraktion unterzogen wird.
Typischerweise betrifft vorliegende Erfindung ein Verfahren von Isoflavonverbindungen, umfassend folgende Stufen (1), (2), (3) und (4):

(1) Entfernung von Fett aus dem Ausgangsmaterial mit einem Gehalt an Isoflavonverbindungen und/oder deren Vorläufer unter Verwendung eines nicht-polaren Lösungsmittels und Trocknen des entfetteten Materials;
(2) Unterziehen des getrockneten, in der Stufe (1) entfetteten Materials der Extraktion mit einem Lösungsmittel und Einengen des Isoflavonverbindungen enthaltenden Extrakts zur Trockne;
(3) Auflösen des Extrakts, das in der Stufe (2) zur Trockne eingeengt wurde in einem Lösungsmittel, Verdünnen dieser Lösung mit Wasser und Abtrennen der ausgefällten unlöslichen Bestandteile von der verdünnten Lösung; sowie
(4) gegebenenfalls Waschen der in Stufe (3) erhaltenen unlöslichen Bestandteile und Trocknen derselben zur Entfernung des Lösungsmittels, wobei Isoflavonverbindungen erhalten werden.

Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen – Ausgangsmaterial –
Beim Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen gemäß vorliegender Erfindung kann als Ausgangsmaterial mit einem Gehalt an Isoflavonverbindungen und/oder ihren Vorläufern ein beliebiges Material verwendet werden, solange es Isoflavonverbindungen in signifikanten Mengen enthält. Jedoch ist es besser, wenn es beabsichtigt ist, die Isoflavonverbindungen in Lebensmit telprodukten, Arzneimitteln usw. zu verwenden, dass das Ausgangsmaterial natürlichen Ursprungs ist.
Beispiele für Ausgangsmaterialien natürlichen Ursprungs umfassen Pflanzen, die solchen Familien wie Leguminosae, Rosaceae, Iridiaceae, Morus und Amarantus inamoenus, angehören, mit einem Gehalt an Isoflavonverbindungen in wirksamen Mengen; und Hülsenfrüchte wie Sojabohnen, Azukibohnen und andere Körner werden bevorzugt.
Bei vorliegender Erfindung können nicht nur Hülsenfrüchte selbst, sondern auch verarbeitete Hülsenfrüchte (einschließlich z. B. Hülsenfrüchte, welche hydrolysiert wurden) und Primär- oder Sekundärprodukte als Ausgangsmaterial entweder allein oder als Gemisch von zwei oder mehreren Verbindungen benutzt werden, die im Verlauf der Herstellung von Gegenständen gebildet werden.
Unter Hülsenfrüchten werden Sojabohnen bevorzugt. Sojabohnen können ungeachtet ihrer Art verwendet werden. Zusätzlich kann irgendein Material, ausgewählt aus verarbeiteten Sojabohnen und Primär- oder Sekundärprodukten, hergestellt im Verlauf der Herstellung von Nahrungsmitteln oder anderen Gegenständen unter Verwendung von Sojabohnen als Ausgangsmaterialien verwendet werden.
Typische Beispiele für diese Materialien umfassen Sojabohnen (ungeachtet ihrer Art oder Farbe des Kerns), geschälte Sojabohnen, Sojabohnenextrakt, Sojabohnenproteinisolate, entfettete Sojabohnen, Sojabohnenprotein, Sojasoßenöl, Sojasoßenkuchen, tamari (eine Art Sojasoße), miso, mame-miso, natto, fermentierte Sojabohnen, Sojabohnenmehl, Saft von mit Wasserdampf behandelten Sojabohnen und dergl..
Diejenigen Sojabohnen, welche hydrolysiert wurden, um Isoflavonaglycone in signifikanten Mengen zu enthalten, werden besonders bevorzugt, und typischerweise bevorzugt sind Sojasoßenöl, Sojasoßenkuchen, tamari-Kuchen, miso, mame- miso, natto, fermentierte Sojabohnen (einschließlich Sojabohnen, welche mit Mikroorganismen wie koji-kin, ein Pilz, der zur Gattung Aspergillus oryzae gehört, fermentiert wurden) und dergl..
Es wird bevorzugt, das Ausgangsmaterial durch Trocknen vor seiner Verwendung vollständig zu dehydratisieren, so dass es nicht durch die Polarität eines zu verwendenden Lösungsmittels beeinflusst wird.
Die zuvor genannten Ausgangsmaterialien können als Ausgangsmaterial entweder allein oder als ein Gemisch von zwei oder mehreren Verbindungen verwendet werden. Überdies kann das Ausgangsmaterial zur Verwendung bei vorliegender Erfindung in beliebiger Form, beispielsweise fester, pulverförmiger oder zerhackter Form oder aber in Form irgendeiner Kombination dieser Formen vorliegen.
Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen – Fettentfernung –
Zur Entfernung von Fett aus dem Ausgangsmaterial mit einem Gehalt an Isoflavonverbindungen und/oder deren Vorläufer wird ein herkömmliches Verfahren angewandt.
In dem Fall, dass ein Material als Ausgangsmaterial verwendet wird, das aus Sojabohnen (ungeachtet ihrer Art oder Farbe ihres Kerns), verarbeiteten Sojabohnen und Primär- oder Sekundärprodukten ausgewählt wird, die im Verlauf der Herstellung von Nahrungsmitteln oder anderen Gegenständen unter Verwendung von Sojabohnen als Ausgangsmaterialien hergestellt sind, werden typischerweise nachfolgende Verfahren zur Fettentfernung entweder allein oder in Kombination angewandt: ein Pressverfahren unter Benutzung menschlicher, tierischer oder Wasserenergie; ein kontinuierliches Pressverfahren unter Verwendung eines Austreibers (Expellers) usw.; ein Verfahren, bei dem eine Verseifung unter Verwendung von Natriumhydroxid usw. durchgeführt wird; und dergl.. Bei vorliegender Erfindung wird bevorzugt, ein Lösungsmittel-Extraktionsverfahren anzuwenden, welches dieser Tage am häufigsten benutzt wird.
Durch das Lösungsmittel-Extraktionsverfahren ist es möglich, Sojabohnenöl und andere Lipide, welche beim erfindungsgemäßen Verfahren unnötig sind, vollständig zu extrahieren und zu entfernen.
Ein für dieses Lösungsmittel-Extraktionsverfahren verwendetes Lösungsmittel ist ein nicht-polares Lösungsmittel. Es kann ein beliebiges nicht-polares Lösungsmittel verwendet werden, solange es unnötige Sojabohnenöl und andere Lipide, die im Ausgangsmaterial enthalten sind, vollständig extrahieren kann, und solange es eine genügend niedere Polarität besitzt, um die Löslichmachung von Isoflavonaglyconen zu vermeiden.
Typische Beispiele für derartige nicht-polare Lösungsmittel umfassen niedere Kohlenwasserstoffe, Petrolether und andere organische Lösungsmittel, und im Allgemeinen werden eines oder zwei oder mehrere der Lösungsmittel n-Hexan, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff und dergl. verwendet.
Besonders bevorzugt bei vorliegender Erfindung ist n-Hexan. n-Hexan macht die Isoflavonaglycone nicht löslich.
Überdies wurde als Extraktionslösungsmittel in der Nahrungsmittelindustrie dieses benutzt, und es ist infolgedessen in hohem Maße sicher.
Das zuvor beschriebene Verfahren zur Fettentfernung wird mittels einer Extraktion unter Rückfluss bewirkt, um eine erhöhte Effizienz der Fettentfernung zu erreichen. Diese Extraktion unter Rückfluss wird in der Regel bei einer Temperatur in Nachbarschaft des Siedepunkts von n-Hexan (annähernd 69°C), typischerweise während 2-5 Stunden erreicht. Diese Zeitspanne variiert je nach der Menge des verwendeten Ausgangsmaterials.
Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen – Trocknen des entfetteten Materials –
Zum Trocknen des entfetteten Materials, das durch Entfernung von Fett aus dem Ausgangsmaterial erhalten wurde, wird ein herkömmliches Verfahren angewandt.
Bei vorliegender Erfindung kann irgendein Verfahren benutzt werden, solange es das Lösungsmittel auf ein solches Ausmaß entfernen kann, dass das Lösungsmittel die Polarität des in der nächsten Stufe anzuwendenden Lösungsmittels nicht beeinflusst. Typischerweise werden folgende Verfahren entweder allein oder in Kombination angewandt: Trocknen an der Sonne, Trocknen mit (heißer) Luft, Vakuumtrocknen, Durchfluss(through-flow)trocknen, Trocknen im Fließbett, Sprühtrocknen, Gefriertrocknen, Trocknen unter vermindertem Druck, Infrarottrocknen und Trocknen mit Rohfrequenzwellen.
Bei vorliegender Erfindung wird Trocknen an der Luft bevorzugt angewandt. Es ist ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zur Entfernung des Lösungsmittels, das zur Fettentfernung aus dem Ausgangsmaterial verwendet wurde.
Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen – Extraktion von Isoflavonverbindungen –
Zur Extraktion von Isoflavonverbindungen aus dem entfetteten Material, das getrocknet wurde, wird ein herkömmliches Verfahren angewandt, und zu diesem Zweck wird typischerweise eine Lösungsmittelextraktion bei vorliegender Erfindung übernommen.
Die Lösungsmittelextraktion ist ein zur Entfernung unnötiger Komponenten, wie Proteine, Zucker und Fasern geeignetes Verfahren.
Ein polares Lösungsmittel wird für diese Lösungsmittelextraktion typischerweise angewandt, und ein beliebiges polares Lösungsmittel kann verwendet werden, solange es Isoflavonverbindungen, insbesondere Isoflavonaglycone, die im getrockneten, entfetteten Material vorliegen, extrahieren kann.
Typische Beispiele für polare Lösungsmittel, die für die Lösungsmittelextraktion brauchbar sind, umfassen niedere Ester, Wasser, niedere Alkohole, niedere Acetone und niedere Fettsäuren. Im Speziellen können Ethylacetat, Methylacetat, Wasser, Methanol, Ethanol, Aceton, Essigsäure oder dergl. oder deren Gemische bei vorliegender Erfindung benutzt werden. Von diesen wird bei vorliegender Erfindung Ethylacetat besonders bevorzugt.
Ethylacetat ist ein polares Lösungsmittel, das zur Extraktion von Isoflavonaglyconen besonders geeignet ist. Ferner hat es einen niederen Siedepunkt, und es wurde als Extraktionslösungsmittel in der Nahrungsmittelindustrie verwendet, weshalb es in hohem Maße sicher ist.
Die zuvor beschriebene Lösungsmittelextraktion wird in der Regel bei einer Temperatur in Nachbarschaft des Siedepunkts von Ethylacetat (annähernd 77,1°C) typischerweise während 2-5 Stunden durchgeführt. Diese Zeitspanne schwankt je nach der verwendeten Menge des Ausgangsmaterials.
Nach dieser Extraktionsstufe kann gegebenenfalls die zuvor erwähnte Stufe der Fettentfernung bewirkt werden, um Fett weiter zu entfernen.
Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen – Einengen des Extrakts zur Trockne –
Ein herkömmliches Verfahren wird zum Einengen des Extrakts mit einem Gehalt an Isoflavonverbindungen zur Trockne verwendet.
Typische Beispiele für Verfahren zum Einengen umfassen das Einengen unter vermindertem Druck, das Einengen durch Erwärmen, das Durchfluss-Einengen, das Gefriereinengen und Sprüheinengen, diese Verfahren können entweder allein oder in Kombination angewandt werden. Das Einengen unter vermindertem Druck wird bei vorliegender Erfindung bevorzugt.
Dieses Verfahren ist vorteilhaft, indem, da das Einengen unter vermindertem Druck durchgeführt wird, es möglich ist, die Erwärmungstemperatur herabzusetzen und die Konzentrationsrate zu erhöhen.
Es wird bevorzugt, dass das Einengen des Extrakts unter vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer oder dergl. bewirkt wird, um die Effizienz des Einengens unter Berücksichtigung der physikalischen Eigenschaften des Ethylacetats (Siedepunkt: annähernd 77,1°C) zu erhöhen, das in der vorherigen Extraktionsstufe als Lösungsmittel verwendet wurde.
Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen – Auflösen des zur Trockne eingeengten Extrakts und Verdünnen der Lösung mit Wasser.
(1) Auflösen des zur Trockne eingeengten Extrakts
Zum Auflösen des Extrakts, das zur Trockne eingeengt wurde, wird typischerweise ein polares Lösungsmittel verwendet. Es kann ein beliebiges polares Lösungsmittel, darin polare Substanzen, die im zur Trockne eingeengten Extrakt enthalten sind, vollständig auflösen.
Typische Beispiele für polare Lösungsmittel, die für dieses Auflösen brauchbar sind, umfassen niedere Alkohole, Wasser, niedere Acetone, niedere Fettsäuren, niedere Ester und deren Gemische. Spezielle Beispiele für diese polaren Lösungsmittelumfassen Methanol, Ethanol, Wasser, Aceton und Essigsäure.
Bei vorliegender Erfindung werden niedere Alkohole wie Methanol, Ethanol und Propanol bevorzugt, und Ethanol wird besonders bevorzugt.
Ethanol ist ein polares Lösungsmittel, das zum Auflösen von Isoflavonverbindungen geeignet ist. Zusätzlich hat es einen niederen Siedepunkt und ist für eine Verwendung in Nahrungsmittelprodukten sicher genug.
Ein Lösungsmittel mit einer hohen Konzentration wird bevorzugt verwendet, um hierin das zur Trockne eingeengte Extrakt völlig zu lösen. Ein Lösungsmittel mit einer Konzentration von 95% oder mehr, insbesondere 99% oder mehr, wird bevorzugt. Die Verwendung eines polaren Lösungsmittels mit einer außerordentlich hohen Konzentration wird bewirkt, um hierin Isoflavonverbindungen, welche polare Substanzen sind, völlig zu lösen.
(2) Verdünnung der Lösung mit Wasser
Nach dem Lösungen des zur Trockne eingeengten Extrakts im polaren Lösungsmittel wird die erhaltene Lösung mit Wasser verdünnt, um als unlösliche Bestandteile Isoflavonaglycone auszufällen, deren Polarität geringfügig geringer als diejenige von Isoflavonglycosiden ist.
Für dieses Auflösen wird bevorzugt, Wasser in einer solchen Menge hinzuzugeben, dass Verunreinigungen mit einer hohen Polarität entfernt werden können, und dass der Zweck dieser Stufe, d.h., das Abtrennen von Isoflavonverbindungen, indem man diese unlöslich macht, erreicht werden kann.
In dem Fall, wo das polare Lösungsmittel, das in der obigen Stufe (1) zum Auflösen des zur Trockne eingeengten Extrakts ein niederer Alkohol, wie z. B. Ethanol oder Methanol ist. In dem Fall kann der obige Zweck durch Zugabe von Wasser, bis die Konzentration des Alkohols etwa 20% wird, erreicht werden.
Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen – Abtrennung –
Um die unlöslichen Substanzen, die beträchtliche Mengen von Isoflavonverbindungen enthalten, von der zuvor erhaltenen verdünnten Lösung abzutrennen, deren Gehalt an Isoflavonaglyconen hoch ist, wird ein herkömmliches Verfahren angewandt. Bei vorliegender Erfindung wird typischerweise eine Feststoff-Flüssigkeitstrennung angewandt, und für die Feststoff-Flüssigkeitstrennung wird ein herkömmliches Mittel, wie beispielsweise Filtration Zentrifugenabtrennung, Ionenaustausch, Adsorption oder Konzentration angewandt.
Durch Durchführen einer Flüssigkeits-Feststofftrennung ist es möglich, als unlösliche Bestandteile Lipide und andere Substanzen, die eine verhältnismäßig hohe Polarität besitzen, zu entfernen.
Da diese unlöslichen Substanzen auch hauptsächlich Isoflavonglycoside umfassende Isoflavonverbindungen enthalten, ist es möglich, diese der Extraktion zu unterziehen, um Isoflavonglycoside zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen – wahlweises Waschen und Trocknen –
Die zuvor erhaltenen unlöslichen Bestandteile werden gegebenenfalls gewaschen, um unnötige Substanzen zu entfernen.
Die unlöslichen Substanzen werden nach dem gleichen Verfahren getrocknet, wie es im Abschnitt „Verfahren zum Erhalten von Isoflavonverbindungen – Trocknen entfetteten Materials" beschrieben ist, wobei die gewünschten Isoflavonverbindungen schließlich erhalten werden.
BEISPIELE
Unter Bezugnahme auf nachfolgende Beispiele wird vorliegende Erfindung nunmehr spezieller erklärt. Diese Beispiele sind lediglich für ein besseres Verständnis vorliegender Erfindung gegeben, jedoch sind sie nicht beabsichtigt, auf irgendeine Weise den Erfindungsumfang zu begrenzen.
BEISPIEL 1
Gemäß der Beschreibung der zuvor erwähnten Patentanmeldung, eingereicht vom Anmelder vorliegender Erfindung beschriebenen Verfahren wurde durch Inokulieren von Sojabohnen-Hypocotyl mit koji-kin, einem Pilz, der zur Gattung Aspergillus oryzae gehört, fermentiertes Sojabohnen-Hypocotyl hergestellt. Von diesem fermentierten Sojabohnen-Hypocotyl wurden mittels Extraktion auf folgende Weise Isoflavonverbindungen abgetrennt.
Das fermentierte Sojabohnen-Hypocotyl, das Ausgangsmaterial, wurde mit einer Zerkleinerungsvorrichtung (grinding plow) in ein Mehl von annähernd einer Maschenweite von 100 meshes vermahlen.
Zu diesem fermentierten Sojabohnen-Hypocotyl-Mehl wurde in einer Menge des dreifachen der Menge des Mehls n-Hexan zugegeben, und die Extraktion wurde drei Stunden unter Rückfluss durchgeführt. Nach Abschluss der Extraktion wurde die Feststoff-Flüssigkeits-Trennung bewirkt, und das erhaltene entfettete Material wurde getrocknet. Das Gewicht des getrockneten entfetteten Materials war annähernd 89% des Gewichts des Ausgangsmaterials, bevor dieses der Fettentfernung unterzogen wurde. Durch Dünnschichtchromatographie wurde bestätigt, dass das n-Hexan nach seiner Benutzung zur Extraktion keine Isoflavonverbindungen enthielt.
Zu diesem Zeitpunkt wurde gefunden, dass es wirksam war, diese Extraktionsstufe zwei- oder dreimal zur völligen Entfernung von Fett zu wiederholen.
Danach wurde Ethylacetat zum getrockneten, entfetteten fermentierten Sojabohnen-Hypocotyl zugegeben, wobei die Menge des ersteren das dreifache der Menge des letzteren betrug, und die Extraktion wurde unter Rückfluss etwa 3 Stunden durchgeführt. Die Feststoff-Flüssigkeits-Trennung wurde sodann vorgenommen, und die Ethylacetatfraktion wurde in einem Rotationsverdampfer sodann unter vermindertem Druck eingeengt. Der zur Trockne eingeengte Extrakt betrug 2-5% des Gewichts des Ausgangsmaterials.
Zu diesem Zeitpunkt wurde folgendes bestätigt: um einen erhöhten Gewinnungsprozentsatz zu erreichen, wird es bevorzugt, die Extraktion mit Ethylacetat mehrere Male zu wiederholen, und in dem Fall, wo aus dem Ausgangsmaterial Fett nicht völlig entfernt wurde, wird es bevorzugt, unter Verwendung von n-Hexan Fett aus dem zur Trockne eingeengten Extrakt weiter zu entfernen.
Danach wurde der zur Trockne eingeengte Extrakt in einer geringen Menge 99%igen Ethylalkohols gelöst, und diese Lösung wurde mit Wasser verdünnt, bis die Konzentration des Alkohols etwa 20°C wurde, wodurch unlösliche Substanzen ausfallen. Diese Lösung ließ man noch für eine Weile stehen, wonach die unlöslichen Bestandteile mittels einer Feststoff-Flüssigkeits-Trennung (Filtration unter Verwendung von Filterpapier) abgetrennt und unter vermindertem Druck unter Erhalt von Isoflavonverbindungen getrocknet wurden. Der Gewinnungsprozentsatz der Isoflavonverbindungen betrug 40-70%.
Die erhaltenen Isoflavonverbindungen wurden in eine mit einem synthetischen Absorptionskunstharz (wie z. B. „Dia-ion HP-20", hergestellt von Nippon Rensui Company, Japan) gefüllten Säule großer Abmessung eingeführt.
Auf diese Weise wurden die Isoflavonverbindungen weiter in einzelne Isoflavonverbindungen getrennt, und Daidzin, Genistin, Daidzein und Genistein hoher Reinheit wurden in hohen Gewinnungsprozentsätzen getrennt erhalten.
Wenn aus dem Ausgangsmaterial zuvor, wie in dem Verfahren gemäß dem Stand der Technik, nicht vollständig entfernt wurde, ist die Wirksamkeit der Fraktionierung der Isoflavonverbindungen gering, auch wenn das synthetische absorbierende Kunstharz verwendet wird. Deshalb wird es als schwierig erachtet, die Isoflavonverbindungen getrennt zu erhalten.
Der Gehalt der einzelnen Isoflavonverbindungen im fermentierten Sojabohnen-Hypocotyl, dem Ausgangsmaterial, und der Gehalt der einzelnen Isoflavonverbindungen in den gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen eingeengten Isoflavonverbindungen wurden jeweils nach dem Flüssigkeitschromatographieverfahren dem in (J. Agic, Food Chem., Bd. 30, S. 353-355) beschriebenen Verfahren gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle B gezeigt. Tabelle B
Die Daten in Tabelle B zeigen, dass die Inhalte der einzelnen Isoflavonverbindungen in den gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen eingeengten Isoflavonverbindungen unüblicherweise höher als diejenigen der einzelnen Isoflavonverbindungen in dem Ausgangsmaterial fermentiertes Sojabohnen-Hypocotyl sind. Insbesondere sind die Gehalte der Isoflavonglycoside in ersteren so hoch wie etwa das 10- bis 13fache der Gehalte derselben in dem letzteren, und die Gehalte der Isoflavonaglycone in ersteren sind etwa das 57- bis 64fache der Gehalte derselben in dem letzteren. Diese Ergebnisse belegen somit, dass Isoflavonverbindungen einfach und wirksam nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in hohen Gewinnungsprozentsätzen erhalten werden können.
BEISPIEL 2
Sojasoßenkuchen, der bei Herstellung von Sojasoße aus entfetteten Sojabohnen nach einem herkömmlichen Verfahren als Ausgangsmaterial hergestellt worden war, wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Isoflavonverbindungen wurden aus 300 g dieses Ausgangsmaterials mehrere Male mit dem in Übereinstimmung mit dem in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 170756/1993 beschriebenen Verfahren gewonnen.
Es wurde gefunden, dass jedes Mal der Gewinnungsprozentsatz der Isoflavonverbindungen nicht höher als etwa 10% war.
Es wurde versucht, nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 die Gehalte der einzelnen Isoflavonverbindungen im Sojasoßekuchen, dem Ausgangsmaterial, und diejenigen der einzelnen Isoflavonverbindungen in den erhaltenen eingeengten Isoflavonverbindungen zu messen. Es war jedoch unmöglich, die Messung infolge folgender Gründe vorzunehmen: die Gewinnungsprozentsätze der einzelnen Isoflavonverbindungen waren außerordentlich gering, und es war unmöglich, die Reinheit der einzelnen Isoflavonverbindungen zu erhöhen.
Insbesondere wurden überhaupt kein Daidzin und Genistin nachgewiesen.
In dem Fall, wo die Isoflavonverbindungen gemäß dem in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 170756/1993 beschriebenen Verfahren erhalten werden, war der Gewinnungsprozentsatz der Isoflavonverbindungen geringer als derjenige der Isoflavonverbindungen beim Verfahren gemäß vorliegender Erfindung; überdies war es außerordentlich schwierig, die Reinheit jeder Isoflavonverbindung, enthalten in den eingeengten Isoflavonverbindungen, zu erhöhen.
Es wurde gefunden, dass die Ursachen für diese ungünstigen Ergebnisse folgende waren: die Menge des entfetteten Materials, erhalten durch Entfernen von Fett aus dem Ausgangsmaterial unter Verwendung von n-Hexan war 290 g; und der Prozentsatz der im n-Hexan gelösten Lipide war 3% oder höher. Ferner wurde gefunden, dass die Lipide eine außerordentlich hohe Viskosität wie Teer hatten.
Deshalb wird folgender Weg angenommen: wenn der Sojasoßenkuchen direkt der Extraktion mit einem polaren Lösungsmittel (80%igem Ethanol) unterzogen wird, wie in der offen gelegten Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 170756/1993 beschrieben, werden auch die hoch viskosen Lipide extrahiert; der Extrakt wird somit in einen solchen Zustand gebracht, dass Lipide mit hoher Polarität und Lipide mit niederer Polarität fest vermischt sind; deshalb ist es schwierig, den Extrakt in einzelne Komponenten unter Verwendung eines Lösungsmittels zu trennen. Die obige Annahme gründet sich auf folgende Tatsachen: in Sojabohnen sind verschiedene Arten von Lipiden natürlich vorhanden, und die unterscheiden sich in ihrer Polarität; überdies werden während der Herstellung von Sojasoße diese Lipide hydrolysiert, so dass sich eine große Anzahl von Komponenten bilden.
Deshalb zeigt dieses Beispiel, dass, auch wenn Fett von dem Sojasoßenkuchen unter Verwendung von n-Hexan entfernt wird, es schwierig ist, die Isoflavonverbindungen von Lipiden zu trennen.
Demgegenüber ist es gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen möglich, die Abtrennung von Isoflavonverbindungen von Lipiden, wie im Beispiel 1 gezeigt, glatt durchzuführen. Wie aus den vorhergehenden Beispielen verstanden werden kann, wird beim Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen gemäß vorliegender Erfindung Fett erstmals aus einem Ausgangsmaterial mit einem Gehalt an Isoflavonverbindungen und/oder deren Vorläufer in wesentlichen Mengen vollständig entfernt, und das entfettete Material sodann der Abtrennung von Isoflavonverbindungen mittels Extraktion unterzogen, so dass Isoflavonverbindungen, insbesondere Isoflavonaglycone, in höheren Gewinnungsprozentsätzen als diejenigen der Verfahren gemäß dem Stand der Technik, wie zuvor in den Kapiteln ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG, BEISPIELE und dergl. erwähnt, erhalten werden kann.
Somit können unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens hoch konzentrierte Isoflavonverbindungen, insbesondere Isoflavonalgycone, welche hinsichtlich ihrer carcinostatischen Wirkung, therapeutischen Wirkung für Osteoporose, immunosuppressiven Wirkung und anderen medizinischen Wirkungen hervorragend sind, leicht und kostengünstig aus Ausgangsmaterialien mit einem Gehalt an Isoflavonverbindungen und/oder deren Vorläufern in wesentlichen Mengen erhalten werden. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Isoflavonverbindungen können in großen Mengen als Ausgangsmaterialien der Arzneimittel- und Lebensmittelindustrie zugeführt werden, von denen die Lieferung von isoflavonverbindungen nunmehr stark gefragt ist. Ferner können die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Isoflavonverbindungen als Ausgangsmaterialien zur Herstellung von einzelnen Isoflavonaglyconen verwendet werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen, bei dem man Isoflavonverbindungen von einem Startmaterial, das Isoflavonverbindungen und/oder deren Vorprodukte enthält, durch Extraktion abtrennt, wobei das Startmaterial vor dem Abtrennen der Isoflavonverbindungen durch Extraktion der Fettentfernung unter Verwendung eines unpolaren Lösemittels unterworfen wird.
Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen, das die folgenden Schritte (1), (2), (3) und (4) aufweist, bei denen man: (1) Fett aus dem Startmaterial, das Isoflavonverbindungen und/oder deren Vorläufer enthält, unter Verwendung eines unpolaren Lösemittels entfernt und das entfettete Material trocknet, (2) das getrocknete, entfettete Material, das aus Schritt (1) erhalten wurde, der Extraktion mit einem Lösemittel unterwirft, und das Extrakt, das die Isoflavonverbindungen enthält, bis zur trockenen aufkonzentriert, (3) das Extrakt, das in Schritt (2) bis zur Trockene aufkonzentriert wurde, in einem Lösemittel löst, diese Lösung mit Wasser verdünnt und von der verdünnten Lösung die nicht löslichen Bestandteile, die ausgefallen sind, entfernt und (4) gegebenenfalls die nicht löslichen Bestandteile, die in Schritt (3) erhalten wurden, wäscht und diese trocknet, um Lösemittel zu entfernen, wobei Isoflavonverbindungen erhalten werden.
Verfahren zur Herstellung von Isoflavonverbindungen, das die folgenden Schritte (1), (2), (3) und (4) aufweist, bei denen man: (1) Fett aus dem Startmaterial, das Isoflavonverbindungen und/oder deren Vorläufer enthält, unter Verwendung eines unpolaren Lösemittels entfernt und das entfettete Material trocknet, (2) das getrocknete, entfettete Material, das aus Schritt (1) erhalten wurde, der Extraktion mit einem polaren Lösemittel unterwirft; und das Extrakt, das die Isoflavonverbindungen enthält, bis zur trockenen aufkonzentriert, (3) das Extrakt, das in Schritt (2) bis zur Trockene aufkonzentriert wurde, in einem polaren Lösemittel löst, diese Lösung mit Wasser verdünnt und von der verdünnten Lösung die nicht löslichen Bestandteile, die ausgefallen sind, entfernt und (4) gegebenenfalls die nicht löslichen Bestandteile, die in Schritt (3) erhalten wurden, wäscht und diese trocknet, um Lösemittel zu entfernen, wobei Isoflavonverbindungen erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das unpolare Lösemittel zur Verwendung in Schritt (1) ein niederer Kohlenwasserstoff, das polare Lösemittel zur Verwendung in Schritt (2) ein niederer Ester und das polare Lösemittel zur Verwendung in Schritt (3) ein niederer Alkohol ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das unpolare Lösemittel zur Verwendung in Schritt (1) n-Hexan, das polare Lösemittel zur Verwendung in Schritt (2) Ethylacetat und das polare Lösemittel zur Verwendung in Schritt (3) Ethanol ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Startmaterial, das Isoflavonverbindungen und/oder deren Vorläufer enthält, eine Hülsenfrucht und 1 oder eine verarbeitete Hülsenfrucht und/oder ein primäres oder sekundäres Produkt ist, das im Zuge der Herstellung eines Gegenstands unter Verwendung einer Hülsenfrucht als Startmaterial hergestellt wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche l bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Startmaterial, das Isoflavonverbindungen und/oder deren Vorläufer enthält, eine Hülsenfrucht ist, die hydrolysiert wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Isoflavonverbindungen Isoflavonaglycone sind.