DE60034834T2 - Transformierte Brassicapflanze - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Organismus. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine transformierte Pflanze sowie Gewebe oder Zellen davon und transformierte Zellen oder Gewebe.
  • Die Spezies Brassica napus (AACC, 2n=38) ist eine amphidiploide Spezies, die im Altertum aus den diploiden Spezies B. campestris (AA, 2n=20) und B. oleracea (CC, 2n=18) durch interspezifische Hybridisierung hervorging. Alle der natürlich vorkommenden Stämme von B. napus (die auch den Ölsamen tragenden Raps einschließen) sind vom Typ mit schwarzen Samen.
  • In der Species Brassica ist der gelbe Samen dem braunen/schwarzen Samen aufgrund seines höheren Öl- und Proteingehalts, seines geringeren Fasergehalts und seiner ästhetischen Erscheinung in samenhaltigen Nahrungsmitteln überlegen. Zum Beispiel bringt der gelbe oder teilweise gelbe Samen von B. campestris einen um 2-5% höheren Ölgehalt, einen um 1% höheren Proteingehalt und einen um 4-7% geringeren Fasergehalt mit sich (Stringam et al. 1974; Daun und DeClercq 1988, Hu 1988; Simbaya et al. 1995), der gelbe Samen von B. juncea bringt einen 2,8% höheren Ölgehalt, einen 3,5% höheren Proteingehalt und einen 7,3% geringeren Fasergehalt mit sich (Woods 1980; Simbaya et al. 1995), der gelbe Samen von B. carinata bringt einen 3,8% höheren Proteingehalt und einen 5,5% geringeren Fasergehalt mit sich (Simbaya et al. 1995) und die Samen von B. napus mit braunen oder gelb-braunen Samen, die durch Kreuzen entwickelt wurden, enthalten einen 2-4% höheren Öl- und Proteingehalt und einen 3-7% geringeren Fasergehalt (Shirzadegan und Röbbelen 1985; Hu 1988; Simbaya et al. 1995).
  • Da das meiste Samenöl und Protein im Embryo lokalisiert ist, enthält die Samenschale sehr kleine Mengen an Öl und Protein. Darüber hinaus ist der Anteil an Samenschale bezogen auf den Gesamtsamen beim gelben Samen um 15% niedriger als der des Rübenraps mit braunem Samen (B. campestris) (Stringam et al. 1974). Demnach ist der höhere Öl- und Proteingehalt in gelbem Samen vorwiegend eine Folge des größeren Anteils an Embryo im Vergleich zu dem Gesamtsamen. Der niedrigere Fasergehalt in vom gelben oder schwach gefärbten Samen abgeleiteten Nahrungsmitteln ist großteils eine Folge eines geringeren Anteils an Schale, im Vergleich zu dem Gesamtsamen (Stringam et al. 1974; Anjou et al. 1977).
  • Das Pigment der Samenschale von Brassica besteht hauptsächlich aus Polyphenolen, die Polymere von Leucocyanidinen sind (Leung et al. 1979; Hu 1988). Das Polyphenyl wird in den Palisaden- und in den zusammengedrückte Parenchymschichten der Samenschale abgeschieden (Vaugan 1970; Stringam et al. 1974). Die Palisadenschicht ist die hervorstechende Zellschicht der Samenschale, und es wird angenommen, daß sie einen hohen Fasergehalt aufweist und einen niedrigeren Öl- und Proteingehalt. Die Palisadenzellschicht ist in dem gelben Samen von Rübenraps um 1/2 bis 2/3 reduziert (Stringam et al. 1974). Dementsprechend werden von dem gelben Samen niedrigere Anteile an Polyphenol und Lignin erwartet (Anjou et al. 1977; Theander et al. 1977; Slominski et al. 1994). Als ein Ergebnis ist die Verdaulichkeit von der Samenschale oder von Nahrungsmitteln aus gelbem Samen signifikant höher als die von schwarzen Samen (Bell und Shires 1982; Slominski et al. 1994).
  • Angesichts der zuvor genannten Vorteile, die mit gelben Samen einhergehen, wäre es wünschenswert, transformierte Zellen zu erzeugen, die in der Lage sind, Samen mit gelber Farbe und/oder Pflanzen mit gelben Samen zu liefern.
  • Ein transformiertes CC-Genom, welches ein exogenes Gen für eine transparente Samenschale, welches aus einem AA-Genom erhalten wurde, umfaßt, wird hier gelehrt. Das Gen für eine transparente Samenschale liefert einen Samen mit gelber Farbe, da die Schale transparent ist und es dadurch ermöglicht, daß das gelbe Innere des Samens gesehen werden kann. Der sichtbar gelbe Samen wird erzeugt durch eine im wesentlichen transparente Samenschale, welche hierdurch den natürlichen Embryo gegenüber dem bloßen Auge exponiert.
  • Der Begriff "exogenes Gen für eine transparente Samenschale" bedeutet, so wie er hier verwendet wird, ein Gen für eine transparente Samenschale, welches einen unterschiedlichen Ursprung gegenüber den anderen Genen, die auf einem bestimmten Genom zu finden sind, aufweist.
  • Das CC-Genom ist in manchen Brassica zu finden. Demnach ist das CC-Genom aus Brassica erhältlich. Typischerweise wird das CC-Genom Brassica erhalten. Anders ausgedrückt ist das CC-Genom ein Brassica-CC-Genorn.
  • Das AA-Genom ist in manchen Brassica zu finden. Demnach ist das AA-Genom aus Brassica erhältlich. Typischerweise wird das AA-Genom aus Brassica erhalten. Anders ausgedrückt ist das AA-Genom ein Brassica-AA-Genom. Vorzugsweise wird das AA-Genom aus einer beliebigen unter Brassica campestris, Brassica napus und Brassica juncea erhalten.
  • Vorzugsweise wird das AA-Genom aus Brassica campestris erhalten.
  • Anders ausgedrückt wird hierin ein transformiertes Brassica-CC-Genom gelehrt, wobei das transformierte Brassica-CC-Genom ein Gen für eine transparente Samenschale umfaßt, welches aus einem Brassica-AA-Genom erhalten wurde.
  • Vorzugsweise ist das CC-Genom ein transformiertes Brassica-napus-Genom.
  • Der sichtbar gelbe Samen wird erzeugt durch eine im wesentlichen transparente Samenschale, die hierdurch den natürlichen Embryo gegenüber dem bloßen Auge exponiert. Dies steht in unmittelbarem Gegensatz zu den Samen der Brassica-Pflanzen mit schwarzen Samen und denen mit gelb-braunen Samen, die dunklere Farben zeigen in Folge der dunklen Färbung und der dunklen Pigmentierung in der Samenschale.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff "Gen für eine transparente Samenschale" – welcher ausgetauscht werden kann mit dem Begriff "Gen für eine transparente Samenschalenfarbe" oder dem Begriff "Gen für eine gelbe Samenschale" oder dem Begriff "Gen für eine transparente gelbe Samenschale" – eine oder mehrere Nukleotidsequenzen, vorzugsweise jedoch wenigstens zwei Nukleotidsequenzen, die in der Lage sind eine transparente Samenschale zu verleihen. Falls wenigstens zwei Nukleotidsequenzen vorliegen, dann können diese an der selben chromosomalen Stelle oder an verschiedenen chromosomalen Stellen lokalisiert sein.
  • Demnach kann der Begriff "Gen für eine transparente Samenschale" der vorliegenden Erfindung alternativ angegeben werden für ein Gen oder eine Anzahl von Genen, die in der Lage sind, eine Samenschale im wesentlichen transparent zu machen und dadurch die Visualisierung der im wesentlichen natürlich gelben Farbe der inneren Embryokomponente des Samens zu ermöglichen.
  • Eine Samenschale ist im wesentlichen transparent, wenn eine Samenschalenpigmentierung im Vergleich zu der Samenschale des Wildtyps im wesentlichen nicht vorhanden ist.
  • Der Begriff 'Wildtyp" bedeutet, so wie er hier verwendet wird, eine Form eines Genallels, welches als der "Standard" oder als der üblichste in der Natur zu findende Typ erachtet wird.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart eine transformierte Brassica-Pflanze, eine Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe mit einem Brassica-CC-Genom, welches ein exogenes Gen für eine transparente Samenschale, welches aus einem AA-Genom erhalten wurde, umfaßt, wobei die aus dieser transformierten Pflanze, Pflanzenzelle oder dem transformierten Pflanzengewebe erhaltenen Samen eine konsistente und stabile gelbe Farbe aufweisen.
  • Vorzugsweise wird die transformierte Pflanze, Pflanzenzelle oder das transformierte Pflanzengewebe, welche(s) ein exogenes Gen für die transparente Samenschale umfaßt, erhalten aus dem AA-Genom von einer beliebigen unter Brassica campestris, Brassica napus und Brassica juncea.
  • Vorzugsweise wird die transformierte Pflanze, Pflanzenzelle oder das transformierte Pflanzengewebe, welche(s) ein exogenes Gen für die transparente Samenschale umfaßt, aus dem AA-Genom von Brassica campestris erhalten.
  • Vorzugsweise ist die transformierte Pflanze, Pflanzenzelle oder das transformierte Pflanzengewebe ein(e) transformierte(s) Brassica napus-Pflanze, -Pflanzenzelle oder Pflanzengewebe.
  • Bei manchen Ausführungsformen ist die transformierte Brassica-Pflanze vorzugsweise nicht steril (d.h. fertil).
  • Vorzugsweise ist die/das transformierte Brassica-Pflanze, -Pflanzenzelle oder -Pflanzengewebe in der Lage, Samen mit einer transparenten Samenschale zu liefern oder ist in der Lage, Pflanzen, die Samen mit einer transparenten Samenschale aufweisen, zu liefern.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung der Gehalte an Samenöl und Protein und zur Verringerung der Gehalte an Fasern in einem Samen bereit, wobei das Verfahren das Kreuzen einer ersten Brassica-Pflanze, die ein CC-Genom aufweist, welches für ein erstes Gen für eine transparente Samenschale homozygot ist, wobei das erste Gen für eine transparente Samenschale von einem ersten AA-Genom von Brassica campestris abgeleitet ist, durch Anwenden einer Embryo-Rettungstechnik, gefolgt von Kultivierung in vitro, mit einer zweiten Brassica-Pflanze, die ein zweites AA-Genom von Brassica campestris, welches für ein zweites Gen für eine transparente Samenschale homozygot ist, um eine Nachzucht-Brassica-Pflanze zu erzeugen, die für die ersten und zweiten Gene für transparente Samenschalen heterozygot ist, und das mit sich selbst Kreuzen der Nachzucht-Brassica-Pflanze, um die gelbsamige Brassica-Pflanze zu erzeugen, die für die ersten und zweiten Gene für transparente Samenschalen homozygot ist, und wobei die gelbsamige Brassica-Pflanze Samen erzeugt, die eine konsistente und stabile gelbe Farbe aufweisen, umfaßt.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann weiterhin umfassen die Stufen: (i) Auslesen von gelben Samen aus schwarzen Samen oder braunen Samen und/oder (ii) Vergleichen der Gehalte an Erucasäure und an Glucosinolat(en) zwischen den gelben Samen und den schwarzen Samen und den braunen Samen.
  • Eine transformierte Brassica-napus-Pflanze, die in der Lage ist, Samen mit einer transparenten Samenschale zu liefern, wird hier ebenfalls gelehrt.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart ein Samenöl oder ein Samenmehl mit einem Öl- und Proteingehalt von wenigstens etwa 70% der getrockneten Samenmasse und mit einem Fasergehalt von nicht mehr als etwa 8% des ölfreien Mehls.
  • Vorzugsweise umfaßt das Samenöl oder das Samenmehl einen Öl- und Proteingehalt von etwa 70% bis etwa 80% der getrockneten Samenmasse.
  • Vorzugsweise umfaßt das Samenöl oder das Samenmehl einen Fasergehalt von nicht mehr als etwa 6% bis etwa 8% des ölfreien Mehls.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart eine Verwendung eines AA-Genoms als Vektor für die Zuführung von einem oder mehreren interessierenden Genen in ein heterologes Genom.
  • Es wird hier eine transparente Samenschale gelehrt, die von einem Gen für eine transparente Samenschale codiert wird, welches aus NCIMB 40991 und/oder NCIMB 40992 erhältlich ist.
  • Eines oder mehrere unter der transformierten Pflanze, der transformierten Zelle oder dem transformierten Gewebe wird hergestellt durch Anwenden der Embryo-Rettungstechnik.
  • Vorzugsweise wird eines oder mehrere unter der transformierten Pflanze, der transformierten Zelle oder dem transformierten Gewebe nach einem Verfahren hergestellt, welches eine Stufe der Chromosomenverdopplung umfaßt, wobei ein Mittel verwendet wird, welches die Chromosomenverdopplung verursacht, wie z. B. Colchicin.
  • Vorzugsweise wird eines oder mehrere unter der transformierten Pflanze, der transformierten Zelle oder dem transformierten Gewebe nach einem Verfahren hergestellt, welches eine Stufe der Embryo-Rettung umfaßt.
  • Die vorliegende Erfindung ist vorteilhaft, da es nun möglich ist, Brassica-Pflanzen mit gelben Samen zu erzeugen. Die vorliegende Erfindung ist weiterhin vorteilhaft, da es nun möglich ist Brassica-napus-Pflanzen mit gelben Samen zu erzeugen.
  • Demnach waren wir gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage, transformierte Pflanzen mit gelben Samen herzustellen, wie z. B. transformierte Brassica napus mit gelben Samen.
  • In der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Begriff "transformiert" Zellen und Pflanzen, die nicht natürlich vorkommen, sondern die statt dessen durch einen menschlichen Eingriff durch selektive Kreuzung, vorzugsweise ein Verfahren, welches eine biotechnologische Stufe einschließt (wie z. B. die Chromosomenverdopplung und/oder eine Embryo-Rettungstechnik) hergestellt wurden.
  • Die oben genannten Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nun etwas ausführlicher beschrieben.
  • Im Text bedeutet der Begriff "gelbsamig oder mit gelben Samen" einen sichtbaren gelben Embryo, der durch eine im wesentlichen transparente Samenschale hervorgebracht wird.
  • Im Text bedeutet der Begriff "transparent", daß eine Samenschalenpigmentierung im Vergleich zu der Samenschale des Wildtyps im wesentlichen nicht vorhanden ist.
  • Im Text bedeutet der Begriff "stabil" eine gelbe Samenfarbe, die konsistent über nachfolgende Generationen übertragen wird.
  • Vorzugsweise wird die Samenfarbe über wenigstens zwei Generationen konsistent übertragen, vorzugsweise über wenigstens drei Generationen, vorzugsweise über wenigstens vier Generationen, vorzugsweise über wenigstens fünf Generationen, vorzugsweise über wenigstens sechs Generationen, noch bevorzugter über wenigstens sieben Generationen.
  • In dem Text bedeutet der Begriff "konsistent" eine im wesentlichen gleichmäßige Verteilung der gelben Farbe.
  • Der Begriff "niedriger Gehalt" in Bezug auf die Fettsäure Erucasäure bedeutet einen Gehalt von weniger als 2% Erucasäure.
  • Der Begriff "mittlerer Gehalt" in Bezug auf die Fettsäure Erucasäure bedeutet einen Gehalt von mehr als 2% Erucasäure und weniger als 40% Erucasäure.
  • Der Begriff "hoher Gehalt" in Bezug auf die Fettsäure Erucasäure bedeutet einen Gehalt von mehr als 40% Erucasäure.
  • Der Begriff "niedriger Gehalt" in Bezug auf Glucosinolat(e) bedeutet einen Gehalt von Gesamt-Glucosinolat(en) von weniger als 25μmol/g Samen.
  • Der Begriff "mittlerer Gehalt" in Bezug auf Glucosinolat(e) bedeutet einen Gehalt von Gesamt-Glucosinolat(en) von mehr als 25μmol und weniger als 40μmol pro g Samen.
  • Der Begriff "hoher Gehalt" in Bezug auf Glucosinolat(e) bedeutet einen Gehalt von Gesamt-Glucosinolat(en) von größer als 40μmol/g Samen.
  • Beim Erreichen der vorliegenden Erfindung wurde erkannt, daß das größte Hemmnis des Versuchs der Züchtung von B. napus-Pflanzen mit gelben Samen, die gelbe Samen erzeugen könnten, der Mangel an einem Gen für eine transparente Samenschale war. Etwas genauer wurde erkannt, daß ein Gen für eine transparente Samenschale in dem CC-Genom von B. napus nicht vorlag. Bei einem Teil der Analyse der vorliegenden Erfindung, welcher durch 1 dargestellt ist, wurde erkannt, daß unter den diploiden Brassica-Spezies Formen mit gelben Samen nur in der Spezies B. campestris (AA, 2n=20) zu finden sind, wohingegen unter den amphidiploiden Spezies Varianten mit gelben Samen unter B. carinata (BBCC, 2n=34) und B. juncea (AABB, 2n=36) gefunden werden können. Der gelbe Samen in diesen Spezies ist eine Folge einer transparenten Samenschale.
  • Allerdings wurde in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung überraschenderweise gefunden, daß es möglich war, ein Gen für eine transparente Samenschale in eine Pflanze, wie z. B. in deren Genom, zu transferieren, welche ein solches Gen nicht aufwies.
  • Der Transfer kann über selektive Kreuzungsverfahren erfolgen, die bestimmte wesentliche oder bevorzugte technische Merkmale aufweisen. Die Details dieser Techniken und Verfahren werden später vorgestellt.
  • Bis zu der vorliegenden Erfindung wurden interspezifische Kreuzungen bei Brassica in verschiedene Richtungen durchgeführt, um die natürlichen Varianten von B. campestris, B. juncea und B. carinata im Hinblick auf die Züchtung von B. napus mit gelben Samen zu entdecken. Bisher wurden lediglich begrenzte Erfolge erreicht. Beispielsweise versuchten Barcikowska et al. (1987) und Zaman (1988) eine Spezies mit CC-Genom und mit gelben Samen zu entwickeln, indem sie die interspezifische Kreuzung von {gelbsamige B. carinata x schwarzsamige B. alboglabra/B. oleracea} als eine Zwischenstufe bei der Züchtung von gelbsamiger B. napus verwendeten, bei diesen Versuchen wurden jedoch lediglich teilweise gelbe Samen erhalten.
  • Liu (Liu 1983; Liu und Gao 1987) berichteten von einem Versuch zur Züchtung einer gelbsamigen B. napus, welche entwickelt wurde aus der Kreuzung {B. napus x B. campestris (B. chinensis)}. Allerdings deutete das häufige Vorkommen von schwarzen Samen und/oder schwarzen Flecken auf der Schale sowie die Veränderung der Samenschalenfarbe in Folge von Umweltfaktoren darauf hin, daß deren gelbsamige Stämme nicht über Generationen stabil waren.
  • Zaman (1988) isolierte einen braunsamigen Stamm aus einer interspezifischen Kreuzung von {( B. carinata x B. campestris) x B. napus}. Chen (Chen et al. 1988; Chen und Heneen 1992) erreichten gelbe Samen in einer F2-Population, die abgeleitet wurde von einer Kreuzung zwischen einer resynthetisierten B. napus (resynthetisiert aus B. campestris und einer teilweise gelbsamigen B. alboglabra) und einer B. napus-Züchtungslinie mit gelb-braunen Samen. Allerdings war das Merkmal der gelben Samen nicht reinrassig, wie z. B. bis zur F4-Generation. Chefs teilweise gelbsamige B. albogabra wurde entwickelt aus einer interspezifischen Kreuzung zwischen gelbsamiger B. carinata und schwarzsamiger B. albogabra.
  • Rashid et al. (1994) berichteten von ihrem Versuch der Entwicklung von gelbsamigen Pflanzen aus einer etwas komplexeren interspezifischen Kreuzung von {[(B. napus x B. juncea) x B. napus] x [(B. napus x B. carinata) x B. napus]}. Allerdings wurde über die Stabilität der Samenschalenfarbe in den hieraus hervorgehenden Hybriden nicht berichtet.
  • Van Deynze (Van Deynze et al. 1993; Van Deynze und Pauls 1994) berichteten über eine teilweise gelbsamige B.-napus-Pflanze, die an der Universität von Manitoba/Guelph entwickelt wurde. Allerdings wurde eine instabile gelbe Samenfarbe und eine signifikant hohe Samenschalenpigmentierung (schwarz/dunkelbrauner Samen) beobachtet, wenn die gelbsamigen Stämme bei einer niedrigeren Temperatur von 16°C/12°C (Tag/Nacht) gezogen wurden. Diese Instabilität der gelben Samenfarbe läßt solche Varietäten für bestimmte größere B.-napus-Anbaugebiete, wie z. B. Nordeuropa und Nordamerika, ungeeignet erscheinen.
  • Tang et al. (1997) entwickelten gelbsamige B. napus-Linien aus verschiedenen Zuchtansätzen, wie z. B. aus inter-spezifischen Kreuzungen von {(B. campestris x B. oleracea) x B. napus }; {B. napus x B. juncea}; {B. napus x B. campestris} aus bestrahlten Nachkommenschaften von B. napus und aus Nachkommenschaften von zwischensortlichen Kreuzungen von B. napus. Allerdings wurde über die Stabilität der gelben Samenfarbe nicht berichtet.
  • Es ist offensichtlich, daß das Gen für eine transparente Samenschale von B. campestris, B. juncea und B. carinata im Stand der Technik auf verschiedene Weisen im Hinblick auf die Züchtung von gelbsamigen B. napus-Pflanzen verwendet wurde.
  • Im Gegensatz hierzu betrifft unsere Erfindung unter anderem die Übertragung des Gens für die transparente Samenschale über das AA-Genom von Yellow Sarson (B. campestris) in das CC-Genom von B. napus. Es wird ein indirekter Nachweis dafür erbracht, daß die Übertragung des Gens für die transparente Samenschale erreicht wird über Allosyndese zwischen den A- und den C-Genomchromosomen. Der resultierende B. napus-Stamm, der das Gen für die transparente Samenschale von Yellow Sarson (B. campestris) in dessen CC-Genom trägt, wurde verwendet für die Züchtung von gelbsamigen Ölsamenraps.
  • Zum Zwecke der weiteren Hintergrundsinformation untersuchte Attia (Attia und Röbbelen 1986; Attia et al. 1987) die meiotische Konfiguration von Chromosomen in: (i) amphihaploiden AC, AB und BC, die erzeugt wurden aus Kreuzungen zwischen drei einfachen diploiden Spezies und (ii) in digenomischen Triploiden AAC, ACC, BBC und BCC, die erzeugt wurden aus Kreuzungen zwischen den amphidiploiden und den diploiden Spezies. In den Amphihaploiden wurden 12,3 Chiasmen (7.3 II) gefunden. Bei AB wurden 5.8 Chiasmen (4.36 II) gefunden und in BC wurden 2,0 Chiasmen (1.9 II) gefunden. In den digenomischen Triploiden BBC und BCC, gab es eine Dominanz von bevorzugter Paarung zwischen den zwei homologen Genomen, während das dritte einzelne Genom ungepaart verblieb. Auf der anderen Seite wurde in den AAC- und den ACC-Triploiden eine hohe Häufigkeit von allosyndetischer Paarung zwischen dem A- und dem C-Genom ausgedrückt durch die Bildung von einem oder mehreren trivalenten in über 50% der Pollenmutterzellen. Nach Busso et al. (1987), wurde die homologe Paarung zwischen den A- und den C-Genomchromosomen in dem trigenomischen Haploid (ABC) durch die Gegenwart der B-Genomchromosomen nicht gestört.
  • Diese zytologischen Beobachtungen suggerieren eindeutig, daß die A- und die C-Genomchromosomen von Brassica näher miteinander verwandt sind, während die B-Genomchromosomen von den A- und den C-Genomchromosomen phylogenetisch entfernt sind. Demnach stellte man bei der amphihaploiden Genomkonstitution fest, daß die Genübertragung vom A- zum C-Genom oder anders herum relativ leicht erfolgen konnte.
  • Ein Verfahren zur Herstellung der transformierten Pflanzen, nämlich durch Verwendung des AA-Genoms als Vektor für das Gen für die transparente Samenschale, wird in den folgenden Beispielen vorgestellt.
  • Bei einer hochbevorzugten Ausführungsform basiert die vorliegende Erfindung auf unserer Erkenntnis, daß es möglich ist, das Gen für die transparente Samenschale gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden, um transformierte Zellen herzustellen.
  • Zusätzlich offenbart die vorliegende Erfindung auch transformierte Pflanzen, die das Gen für die transparente Samenschale gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen.
  • Die folgenden Beispiele wurden in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag bei der anerkannten Hinterlegungsstelle The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, United Kingdom, AB24 3RY am 7. Dezember 1998 hinterlegt.
  • Brassica napus 13-217 – Hinterlegungsnummer NCIMB 40991
  • Brassica napus 13-219 – Hinterlegungsnummer NCIMB 40992
  • Die vorliegende Erfindung wird nun beispielhaft beschrieben werden, wobei Bezug genommen wird auf die folgenden Figuren:
  • 1, die ein schematisches Diagramm darstellt,
  • 2, die ein schematisches Diagramm darstellt,
  • 3, die ein schematisches Diagramm darstellt,
  • 4A, die ein schematisches Diagramm darstellt,
  • 4B, die ein schematisches Diagramm darstellt,
  • 5A, die ein schematisches Diagramm darstellt,
  • 5B, die ein schematisches Diagramm darstellt,
  • 6A, die eine fotografische Darstellung darstellt,
  • 6B, die eine fotografische Darstellung darstellt,
  • 7, die ein schematisches Diagramm darstellt, und
  • 8, die eine fotografische Darstellung darstellt.
  • Etwas genauer ist 1 ein schematisches Diagramm, daß das Vorkommen von gelben Samen in der Brassica-Spezies angibt.
  • 2 ist ein schematisches Diagramm, das den Ansatz zeigt, der verfolgt wurde, um das Gen für eine transparente Samenschale von dem A- zu dem C-Genom zu transferieren. Die normalen großen Buchstaben A, B und C zeigen die drei Brassica-Genome an. Der hochgestellte Buchstabe y zeigt das Gen für eine transparente Samenschale von Yellow Sarson (B. campestris) an. Der hochgestellte Buchstabe z zeigt das Gen für die transparente Samenschale aus B. carinata an, welche bezogen auf das Gen für die transparente Samenschale von Yellow Sarson (B. campestris) aus unterschiedlichen Genomen stammen. Der hochgestellte Buchstabe B zeigt das Gen für die schwarze Samenschale der natürlichen B. napus an. Das Symbol * zeigt die Übertragung über Allosyndese der Gene für die transparente Samenschale aus den A- zu den C-Genom an.
  • 3 ist ein schematisches Diagramm, welches das Verfahren der Entwicklung der gelbsamigen B. napus aus den interspezifischen Kreuzungen darstellt. Die Genom- und die Samenschalengenbezeichnungen sind wie für 2 beschrieben.
  • 4A ist ein HPLC-Chromatogramm eines alkalischen Hydrolysats von transparenten Samenschalen (11A5156.082-K1217) von Brassica napus, gemessen bei 280nm.
  • 4B ist ein HPLC-Chromatogramm eines alkalischen Hydrolysats von transparenten Samenschalen (11A5156.082-K1217) von Brassica napus, gemessen bei 360nm.
  • 5A ist ein HPLC-Chromatogramm eines alkalischen Hydrolysats von schwarzer Samenschale (Miro) von Brassica napus, gemessen bei 280nm.
  • 5B ist ein HPLC-Chromatogramm eines alkalischen Hydrolysats von schwarzer Samenschale (Miro) von Brassica napus, gemessen bei 360nm.
  • 6A ist eine fotografische Darstellung von Samenschalen von schwarzen Samen von B. napus.
  • 6B ist eine fotografische Darstellung von Samenschalen von gelben Samen von B. napus. Die gelben Samen haben eine transparente Samenschale.
  • 7 ist eine grafische Darstellung einer Hauptkomponentenanalyse (PCA) von Agrovision-Farbdaten von sechs Samenproben (dunkle und gelbe Samen) von Brassica napus.
  • 8 demonstriert den Farbunterschied zwischen gelben Samen (von der vorliegenden Erfindung) und schwarzen Samen (herkömmlicher Typ) von Brassica napus.
  • VERFAHREN UND VORGEHENSWEISEN
  • Die vollständige Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung ist stufenweise in den Stufen I-VI angegeben.
  • Die Stufen I-II (die in 2 zusammengefaßt sind) umfassen die Erzeugung von B. napus-Pflanzen mit gelblich-braunen Samen, die die Gene für die transparente Samenschale von Yellow Sarson (B. campestris) in deren CC-Genom tragen.
  • Die Stufe III (die in 3 zusammengefaßt ist) umfaßt die Resynthese von der B. napus-Linie, die die Gene für die transparente Samenschale von Yellow Sarson (B. campestris) in deren AA-Genom trägt.
  • Die Stufe IV (die auch in 3 zusammengefaßt ist) umfaßt die Entwicklung der gelbsamigen B. napus unter Verwendung der Materialien, die in den Stufen I-II und in der Stufe III entwickelt wurden.
  • Die Stufe V umfaßt die Entwicklung von gelbsamiger B. napus von doppelt geringer Qualität durch Kreuzung von gelbsamigen Linien mit herkömmlichen Varietäten von B. napus mit doppelt geringer Qualität.
  • Die Stufe VI umfaßt die Erzeugung von Hexaploiden, was den Anspruch der vorliegenden Erfindung unterstützt.
  • Stufe I: Interspezifische Kreuzung
  • Gelbsamige B. carinata x gelbsamige Yellow Sarson (B. campestris)
  • Eine interspezifische Kreuzung zwischen der gelbsamigen B. carinata (BBCC)-Linie (Zugangsnummer 381078) und der gelbsamigen Yellow Sarson (B. campestris)-(AA)-Linie mit Ursprung in Bangladesh (Zugangsnummer 3-0166.001) wurde durchgeführt und trigenomische haploide Pflanzen (ABC) wurden erzeugt (2).
  • Stufe II: Interspezifische Kreuzung
  • Trigenomisches F1-Hybrid (ABC) x schwarzsamige B. napus (AACC)
  • Die trigenomischen Haploiden (ABC) von Stufe I wurden gekreuzt mit schwarzssamiger natürlicher B. napus (Zugangsnummer 1-9007) und die resultierenden Drei-Wege- interspezifischen-Hybride wurden über eine Reihe von Generationen vermehrt (2). Diese interspezifischen Kreuzungen wurden entwickelt, um die Allosyndese zwischen den A- und den C-Genomchromosomen in den trigenomischen Haploiden (ABC) sicherzustellen und sicherzustellen, daß die nachfolgenden vermehrten Generationen das Gen für die transparente Samenschale von dem A- zu dem C-Genom übertragen würden.
  • Die Stufen I-II resultierten in der B. napus-Linie Nr. 06 mit gelblich-braunen Samen.
  • Stufe III: Interspezifische Kreuzung zur Resynthese von B. napus
  • Schwarzsamige B. alboglabra x gelbsamige Yellow Sarson (B. campestris)
  • Es wurde eine interspezifische Kreuzung zwischen der schwarzsamigen B. alboglabra (CC) (Zugangsnummer 381053) und der gelbsamigen Yellow Sarson (B. campestris) (AA) (Zugangsnummer 381049) durchgeführt, um B. napus (AACC) zu resynthetisieren (3). Da die reziproke Kreuzung nicht dazu in der Lage war, irgendwelche lebensfähigen Hybridsamen in vitro zu erzeugen, wurde die Anwendung einer Embryo-Rettungstechnik (wird unten beschrieben), gefolgt von einer in-vitro-Kultur, verwendet, um Hybridpflanzen zu erhalten.
  • Die Stufe III resultierte in der schwarzsamigen B.-napus-Linie Nr. 1.
  • Stufe IV: Erzeugung von gelbsamiger B. napus
  • (B. napus mit gelblich-braunen Samen (Nr. 06) x schwarzsamige resynthetisierte B. napus (Nr. 01))
  • Es wurde eine konventionelle Kreuzung durchgeführt zwischen den Linien Nr. 06 und Nr. 01 (3) und es wurde eine Pedigree-Züchtung angeschlossen. In der F6-Generation wurden vollständig gelbsamige Linien erreicht.
  • Die Stufe IV resultierte in den gelbsamigen B.-napus-Linien 13-217 und 13-219.
  • Stufe V: Entwicklung von gelbsamiger B. napus von doppelt niedriger Qualität
  • (null Erucasäure im Samenöl und wenig Glucosinolat(e) im Samenmehl)
  • Um eine gelbsamige B. napus-Linie mit doppelt niedriger Qualität (null Erucasäure und wenig Glucosinolat(e)) zu entwickeln, wurden gelbsamige B. napus-Linien (13-217 und 13-219) mit konventionellen B. napus-Varietäten von doppelt geringer Qualität, wie z. B. Polo und Dakini gekreuzt. Ein Mikrosporenkulturverfahren (Lichter 1989) wurde angewendet auf alle resultierenden F1-Pflanzen, um doppelt haploide (DH)-Linien zu erzeugen. Eine gelbsamige DH- Linie mit null Erucasäure wurde gekreuzt mit zwei (Polo und Dakini) konventionellen B.-napus-Varietäten von doppelt geringer Qualität, um gelbsamige B. napus von doppelt geringer Qualität zu erzeugen. Für diese Zwecke wurde anschließend eine Pedigree-Züchtung durchgeführt.
  • Stufe VI: Erzeugung von trigenomischen Hexaploiden
  • (gelbsamige B. carinata x gelbsamige Yellow Sarson (B. campestris))
  • Um die Verbundwirkung der Gene für die transparente Samenschale von B. carinata (BBCC) und Yellow Sarson B. campestris (AA) auf die Samenschalenpigmentierung zu bestimmen, wurden fertile trigenomische Hexaploide (AABBCC) durch Chromosomenverdopplung von trigenomischen Haploiden (ABC) aus {gelbsamige B. carinata x gelbsamige Yellow Sarson (B. campestris)}-Pflanzen aus Stufe I erzeugt.
  • Embryo-Rettungstechnik
  • Die Stufen für die Embryo-Rettungstechnik waren wie folgt:
    • (i) die Schoten wurden zum richtigen Zeitpunkt der Entwicklung geerntet,
    • (ii) die grünen Embryos (überlebende Embryos) wurden gerettet und wurden in vitro kultiviert, und
    • (iii) die überlebenden Embryos wurden für die Sproßregeneration subkultiviert.
  • Bei einer ganz bestimmten Ausführungsform wurden B. alboglabra-Pflanzen kreuzbestäubt mit Pollen von Yellow Sarson (B. campestris) und 24 bis 28 Tage nach der Bestäubung wurden die unreifen Schoten geerntet, aufgeschnitten und die Hybridembryos wurden gerettet unter Anwendung der folgenden sterilen und Zellkultur-Verfahren. Die ausgeschnittenen Schoten wurden oberflächensterilisiert mit 70%-igem Ethanol über 3 Minuten gefolgt von der Behandlung mit einer 5%-igen Calciumhypochloridlösung über 20 Minuten. Die Schoten wurden dreimal mit sterilem Wasser gewaschen und der Länge nach unter einem Stereomikroskop aufgeschnitten. Die entwickelten (befruchteten) Samenanlagen wurden herausgeschnitten und die erreichbaren Embryonen wurden gerettet. Diese geretteten Embryonen wurden bei 24°C in Murashige-Skoog-Medium (1962), ergänzt mit 0,1mg NAA und 0,1mg Kinetin pro Liter Medium und unter einer kontinuierlichen Beleuchtung von 800 Lux kultiviert. Nach 20 bis 30 Tagen der Kultur wurden die überlebenden Embryos in dem gleichen Medium für die Sproßinduktion subkultiviert.
  • Chromosomenverdopplung
  • (a) Chromosomenverdopplung von in in vitro -Kultur regenerierten Sprossen
  • Die wesentlichen Stufen für die Chromosomenverdopplungstechnik waren die folgenden:
    • (i) Die Sprosse wurden herausgeschnitten und wurden in einer wäßrigen Lösung von Colchicin untergetaucht,
    • (ii) nach der Behandlung mit Colchicin wurden die Sprosse mit sterilem Wasser gewaschen und der untere Abschnitt des Stammes wurde durch Schneiden entfernt, und
    • (iii) die Sprosse wurden in Wurzelmedium überführt.
  • Bei einer ganz bestimmten Ausführungsform wurden Pflanzen mit verdoppelten Chromosomen erhalten durch die Behandlung von regenerierten Sprossen im Blattstadium 2-4 (unaufgefaltetes Blatt) mit einer wäßrigen Lösung von 0,5% Colchicin plus 2,5% DMSO (modifizierte Version nach Gland (1981)). Die Sprosse wurden in dieser Lösung untergetaucht bis zu dem Niveau des Meristems/Sproßscheitels. Nach 16 bis 20 Stunden wurden die Sprosse herausgenommen, mit sterilem Wasser dreimal gewaschen und 3-5mm des unteren Teils des Sproß wurden abgeschnitten. Die Sprosse wurden dann in Murashige-Skoog-Medium (1962), ergänzt mit 3mg IBA pro Liter Medium für die Wurzelinduktion überführt und unter einer Beleuchtungsbedingung von 800 Lux gestellt.
  • (b) Chromosomenverdopplung von Pflanzenzweigen in vivo
  • Die wesentlichen Stufen für die Chromosomenverdopplungstechnik waren die folgenden:
    • (i) in die Blattachseln wurde eine wäßrige Lösung von Colchicin injiziert,
    • (ii) an der selben Stelle wurde in Abständen wiederholt eine Injektion verabreicht.
  • Bei einer ganz bestimmten Ausführungsform wurden trigenomische hexaploide Zweige/Sprosse mit verdoppelten Chromosomen erhalten, indem trigenomische Haploide (ABC) eine wäßrige Lösung von 0,5% Colchicin plus 2,5% DMSO (modifizierte Version nach Gland (1981)) injiziert bekamen. Etwas genauer injizierte man in 38 Blattachseln von 19 Pflanzen dreimal die Colchicin-/DMSO-Lösung in Abständen von 24 Stunden. Die hexaploide Natur der Zweige wurde bestätigt durch optische Beobachtung sowie durch Analyse per Durchflusszytometrie der Kern-DNA. Diese Zweige produzierten fruchtbare Blüten, d.h. sie wiesen viable Pollen auf und erzeugten bei der Vermehrung lebensfähige Samen im Gegensatz zu den Blüten von anderen Zweigen (trigenomisch haploid), die steril waren.
  • Analyse durch Durchflusszytometrie
  • Die Analyse durch Durchflusszytometrie wurde durchgeführt, indem die Verfahren befolgt wurden, die beschrieben sind durch Galbraith et al. (1983) und Sabharwal und Dolezel (1993). Für diese Zwecke wurde Kern-DNA aus Samen, die aus vermehrten Samen gezogen worden waren, verwendet.
  • Isozym Elektrophorese
  • Blätter (ungefähr 3cm groß) von drei Wochen alten Pflanzen wurden in 0,1M Tris-HCl-Puffer (pH 7,2), enthaltend 0,5% DDT (1-4-Dithio-DL-Threitol), homogenisiert und bei 20 000 UpM über 1,5 Minuten zentrifugiert, wonach der Überstand der Proben auf einem Filterpapier mit 9mm × 3mm (Whatman Nr. 1) absorbiert wurde. Ein horizontales Stärkegel (13% hydrolysierte Stärke, Sigma S-4501) wurde erstellt und die Proben wurden so aufgebracht, daß sie ungefähr 1/3 der Gelbreite des Kathodenendes des Gels abdeckten. Das Gel und die Puffersysteme in der Schale waren jeweils 5mM L-Histidinmonohydrochlorid (eingestellt mit NaOH auf pH 7,0) und 0,4 M Tri-Natriumcitratdihydrat, 0,1M Zitronensäure, (pH 7,0). Die Elektrophorese wurde durchgeführt für 3,5 Stunden bei 200 V, 150 mA bei 0°C, um eine geeignete Trennung der Enzyme sicherzustellen. Alle nachfolgenden Färbeverfahren wurden gemäß Murphy et al. (1990) durchgeführt.
  • Messung der Erucasäure
  • Der Gehalt an Erucasäure im Samenöl wurde gemessen durch gaschromatografische Analyse, wobei dem Verfahren gefolgt wurde, daß von der Association of Official Analytical Chemists (1990) beschrieben wurde. Typischerweise wurde Samenöl (Triglyzeride der Fettsäuren) aus zermahlenen Samen extrahiert und durch Zugabe von Methanol methyliert. Die Methylester der Fettsäuren wurden durch Gaschromatographie unter Verwendung eines Geräts vom Typ HP 5890 Reihe II analysiert, unterstützt von einem FID-Detektor und einem mit einer ChemStation HP3365 gekoppelten Autosampler. Die Säule war 50m lang und 0,32mm weit und es handelte sich um WCOT Quarzgut (Chrompack) mit einer stationären Phase von CP-sil-58CB. Helium wurde als Trägergas eingesetzt mit einer Flußrate von 276ml/min. Es wurden eine Ofentemperatur von 205°C, eine Injektionstemperatur von 250°C und eine Detektionstemperatur von 270°C angewendet.
  • Messen von Samenglucosinolat(en) (GLS)
  • Es wurde eine quantitative Messung von Glucosinolat(en) (GLS) im Gesamtsamen durchgeführt, indem das Verfahren angewendet wurde, welches von Smith et al. (1985) beschrieben wurde. Eine qualitative Messung der GLS-Gehalte im Samen unter Verwendung des Glucose-Testverfahrens wurde wie folgt durchgeführt: Zweihundert Mikroliter destilliertes Wasser wurden zu fünf zerdrückten Samen zugegeben und bei Raumtemperatur über 10 Minuten inkubiert. Ein Medi-Test-Glucosestreifen (hergestellt von Macherey-Nagel) wurde in die Lösung eingeführt und die Farbveränderung, die nach 30 bis 60 Sekunden auftrat, wurde auf einer Skala von 1 bis 5 bewertet.
  • Feststellung des chemischen Fingerabdrucks von transparenten Samenschalen im Vergleich zu schwarzen Samenschalen von B. napus
  • Die Samenschalen wurden im wesentlichen in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Andreasen et al. 1998 (Journal of the Science of Food and Agriculture, im Druck) zum Zwecke der Extraktion von löslichen und unlöslichen estergebundenen Phenolsäuren analysiert. Die Samenschale der Linie 11A5156.082-K1217 (transparente Samenschale) (6B) und die Varietät Miro (schwarze Samenschale) (6A) wurde per Hand prepariert und weiter aufgereinigt durch ein gravimetrisches Verfahren unter Anwendung eines vertikalen Luftstroms.
  • Die Samenschalen (100mg) wurden homogenisiert unter Verwendung eines Mörsers, es wurden 100ml 1,0 M NaOH zugegeben und es wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden unter N2 im Dunkeln inkubiert. Dann wurde der pH-Wert der Hydrolisate mit 1,0 M HCl auf unter 2 eingestellt, es wurde dreimal mit 40ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatfraktionen wurden unter Vakuum bei Raumtemperatur verdampft und der getrocknete Rückstand wurde in 3,0ml 50% Acetonitril und 2,0% Trifluoressigsäure gelöst und durch einen Nylonfilter mit 0,45μm filtriert.
  • Die Extrakte wurden durch HPLC (Hitachi, Merck) analysiert, welche ausgestattet waren mit einer analytischen RP-18-Säule vom Typ LiChroCART250-4 (5μm), bei 35°C unter Anwendung eines Lösungsmittelgradientensystems bestehend aus Lösungsmittel A (50% Acetonitril und 0,5% Trifluoressigsäure) und Lösungsmittel B (8% Acetonitril und 0,5% Trifluoressigsäure) mit dem folgenden Elutionsprofil: 0-10 min: 100% B, 11-20 min: 90% B, 21-30 min: 85% B, 31-45 min: 80%, 46-50 min: 75% B, 51-65 min: 100% A und 66-80 min: 100% B. Flußrate: 1 ml/min. Injektionsvolumen: 50μl. Detektion mit einem Fotodiodenarraydetektor bei 280nm und 360nm.
  • Bildanalyse
  • Sechs verschiedene Samenproben wurden für diese Zwecke verwendet:
    Probennummer Samenfarbe
    1 Schwarz
    2 Gelb
    3 Gelb
    4 Schwarz
    5 Gelb
    6 Dunkelbraun
  • Die Bildanalyse wurde durchgeführt mit Agrovision Grain Check, wobei die Reflektion von rotem, grünem und blauem Licht gemessen wurde sowie die Gesamtlichtreflektion. Die Daten wurden analysiert unter Anwendung eines multivarianten Analysensystems, wobei lediglich die Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchgeführt wurde.
  • ERGEBNISSE
  • Stufe I
  • Interspezifische Kreuzung (B. carinata x Yellow Sarson (B. campestris)}
  • Wenn die B. carinata-Linie bei der interspezifischen Kreuzung als die weibliche Pflanze verwendet wurde, wurden 3,28 Hybridsamen pro Bestäubung erhalten. Die reziproke Kreuzung ergab 5,15 Samen pro Bestäubung. Obwohl der Grad der interspezifischen Kreuzbarkeit zwischen diesen beiden Spezies angemessen war, wurde eine größere Anzahl an Hybriden (ungefähr 66%) erreicht durch die Anwendung des Embryo-Rettungsverfahrens. Daher ist das Embryo-Rettungsverfahren für diese Zwecke ein hochbevorzugtes Merkmal der vorliegenden Erfindung.
  • Morphologie der trigenomischen (ABC) F1-Hybridpflanzen
  • Die trigenomischen F1-Hybride wurden leicht von deren Elternlinien unterschieden anhand von deren morphologischen Merkmalen. Zum Beispiel waren die Blattbehaarung, das Umfassen des Stengels durch die Blattbasis und die gelbe Farbe der Petalen der F1-Hybride vergleichbar zu der B. carinata-Linie, wohingegen die Blattrandzähnung vergleichbar zu der von Yellow Sarson (B. campestris) war. Die Bestätigung dieser interspezifischen Hybride wurde durchgeführt unter Verwendung des Isozym-Elektrophoreseverfahrens, wie es bereits beschrieben wurde.
  • Stufe II
  • Kreuzbarkeit der trigenomischen F1-Hybride (ABC) mit B. napus (AACC)
  • Die haploide Genomzusammensetzung der trigenomischen Hybride verlieh eine sehr geringe Fertilität. Beim Kreuzen mit konventioneller B. napus erzeugten die Hybridpflanzen ungefähr 0,025 Hybridsamen pro Bestäubung. Ungefähr die gleiche Anzahl an befruchteten Samenanlagen wurden abgestoßen, bevor sie die volle Reife erreicht hatten.
  • Fertilität der von der interspezifischen Kreuzung ABC x AACC abgeleiteten Hybride
  • Die Pollenfertiliät der Hybride, die aus der Kreuzung der trigenomischen Haploide (ABC) mit natürlicher B. napus (AACC) erzeugt wurden, betrug lediglich 16,6%. Als ein Ergebnis war die manuelle Vermehrung der individuellen Pflanzen, wobei Pollen von vollentwickelten Blüten auf die Narbe aufgebracht wurde, erforderlich, um eine ausreichende Anzahl von F2-Samen zu ernten. Alle geernteten Samen wiesen eine schwarze Samenschale auf.
  • Auswahl der Samenschalenfarbe aus ABC x AACC (F2- bis F7-Generationen)
  • 272 F2-Pflanzen wurden angezogen (Tabelle 1). Die Pollenfertilität bei diesen Pflanzen variierte von 0% bis 79%. Um jegliche Kreuzbestäubung zu vermeiden, wurde die Blütentraube von allen F2-Pflanzen individuell mit Pergamentpapierbeuteln isoliert. 106 (39%) der F2-Pflanzen produzierten Samen, wenn dieses Beutelisolierverfahren angewendet wurde. Von diesen samentragenden F2-Pflanzen wiesen 97 eine schwarze Samenschale auf, während 9 eine braune Samenschale aufwiesen. 116 F3-Pflanzen wurden von den 9 F2-Familien mit braunen Samen angezogen, wovon 99 Pflanzen viable Samen unter Beutelisolierung produzierten. Eine einzige F3-Familie (Nr. 0026.002) spaltete sich auf zwischen schwarzen, braunen und leicht braunen Samen, während die anderen acht Familien lediglich schwarz/braun-farbene Samen produzierten. Die leicht braungefärbten F4-Samen, die auf zwei F3-Pflanzen produziert wurden, wurden für die weitere Selektion verwendet, eine Verbesserung der Samenschalenfarbe im Hinblick auf das Erhalten eines gelblich braunen Samens wurde lediglich für die Nachkommenschaft von 1 (Nr. 0026.092) der 2 F3-Pflanzen erreicht. Die Nachkommenschaft der gelblich braungefärbten Samen konnte in den folgenden F5- und F6-Generationen nicht vollständig stabilisiert werden. Allerdings wurde die F7-Linie (Nr. 06) mit gelblich-braungefärbten Samen mit resynthetisierter B. napus-Linie (Nr. 01) (resynthetisiert aus B. alboglabra x Yellow Sarson (B. campestris)) gekreuzt im Hinblick auf die Entwicklung einer reinrassigen gelbsamigen B. napus-Pflanze.
  • Stufe III: Interspezifische Kreuzung zum Resynthetisieren von B. napus
  • (schwarzsamige B. alboglabra x gelbsamige Yellow Sarson (B. campestris))
  • Eine interspezifische Kreuzung zwischen schwarzsamiger B. alboglabra (CC) und gelbsamiger Yellow Sarson (B. campestris) (AA) wurde durchgeführt, um B. napus (AACC) zu resynthetisieren (3). Da die reziproken Kreuzungen nicht dazu in der Lage waren, irgendwelche viablen Hybridsamen in vivo zu erzeugen, wurde eine Embryo-Rettungstechnik (oben beschrieben) angewendet, gefolgt von einer in-vitro-Kultur. Demnach wird die Anwendung des Embryo-Rettungsverfahrens für die Resynthese von B. napus als ein wesentliches technisches Merkmal der vorliegenden Erfindung betrachtet. Für diese Zwecke wurde B. alboglabra mit Yellow Sarson (B. campestris) kreuzbestäubt, und es wurden ungefähr 0,45 Embryos pro kreuzbestäubte Schote gerettet, wovon 40% unter den Bedingungen der in-vitro-Kultur überlebten und zu amphihaploiden (AC) Pflänzchen führten. Die Jungpflanzen wurden mit einer wäßrigen Lösung, enthaltend 0,2% Colchicin plus 2,5% DMSO, zum Zwecke der Verdopplung der Chromosomen behandelt. Die resynthetisierte B. napus mit verdoppelten Chromosomen war in der Natur selbst kompatibel und wies das Merkmal "weiße Petale" der B. alboglabra-Linie auf und erzeugte bei der Vermehrung schwarzschalige Samen.
  • Stufe IV: Erzeugung von vollständig gelbsamiger B. napus
  • (gelblich-braun-samige B. napus (Nr. 06) x schwarzsamige resynthetisierte B. napus (Nr. 01))
  • Es wurde eine konventionelle Kreuzung zwischen den Linien Nr. 06 und Nr. 01 durchgeführt. Der niedrige Gehalt an Samen (ungefähr 10 Samen) pro Bestäubung (Tabelle 2) war erwartet, da beide Elternlinien über die bereits beschriebenen interspezifischen Kreuzungen entwickelt worden waren.
  • Von den vermehrten Samen von 259 F2-Pflanzen, die optisch auf ihre Farbe untersucht wurden (Tabelle 3), produzierten 199 (76,8%) schwarz/braun-gefärbte Samenschalen, 51 (19,7%) produzierten teilweise gelbgefärbte Samen und 9 (3,5%) produzierten gelb/braun-gefärbte Samen. Von den vermehrten Samen von allen 9 gelb-braun-samigen F2-Pflanzen wurden F3-Familien erzeugt. Von den 9 F3-Familien wurden 4 Familien aufgetrennt im Hinblick auf schwarze/braune Samen und teilweise gelbe Samen in einem Verhältnis von 19:41, 4 Familien trennten sich auf auf schwarze/braune, teilweise gelbe und gelb-braune Samen in einem Verhältnis von 19:48:62 und 1 F3-Familie trennte sich auf in teilweise gelbe, gelb-braune und nahezu gelbe Samen in einem Verhältnis von 9:18:1. Demnach wurde 1 nahezu gelbsamige F3-Pflanze aus insgesamt 217 F3-Pflanzen aus 9 Familien erhalten. Die vermehrten Samen der einzelnen nahezu gelbsamigen und der ausgewählten 8 gelb-braun-samigen F3-Pflanzen wurden verwendet, um F4-Familien zu züchten. In den F4-Familien, die aus dem gelb-braun-samigen F3-Pflanzen erzeugt worden waren, wurden keine gelbsamigen Pflanzen gefunden. Auf der anderen Seite trennte sich die F4-Familie, die aus der nahezu gelbsamigen F3-Pflanze erzeugt worden war, erneut auf auf teilweise gelbe, gelb-braune und gelbe Samen. Der Anteil der gelbsamigen Pflanzen (40,9%) in dieser Generation war signifikant höher als der, der in der F3-Generation erhalten worden war. Die F5- und F5-Generationsfamilien wurden nur aus den ausgewählten gelbsamigen Pflanzen angezogen. Die Auftrennung in gelb-braun und gelb-farbige Samen setzte sich mit Dominanz der gelbsamigen Pflanzen in jeder nachfolgenden Generation fort. All die Samen, die in der F7-Generation erhalten worden waren, wiesen eine konsistente uns stabile gelbe Farbe auf.
  • Weil die gelbsamigen Linien, die auf diese Weise entwickelt worden waren, aus einer Reihe von interspezifischen Kreuzungen abgeleitet wurden, konnte bei diesen Pflanzen eine geringe Fertilität erwartet werden. Es wurde, wie im Folgenden dargestellt, eine Selektion im Hinblick auf verbesserte Fertilität durchgeführt gemeinsam mit der Selektion auf eine konsistente und stabile gelbe Samenfarbe: die gelbsamigen Pflanzen der F4- bis F9- Generation wurden mit natürlicher B. napus gekreuzt, indem die gelbsamigen Pflanzen als die weiblichen Pflanzen verwendet wurden. Der Umfang der Kreuzbarkeit wurde in jeder nachfolgenden Generation von 3 Samen pro Bestäubung in der F4-Generation auf nahezu 7 Samen pro Bestäubung in der F9-Generation erhöht (Tabelle 4).
  • Das Samenöl und das Samenmehl der gelbsamigen B. napus, die im vorliegenden Fall erhalten wurden, enthielten jeweils einen mittleren Gehalt an der Fettsäure Erucasäure (26-28%) und einen hohen Gehalt an Glucosinolat(en) (>40μmol/g Samen). Solche zwei Linien (13-217 und 13-219) wurden mit konventionellem Ölsamenraps B. napus von doppelt geringer Qualität gekreuzt, um einen gelbsamigen Ölsamenraps B. napus von doppelt geringer Qualität zu entwickeln. Die oben genannten zwei gelbsamigen B. napus-Linien wiesen weiße Petale auf, offenbar abgeleitet aus dem C-Genom von B. alboglabra.
  • Stufe V: Entwicklung eines gelbsamigen Ölsamenraps B. napus von doppelt geringer Qualität (null Erucasäure im Öl und wenig Glucosinolat(e) im Samenmehl)
  • Es wurden F1-Hybride von Kreuzungen zwischen gelbsamigen Linien (13-217 und 13-219) und konventionelle B. napus von doppelt niedriger Qualität, wie z. B. die Sorten Polo und Dakini verwendet, um doppelt haploide (DH) Pflanzen/Linien zu erzeugen. 287 DH-Pflanzen/Linien wurden aus vier Kreuzungen erzeugt (Tabelle 5).
  • Vererbung der Samenschalenfarbe in der doppelt haploiden (DH) Population
  • Das folgende Aufspaltungsmuster für die Samenfarbe wurde in 287 DH-Linien gefunden (Tabelle 5): 195 DH-Linien wiesen eine schwarzdunkel-braune Samenfarbe auf, 34 waren rötlich-braun, 27 waren teilweise gelb, 14 waren gelb-braun und 17 waren gelbsamig. Als die Daten von den DH-Linien mit schwarzen/dunkelbraunen, rötlich-braunen, teilweise gelben und gelb-braunen Samen in Klassen zusammengefaßt wurden, wurde ein Verteilungsmuster von 270:17 erhalten, welches gut in das Aufspaltungsmuster von 15:1 für vier Genloci paßte. Im Gegensatz hierzu wurde, wenn die Daten von den DH-Linien mit den schwarz/dunkelbraun, rötlich-braun und teilweise gelb gefärbten Samen in eine Klasse zusammengefaßt wurden, und die Daten von den DH-Linien mit den gelb-braun und gelbgefärbten Samen in eine zweite Klasse zusammengefaßt wurden, ein Aufspaltungsmuster von 256:31 erhalten, welches zu einem Aufspaltungmuster von 7:1 für 3 Genpaare paßte. Es wäre nur logisch, die Daten von den letzteren beiden Klassen (gelbe und gelb-braune Klassen) zusammenzufassen, wenn die elterlichen gelbsamigen Linien, die bei den Kreuzungen verwendet werden, unter jedem Umstand gelb-braune Samen erzeugen würden. Die Vermehrung von 30 Pflanzen dieser zwei elterlichen gelbsamig gefärbten Linien, die auf dem Feld angezogen wurden, wiesen auf eine Instabilität der Samenschalenfarbe bei 30% der untersuchten Pflanzen hin. Allerdings wurde eine solche Instabiliät nicht gefunden, wenn die Pflanzen in einem Glashaus angebaut wurden. Obwohl die Chi-Square-Werte, die erhalten wurden, weder für das vier- noch für das drei-Genloci-Modell signifikant waren, war eine bessere Übereinstimmung mit dem Aufspaltungsverhältnis (im Hinblick auf die Chi-Square- und p-Werte) für das vier-Genloci-Modell feststellbar, was darauf hinwies, daß die transparente Samenschalenfarbe für gelbe Samen die Folge einer homozygoten rezessiven Bedingung in allen vier Loci ist. Da die Samenschalenfarbe in B. campestris von zwei Loci bestimmt wird und die transparente Samenschalenfarbe (gelbe Samen) eine Folge der homozygoten rezessiven Bedingung in beiden Loci ist (Stringham 1980, Schwetka 1982), legen die Ergebnisse nahe, daß es am angemessensten ist, ein vier-Gen-Modell für die transparente Samenschalenfarbe B. napus in Betracht zu ziehen
  • Vererbung der Farbe der Petalen und des Erucasäuregehalts in doppelt haploiden (DH) Linien
  • Es wurden insgesamt 61 doppelt haploide Linien aus vier Kreuzungen auf die Petalfarbe und den Erucasäuregehalt untersucht (Tabelle 6). Sechsundzwanzig (26) Linien wiesen eine gelbe Petalfarbe auf und Fünfunddreißig (35) Linien wiesen eine weiße Petalfarbe auf. Dieses Verteilungsverhältnis von 26:35 stimmt überein mit einem Mendelschen Aufspaltungsmuster von 1:1 (X2 = 1,05, p = 0,5-0,3). Die Samen von 27 DH-Linien waren nahezu frei von Erucasäure (Bereich von 0,04-3,1%, mittel 0,4%), während 34 Linien einen Erucasäuregehalt im Bereich von 15,8-33,4% (mittel von 22,7%) aufwiesen. Dieses Verteilungsverhältnis von 27:34 stimmt überein mit einer Mendelschen Aufspaltung von 1:1 (X2 = 0,59, p = 0,5-0,3), was darauf hindeutet, daß ein einzelnes Paar von funktionellen Allelen für den Erucasäuregehalt in den zwei gelbsamigen Linien vorlag. Alle der Linien mit weißblutigen Petalen gingen einher mit der Gegenwart von Erucasäure, außer zwei Linien (0,5 und 3,1% Erucasäure), die nahezu frei von Erucasäure waren. Gleichsam waren alle gelbblutigen Linien assoziiert mit dem Fehlen von Erucasäure, außer einer Linie, die 25,3% Erucasäure enthielt. Diese Ergebnisse suggerieren, daß in dem C-Genom der Genlocus, der die Petalfarbe kontrolliert, und der Locus, der den Erucasäuregehalt kontrolliert, auf demselben Chromosom angeordnet sind, daß jedoch die Rekombination zwischen diesen beiden Loci manchmal auftreten kann, was im vorliegenden Fall bei 4,9% der DH-Linien auftrat.
  • Vererbung des Gesamt-Glucosinolat-(GLS)-Gehalts in doppelt haploiden (DH) Linien
  • Unter Anwendung des Verfahrens von Smith et al. (1985), wurden Samen von insgesamt 202 DH-Linien aus den vier Kreuzungen auf deren GLS-Gehalt untersucht (Tabelle 7). Die Samen von 7 Linien wiesen weniger als 20μmol GLS pro g Samen auf, während die Samen von den verbleibenden 195 Linien mehr als 20μmol GLS pro g Samen aufwiesen. Diese Verteilung von 7:195 stimmt eindeutig überein mit dem Aufspaltungsmuster 1:15 für vier Genloci. Das Aufspaltungsmuster in jeder individuellen Kreuzung wich nicht signifikant von dem Gesamtmuster ab.
  • Aus dem oben genannten doppelt haploiden Zuchtprogramm war es möglich, eine B. napus-Linie mit gelb gefärbten Samen (154.004) zu erhalten, deren Samen frei von Erucasäure sind und deren Samenmehl einen hohen Gehalt an GLS enthielt. Um den GLS-Gehalt der Samen ab der gelbsamigen B. napus abzusenken, wurde die DH-Linie (154.044) mit konventionellem Ölsamenraps von doppelt niedriger Qualität, wie z. B. Polo und Dakini, gekreuzt. Die F2-Populationen wurden in Feldparzellen angezogen. Die Samen von insgesamt 144 914 offen bestäubten F2-Pflanzen wurden auf deren Samenschalenfarbe untersucht, wobei von den offen bestäubten Samen 640 Pflanzen geerntet wurden, da sie gelbsamig oder nahezu gelbsamig waren.
  • Zur qualitativen Messung des GLS-Gehalts in den Samen dieser 640 gelbsamigen Pflanzen wurde das Glucosetestverfahren angewendet. Unter Anwendung der Glucosetestergebnisse wurden die Samen von 507 Pflanzen, die einen sehr hohen Testwert (3-5) zeigten, so bewertet, daß sie einen hohen GLS-Gehalt aufweisen, und wurden verworfen. Es wurde eine quantitative GLS-Messung durchgeführt mit den Samen der verbleibenden 133 Pflanzen, die einen Testwert von 2 aufwiesen. Die Samen von 12 Pflanzen, die einen relativ niedrigen GLS-Gehalt (25-40μmol/g Samen) aufwiesen, wurden verwendet, um Pflanzen der F3-Generation zu erzeugen. Es wurden insgesamt 600 F3-Pflanzen gezogen, vermehrt und auf ihre Samenfarbe untersucht. 287 Pflanzen produzierten gelb oder gelb-braun oder teilweise gelb gefärbte Samen, während die verbleibenden 313 Pflanzen braun oder schwarzgefärbte Samen produzierten. Mit den Samen von den oben genannten 287 Pflanzen wurden Glucosetests durchgeführt, von denen 87 gelb- 24 gelb-braun- und 23 teilweise-gelbsamige Familien für die Entwicklung von Pflanzen der F4-Generation ausgewählt wurden. Von den 87 F4-Familien die von den gelbsamigen F3-Pflanzen abstammten, waren 40 Familien stabil im Hinblick auf die gelbe Samenfarbe, während 47 F4-Familien sich wiederum aufspalteten bezüglich gelber und gelb-brauner Samenfarbe. Wie erwartet war die Aufspaltung der Samenfarbe auch in den Nachkommenschaften von 24 gelb-braun- und 23 teilweise-gelbsamigen F3-Pflanzen zu beobachten. Die vermehrten Samen von insgesamt 402 F4-Pflanzen wurden auf die Samenfarben untersucht und 114 wurden verworfen aufgrund ihrer braunen Samen. Bei den vermehrten Samen der verbleibenden 288 F4-Pflanzen (gelbe und gelb-braune und teilweise gelbe Samen) wurden quantitative Messungen der GLS durchgeführt. Für Samen von 5 Pflanzen konnte gezeigt werden, daß sie einen GLS-Gehalt von weniger als 20μmol/g Samen aufweisen und daß sie von gelber Farbe waren.
  • Diese Ergebnisse zeigen an, daß gelbsamige B. napus für die Kommerzialisierung entwickelt werden kann, wobei diese unterschiedliche Niveaus der Samenöl- und Samenmehlqualität aufweisen kann, wie z. B.: (i) null Erucasäure und wenig Glucosinolat(e), (ii) null Erucasäure und viel Glucosinolat(e), (iii) viel Erucasäure und wenig Glucosinolat(e), (iv) viel Erucasäure und viel Glucosinolat(e).
  • Stufe VI: Synthese der trigenomischen Hexaploiden (AABBCC) aus der interspezifischen Kreuzung von B. carinata x Yellow Sarson (B. campestris) und deren Samenschalenfarbe
  • Trigenomische Hexaploide wurden erhalten durch die Injektion von trigenomischen Haploiden (ABC) mit einer wäßrigen Lösung von 2,5% DMSO plus 0,2% Colchicin, was die Chromosomenverdopplung induziert (2). Die 38 Blattachsen von 19 Pflanzen, in die die Lösung von Colchicin/DMSO injiziert worden war, ergaben 18% fertile, trigenomische hexaploide Sprosse (Zweige), die 5,4 bis 35% viable Pollen produzierten und die selbstkompatibel waren. Durch manuelle Vermehrung wurde ein Satz von ungefähr 93% Schoten erhalten und die Anzahl der viablen Samen die pro Vermehrung geerntet wurden, betrug 3,27. Alle vermehrten Samen waren einheitlich braun in ihrer Farbe. Die nächste Generation von Pflanzen wurde angezogen aus vermehrten Samen und die hexaploide Natur dieser Pflanzen wurde bestätigt durch die durchflusszytometrische Analyse der Kern-DNA. Die vermehrten Samen, die von diesen Pflanzen produziert wurden, waren ebenfalls braun.
  • Feststellung des chemischen Fingerabdrucks von transparenten Samenschalen im Vergleich zu schwarzen Samenschalen von B. napus
  • Um festzustellen, ob die transparente Erscheinung der Samenschalen im Vergleich zu schwarzen Samenschalen die Folge einer Verringerung der Konzentration an chromogenen Substanzen ist, wurde ein chemischer Fingerabdruck genommen durch eine HPLC eines basischen Hydrolysats der Samenschale (4-5).
  • Die Chromatogramme zeigten, daß manche lichtabsorbierenden Substanzen in sehr viel geringerer Menge in den transparenten Samenschalen vorlagen im Vergleich zu den schwarzen Samenschalen. Zum Beispiel lag eine Substanz, die bei 280nm gemessen wurde und die mit einer Retentionszeit von 7,50-7,53 Min. eluierte in einer 35-fach geringeren Konzentration in den transparenten Samenschalen vor, als in den schwarzen Samenschalen, (4A-5A). Im Durchschnitt enthielten die transparenten Samenschalen 4,6-fach geringere Konzentrationen an Substanzen, die bei 280nm absorbieren.
  • Vergleichbare Daten wurden erhalten durch Messung der Absorption bei 360nm, welche gleichzeitig durchgeführt wurde (4B-5B). Zum Beispiel wurden zwei Verbindungen, die bei 17,04-17,11 und bei 26,78-26,82 Min. eluierten in etwa 8-fach geringerer Konzentration in den transparenten Samenschalen im Vergleich zu den schwarzen Samenschalen gefunden. Da diese zwei Verbindungen sowohl bei 280nm als auch bei 360nm signifikante Absorption zeigten, ist es möglich, daß sie Flavonoide sind, da diese Substanzgruppe mit dieser charakteristischen Absorption häufig verbunden ist mit der Färbung von Pflanzengeweben, und sie werden vorzugsweise extrahiert durch das angewandte analytische Verfahren (Norbaek et al. 1998, Phytochemistry, im Druck).
  • Bildanalyse
  • In 7 ist ein PCA-Plot der Agrovision-Farbdaten der 6 Samenproben dargestellt, wobei die erste Hauptkomponente (x-Achse) für die Farbintensität steht, was 91% der festgestellten Gesamtvariation unter den 6 Samenproben erklärt. Die vorliegenden Daten grenzen die gelbsamigen Proben (Nr. 2, 3 und 5) von den verbleibenden schwarzen (Nr. 1 und 4) und braunen (Nr. 6) Samenproben ab. Innerhalb der dunklen Samenproben waren leichte Variationen zu finden, während zwischen den drei gelbsamigen Proben keine Variation besteht.
  • Öl-, Protein- und Fasergehalt in der gelbsamigen B. napus
  • Materialien und Methoden
  • Zwei gelbsamige F7-Linien, 13-217 und 13-219, wurden mit zwei schwarzsamigen Frühlingssorten B. napus cvs. "Polo" und "Dakini" gekreuzt. Es wurde die Mikrosporenkulturtechnik (Lichter 1989) für die Erzeugung von DH-Linien aus F1-Pflanzen angewandt. Es wurden Massensamenproben von schwarz-, braun- und gelbfarbigen Samen hergestellt unter Verwendung einer kleinen Menge von Samen von diesen drei DH-Linien vom bestimmten Samenfarbentyp, und wurden verwendet für die Messung des Öl-, Protein- und Fasergehalts. Der Öl- und Proteingehalt wurde durch die Reflexion im nahen Infrarotbereich gemessen, wobei ein geeignet kalibrierter InfraAlyzer2000 (Bran + Luebbe) verwendet wurde, und der Fasergehalt wurde gemessen nach dem Verfahren, daß von Stringam et al. (1974) beschrieben wurde.
  • Ergebnisse
  • Die Öl-, Protein- und Faserdaten aus Massensamenproben von schwarz-, braun- und gelbsamigen DH-Linien sind in Tabelle 8 dargestellt. Die gelbsamige Probe wies höhere Öl- und Proteingehalte auf als deren schwarzsamiges Gegenstück. Tabelle 8: Öl-, Protein- und Fasergehalt (in Klammern, relative Werte) von verschiedenfarbigen Massensamenproben von doppelt haploiden Linien der Kreuzung gelbsamige x schwarzsamige B. napus.
    Samenfarbe Öl + Protein % Samen Trockenmasse Faser % Samen Faser % Öl-freies Mehl
    Schwarze Samen 68,2 (100) 8,6 (100) 13,6 (100)
    Braune Samen 69,8 (102) 5,9 (69) 9,6 (71)
    Gelbe Samen 70,4 (103) 3,9 (45) 6,1 (45)
  • Der Öl- und Proteingehalt korrelieren miteinander negativ (Grami et al. 1977, Bengtsson 1985).
  • Dies deutet darauf hin, daß der Öl- oder Protein- oder sowohl der Öl- als auch der Proteingehalt in gelbsamiger B. napus auf ein Niveau angehoben werden kann, das höher ist als bei schwarzsamigen Sorten, indem weiter gezüchtet wird. Der Fasergehalt im gelben Samen sowie in dem ölfreien Mehl von gelben Samen wurde um etwa 55% im Vergleich zu schwarzen Samen oder zum ölfreien Mehl von schwarzen Samen reduziert.
  • DISKUSSION
  • Herkunft des Gens für die transparente Samenschale in dem CC-Genom von gelbsamiger B. napus, die aus der Kreuzung Nr. 06 x Nr. 01 abgeleitet wurde
  • Die Samenschalenfarbe der elterlichen B. napus-Linie Nr. 01 (AACC), die aus der Kreuzung schwarzsamige B. alboglabra (CC) x Yellow Sarson (B. campestris) (AA) resynthetisiert wurde, ist vollständig schwarz. Diese Linie trägt das Gen für die transparente Samenschale in deren AA-Genom und ihr fehlt das Gen für die transparente Samenschale in deren CC-Genom. Daher ist die Erzeugung einer vollständig gelbsamigen B. napus aus einer Kreuzung von Nr. 06 x Nr. 01 nicht möglich ohne ein Gen für die transparente Samenschale in dem CC-Genom der Linie Nr. 06.
  • Das Gen für die transparente Samenschale in dem CC-Genom der B. napus-Linie Nr. 06 ist das Gen für die transparente Samenschale von Yellow Sarson (B. campestris), welches durch Allosyndese zwischen den Chromosomen des A- und des C-Genom während der Entwicklung der Linie Nr. 06 durch die interspezifische Kreuzung übertragen wurde.
  • Die Möglichkeit daß das Gen für die transparente Samenschale in dem CC-Genom der Nr. 06 unmittelbar von der B. carinata (BBCC)-Linie abgeleitet wurde, wurde dadurch ausgeschlossen, daß gezeigt wurde, daß die Synthese der trigenomischen Hexaploiden (AABBCC) aus den Kreuzungen gelbsamige B. carinata x Yellow Sarson (B. campestris) nicht in der Lage war, eine transparente Samenschalenfarbe, d.h. gelbe Samen, zu erzeugen.
  • Darüber hinaus wurde bei einer separaten Untersuchung die CC-genomisch gelbsamige Spezies B. alboglabra resynthetisiert aus der Kreuzung {(gelbsamige B. carinata x schwarzsamige B. alboglabra) x schwarzsamige B. alboglabra). Unter Verwendung dieser teilweise gelbsamigen B. alboglabra (CC) und der gelbsamigen B. campestris Yellow Sarson (AA) wurde B. napus (AACC) resynthetisiert. Die resynthetisierte B. napus war vollständig schwarzsamig. Ein ähnlicher Ansatz von Chen (Chen et al. 1988, Chen und Heneen 1992) schlug fehl, jegliche gelbsamige B. napus zu erzeugen.
  • Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß: (i) die Eltern, die F7-Generation, der gelblich-braunsamigen B. napus-Linie (Nr. 06), die aus der Kreuzung {{B. carinata x Yellow Sarson (B. campestris)} x B. napus} das Gen für die transparente Samenschalenfarbe von Yellow Sarson (B. campestris) in deren CC-Genom trägt und (ii) das Gen für die transparente Samenschale von B. carinata in Verbindung mit dem Gen für die transparente Samenschale von Yellow Sarson (B. campestris) nicht in der Lage ist gelbsamige B. napus zu produzieren.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt nach alledem transformierte Pflanzen, die eine transparente Samenschale umfassen, bereit.
  • Gemäß einem bevorzugten Aspekt beschreibt die vorliegende Erfindung die Entwicklung eines stabilen und konsistent transparent samenschalfarbigen, d.h. gelbsamigen Ölsamenraps B. napus aus interspezifischen Kreuzungen. In dieser Hinsicht wurde das Gen für die transparente Samenschalenfarbe des AA-Genoms von Yellow Sarson (B. campestris) in das CC-Genom von B. napus über Allosyndese zwischen den Chromosomen des A- und des C-Genoms übertragen. Das resultierende B. napus-AACC-Genom, welches das Gen für die transparente Samenschale von Yellow Sarson (B. campestris) trägt, ergab eine konsistent und stabil gelbsamenfarbige B. napus-Pflanzenlinie.
  • Wie insbesondere auch aus der Lehre der Beispiele zu erkennen ist, ist die Anwendung der vorliegenden Erfindung technisch nicht auf eine einzelne Pflanzensorte beschränkt.
  • Verschiedene Modifikationen und Variationen der beschriebenen Aspekte der Erfindung werden für den Fachmann ohne den Schutzumfang der Erfindung zu verlassen offensichtlich sein. Obwohl die Erfindung mit spezifischen bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte klar sein, daß die Erfindung, so wie sie beansprucht wurde, nicht in unangemessener Weise auf solche spezifische Ausführungsformen begrenzt werden sollte. Tatsächlich sollten verschiedene Modifikationen der beschriebenen Arten zur Ausführung der Erfindung, die für den Fachmann auf dem Gebiet der Pflanzenbiologie und/oder Pflanzenbiotechnologie und/oder molekularen Pflanzenbiologie und/oder benachbarten Gebieten innerhalb des Schutzumfangs der folgenden Ansprüche liegen. TABELLEN
    Figure 00290001
    Tabelle 2. Kreuzbarkeit zwischen der durch zwischenspezifische Kreuzung abgeleiteten resynthetisierten B. napus-Linien Nr. 06 und Nr. 01 und der natürlichen B. napus cv. Jaguar.
    Kreuzung Bestäubungszahl Samenzahl pro Bestäubung
    Nr. 06 x Nr. 01 Nr. 01 x Nr. 06 17 10 9.4 10.3
    Nr. 06 x Jaguar Jaguar x Nr. 06 28 10 16.9 26.1
    Nr. 01 x Jaguar Jaguar x Nr. 01 15 31 9.8 18.5
    Figure 00310001
    Tabelle 4. Kreuzbarkeit der gelbsamigen B. napus als weibliche Pflanze mit natürlicher B. napus
    Generation der gekreuzten gelbsamigen Familien Nummer der verwendeten gelbsamigen Familie Anzahl der Bestäubungen Samenzahl pro Bestäubung
    F4 1 30 3.0
    F6 6 208 4.4
    F7 2 55 4.8
    F8 2 70 6.8
    F9 3 55 6.9
  • Tabelle 5. Aufspaltung bezüglich Samenfarbe in doppelt haploiden (DH)-Linien aus der Kreuzung zwischen gelbsamiger B. napus (13-217 und 13-219) und schwarzsamiger natürlicher B. napus (Polo und Dakini).
    Kreuzung Gesamt -DH-Linien Schwarze/dunkel-braune Samen Rötlich-braune Samen teilweise gelbe Samen Gelb-braune Samen Gelbe Samen Aufspaltung 15:1a Aufspaltung 7:1b
    X2 p X2 p
    Polo x 13-717 75 52 8 8 3 4 0.008 0.9-0.95 0.43 0.5-0.7
    Dakini x 13-217 70 43 13 7 4 3 0.19 0.5-0.7 0.20 0.5-0.7
    Polo x 13-219 75 52 5 7 4 7 0.75 0.3-0.5 0.15 0.5-0.7
    Dakini x 13-219 67 48 8 5 3 3 0.12 0.7-0.9 0.48 0.3-0.5
    Gesamt 287 195 34 27 14 17 0.01 0.9-0.95 0.61 0.3-0.5
    aAufspaltung untersucht nach dem Zusammenfassen der Daten von schwarzen/dunkelbraunen, rötlich-braunen, teilweise gelben und gelb-braunen Samen in eine Klasse und von gelben Samen in die andere Klasse bAufspaltung untersucht nach Zusammenfassen der Daten von schwarzen/dunkelbraunen, rötlich-braunen und teilweise gelben Samen in einer Klasse und gelb-braunen und gelben Samen in der anderen Klasse
  • Tabelle 6. Aufspaltung hinsichtlich Petalfarbe und Erucasäuregehalt (C22:1) in doppelt Haploiden (DH)-Linien von Kreuzungen zwischen gelbsamiger B. napus (13-217 und 13-219) und natürlicher B. napus (Polo und Dakini)
    Gelbe Petale Weiße Petale
    – C22:1 + C22:1 – C22:1 + 0221
    Polo x 13-217 3 - - 7
    Dakini x 13-217 10 - 1 16
    Polo x 13-219 8 - 1 3
    Dakini x 13-219 4 1 - 7
    Gesamt 25 1 2 33
  • Die Abwesenheit (3,1% oder weniger) und die Gegenwart (15,8-33,4%) von Erucasäuregehalt ist durch (–)- und (+)-Zeichen angegeben.
  • Tabelle 7. Aufspaltung nach Glucosinolat (GLS)-Gehalt (μmol/g Samen) in doppelt haploiden Linien einer Kreuzung zwischen gelbsamiger B. napus (13-217 und 13-219) und natürlicher B. napus (Polo und Dakini).
    Kreuzung <20 μmol GLS >20 μmol GLS Aufspaltung, 1:15 X2 p
    Polo x 13-217 3 51 0.005 0.9-0.95
    Dakini x 13-217 2 55 0.34 0.5-0.7
    Polo x 13-219 1 44 0.65 0.3-0.5
    Dakini x 13-219 1 45 0.70 0.3-0.5
    Gesamt 7 195 2.22 0.1-0.2
  • REFERENZEN
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Claims (2)

  1. Verfahren zum Erzeugen von Samen mit einem erhöhten Gehalt an Samenöl und Protein und einem reduzierten Gehalt an Fasern, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: a) Kreuzen einer B. carinata mit gelben Samen und einer B. campestris mit gelben Samen, um ein drei Genome aufweisendes Haploid zu erzeugen, Kreuzen des drei Genome aufweisenden Haploids mit B. napus und Vermehren der Nachkommenschaft mit sich selbst unter Erzeugung einer Brassica-Nachzuchtpflanze, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin folgendes umfaßt: b) Kreuzen einer ersten Brassica-Pflanze, die ein CC-Genom hat, und einer zweiten Brassica-Pflanze, die ein AA-Genom einer Brassica campestris mit gelben Samen hat, Anwenden einer Embryorettungstechnik, gefolgt von Kultivierung in vitro unter Erzeugung einer Brassica-Nachzucht und c) Kreuzen der Brassica-Nachzuchtpflanze aus Stufe (a) mit der Brassica-Nachzuchtpflarize aus Stufe (b) und Vermehren der Nachkommenschaft mit sich selbst unter Erzeugung einer Brassica-Pflanze mit gelben Samen, wobei die Brassica-Pflanze mit gelben Samen Samen erzeugt, die eine konsistente und stabile gelbe Farbe haben.
  2. Verfahren zum Erzeugen einer Brassica-Pflanze, einer -Pflanzenzelle oder von – Pflanzengewebe durch selektive Kreuzung, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: a) Kreuzen einer B. carinata mit gelben Samen und einer B. campestris mit gelben Samen, um ein drei Genome aufweisendes Haploid zu erzeugen, Kreuzen des drei Genome aufweisenden Haploids mit B. napus und Vermehren der Nachkommenschaft mit sich selbst unter Erzeugung einer Brassica-Nachzuchtpflanze, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin folgendes umfaßt: b) Kreuzen einer ersten Brassica-Pflanze, die ein CC-Genom hat, und einer zweiten Brassica-Pflanze, die ein AA-Genom einer Brassica campestris mit gelben Samen hat, Anwenden einer Embryorettungstechnik, gefolgt von Kultivierung in vitro unter Erzeugung einer Brassica-Nachzucht und c) Kreuzen der Brassica-Nachzuchtpflanze aus Stufe (a) mit der Brassica-Nachzuchtpflanze aus Stufe (b) und Vermehren der Nachkommenschaft mit sich selbst unter Erzeugung einer Brassica-Pflanze mit gelben Samen, wobei die Brassica-Pflanze mit gelben Samen Samen erzeugt, die eine konsistente und stabile gelbe Farbe haben.
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