DE3231628C2

DE3231628C2 - Elektrophoresegel

Info

Publication number: DE3231628C2
Application number: DE19823231628
Authority: DE
Inventors: William Allan Gurske
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1981-01-19
Filing date: 1982-01-11
Publication date: 1987-06-04
Also published as: JPH0221745B2; SE8205386D0; IT1149706B; SE452371B; WO1982002600A1; SE8205386L; IT8219191A0; JPS57502097A; US4321121A; DE3231628T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Elektrophoresegel gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Elektrophorese-Verfahren zur Trennung von Lactatdehydrogenase(LD)-Isoenzymen sowie Elektrophorese-Gele zur Verwendung in derartigen Verfahren sind dem Fachmann bekannt, vergleiche Cawley, Electrophoresis and Immunoelectrophoresis, Little, Brown and Company, Boston, Mass. (1969). Allgemein sind die zum Trennen von LD-Isoenzymen verwendeten Elektrophorese-Gele vom Typ mit einem Polysaccharid. Gewöhnlich liegt in diesen Elektrophorese-Gelen auch ein Puffer mit einem basischen pH-Wert vor.

In Elektrophorese-Gelen nach dem Stande der Technik verwendete typische Polysaccharide sind unter anderem Stärke, Celluloseacetat, Agar, Agarose, sowie Kombinationen dieser Stoffe.

In Elektrophorese-Gelen nach dem Stande der Technik verwendete typische Puffer mit einem basischen pH-Wert sind unter anderem die in Tabelle I bei Cawley, a. a. O., pp. 331-332, angegebenen basischen pH-Puffer.

Ein Problem bei einem grundlegenden Elektrophorese-Verfahren nach dem Stande der Technik zur Trennung von LD-Isoenzymen besteht darin, daß, wie in Fig. 1 veranschaulicht, die Symmetrie der LD₁-Bande insofern nicht den anderen vier LD-Banden entspricht, als an der Vorderkante der LD₁-Bande eine Schulter bzw. ein Höcker oder Vorsprung vorhanden ist.

Es wäre daher sehr erwünscht, über ein Elektrophorese-Verfahren zur Trennung von LD-Isoenzymen verfügen zu können, bei welchem die Symmetrie der LD₁-Bande verbessert ist, derart, daß sie der der anderen vier LD-Banden entspricht.

Der Erfindung liegt als Aufgabe die Schaffung eines speziell zur Trennung von LD-Isoenzymen bestimmten Elektrophorese-Gels zugrunde, bei dessen Verwendung die o. e. Abweichung der LD₁-Bande von der Symmetrie durch einen Höcker bzw. eine Schulter an der Vorderflanke der LD₁-Bande verringert oder sogar ganz eliminiert ist, derart daß die LD₁-Bande in ihrem Symmetrie-Verhalten den anderen vier LD-Banden entspricht.

Zu diesem Zweck ist bei einem Elektrophorese-Gel der vorstehend genannten Art gemäß der Erfindung vorgesehen, daß das Elektrophorese-Gel zusätzlich ein saures Polysaccharid aus der Gruppe Arabinsäure, Tragantsäure, Karaya-Säure, Alginsäure und Pektinsäure und/oder Salz(e) hiervon enthält.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung kann vorgesehen sein, daß das Gel des weiteren ein Galaktomannan-Polysaccharid enthält.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, daß man durch Einlagerung eines sauren Polysaccharids und/oder Salzes hiervon in die Gel-Zusammensetzung ein Elektrophorese-Gel erhält, dessen Anwendung bei der elektrophoretischen Trennung von LD-Isoenzymen eine wesentliche Verbesserung des Symmetrieverhaltens der LD₁-Bande erbringt.

Gel-Zusammensetzungen, welche neben einem Grund-Polysaccharid andere Polysaccharide enthalten, sind in anderem Zusammenhang an sich bekannt. Aus der US-PS 42 90 911 ist ein speziell auf isoelektrische Fokussierung abgestelltes Elektrophorese-Gel bekannt, das eine Agarose niedrigst-möglicher Elektroendosmose und Guargummi (also ein Galaktomannan-Polysaccharid) enthält. Die für die vorliegende Erfindung wesentliche Kombination eines Grund-Polysaccharids (und zwar vorzugsweise eines hoch-elektroendosmotischen) mit einem sauren Polysaccharid (oder Salz hiervon) ist hieraus nicht bekannt. Aus der US-PS 35 27 712 sind Gele für Zwecke der Gelfiltration (darunter auch für Elektrophorese-Anwendungen) bekannt, welche in ihrer anfänglichen Zusammensetzung Agarose in Verbindung mit sauren Polysacchariden und Galaktomannan-Polysacchariden enthalten. Vor der eigentlichen Anwendung für den Gelfiltrationszweck werden aus dieser Gelzusammensetzung jedoch durch Rehydration der das saure Polysaccharid und/oder das Galaktomannan-Polysaccharid enthaltende Hydrokolloidbestandteil wieder entfernt, so daß bei der eigentlichen Anwendung das Gel in einfacher Form als Agarose-Gel vorliegt.

Aus der US-PS 24 66 146 schließlich sind genießbare Geliermittel für Lebensmittelanwendungen auf der Basis von Gelose mit Johannisbrotgummi (als einem Galaktomannan-Polysaccharid) bekannt. Ein Bezug zu Elektrophorese-Gelen ist hierbei nicht gegeben.

Aus der US-Patentschrift 39 59 251 ist bekannt, daß Agar, das ein bekanntes und übliches Elektrophorese-Gel darstellt und vorzugsweise auch als Grundpolysaccharid für die Zwecke der vorliegenden Erfindung anwendbar ist, im unbehandelten Zustand bereits ein Gemisch von Polysacchariden darstellen kann, das u. a. auch bereits saure Carboxylgruppen enthaltende Polysaccharide aufweisen kann. Hieraus ist jedoch nicht die gezielte Anwendung eines oder mehrerer zusätzlicher saurer Polysaccharide aus der genannten Gruppe gemäß dem Grundgedanken der Erfindung bekannt; außerdem ist in der US-Patentschrift 39 59 251 angegeben, daß die Gegenwart von carboxylgruppen-haltigen Bestandteilen in dem Agar die Verwendung als Elektrophorese-Gel störend beeinträchtigen kann und deshalb die Verringerung des Carboxylgehalts praktisch auf Null vorzuziehen ist.

Nachfolgend werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung mit näheren Einzelheiten beschrieben.

Fig. 1 ist ein Elektropherogramm einer LD-Isoenzym-Verteilung mit einer Schulter oder einem Höcker an der Vorderkante des LD₁-Bandes.

Fig. 2 ist ein Elektropherogramm einer LD-Isoenzym-Verteilung mit einer stark reduzierten Schulter an der Vorderkante des LD₁-Bandes.

Fig. 3 ist ein Elektropherogramm einer LD-Isoenzym-Verteilung mit einer stark reduzierten Schulter an der Vorderkante des LD₁-Bandes.

Fig. 4 ist ein Elektropherogramm einer LD-Isoenzym-Verteilung, bei welcher die Schulter bzw. der Höcker an der Vorderkante des LD₁-Bandes vollständig eliminiert ist.

Zur Verwendung für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete saure Polysaccharide sind unter anderem (jedoch ohne Beschränkung hierauf) Arabinsäure, Tragantsäure, Karaya-Säure, Alginsäure und Pektinsäure. Das bevorzugte saure Polysaccharid ist Arabinsäure.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Salze saurer Polysaccharide sind unter anderem die Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze der Polysaccharide. Beispiele derartiger saurer Polysaccharidsalze sind unter anderem Gummiarabicumsäure, Tragantgummisäure, Karaya-Khayagummisäure, Algingummisäure und Pektingummisäure.

Zur Verwendung für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Galaktomannan-Polysaccharide sind unter anderem Guargummi und Johannisbrotgummi. Das bevorzugte Galaktomannan-Polysaccharid ist Guargummi.

Polysaccharide, die bevorzugt in dem Elektrophorese-Gel der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Agar und Agarose. Die Agarose kann entweder niedrig-elektroendosmotische Agarose, mittel-elektroendosmotische oder hoch-elektroendosmotische Agarose sein. Besonders bevorzugt ist als in dem Elektrophorese-Gel der vorliegenden Erfindung verwendetes Polysaccharid hoch-elektroendosmotische Agarose.

Der für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendete Puffer weist vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 10 auf. Besonders bevorzugt weist der Puffer einen pH-Wert im Bereich von 8 bis 9 auf.

Das Elektrophorese-Gel gemäß der Erfindung kann wahlweise des weiteren ein Konservierungsmittel enthalten. Typische Konservierungsmittel sind unter anderem Antibiotika, halogenierte organische Verbindungen sowie anorganische Verbindungen. Ein zur Verwendung für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignetes, leicht verfügbares Konservierungsmittel ist Natriumazid.

Das Elektrophorese-Gel gemäß der vorliegenden Erfindung kann ferner auch wahlweise ein Alkylpolyol mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und 2 bis 4 Hydroxylgruppen enthalten. Zur Verwendung für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Alkylpolyle sind unter anderem Äthylenglykol, Propandiol, Butandiol, Pentandiol und Glyzerin. Vorzugsweise besitzt das Alkylpolyol 2 bis 4 Kohlenstoffatome.

Die jeweiligen genannten Konzentrationen der verschiedenen in dem Elektrophorese-Gel gemäß der Erfindung verwendeten Bestandteile sind nicht kritisch. Jedoch weist gemäß einer Ausführungsform der Erfindung das Elektrophorese-Gel vorzugsweise von 0,4 bis 1,5% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose, von 0,01 bis 2% Gewicht/Volumen Arabinsäure, bis zu 20% Volumen/Volumen Äthylenglykol, bis zu 0,5% Gewicht/Volumen Natriumazid, sowie einen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 7 bis 10 auf. Besonders bevorzugt weist das Elektrophorese-Gel gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung von 0,7 bis 1,2% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose, von 0,5 bis 1% Gewicht/Volumen Arabinsäure, von 1 bis 10% Volumen/Volumen Äthylenglykol, von 0,05 bis 0,15% Gewicht/Volumen Natriumazid, sowie einen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 8 bis 9 auf. Optimal weist das Elektrophorese-Gel gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung etwa 1% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose, etwa 0,75% Gewicht/Volumen Arabinsäure, etwa 5% Volumen/Volumen Äthylenglykol, etwa 0,1% Gewicht/Volumen Natriumazid, sowie einen Puffer mit einem pH-Wert von etwa 8,2 auf, sowie etwa 0,3% Gewicht/Volumen Asparaginsäure, etwa 0,4% Gewicht/Volumen Bicin, etwa 0,3% Gewicht/Volumen Natriumbarbital, sowie etwa 0,4% Gewicht/Volumen 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol.

Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung weist das Elektrophorese-Gel vorzugsweise von 0,4 bis 1,5% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose, von 0,001 bis 2% Gewicht/Volumen Guargummi, bis zu 20% Volumen/Volumen Äthylenglykol, bis zu 0,5% Gewicht/Volumen Natriumazid, sowie einen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 7 bis 10 auf. Besonders bevorzugt weist das Elektrophorese-Gel gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung von 0,7 bis 1,2% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose, von 0,01 bis 0,1% Gewicht/Volumen Guargummi, von 1 bis 10% Volumen/Volumen Äthylenglykol, von 0,05 bis 0,15% Gewicht/Volumen Natriumazid, sowie einen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 8 bis 9 auf. Optimal weist das Elektrophorese-Gel gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung etwa 1% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose, etwa 0,05% Gewicht/Volumen Guargummi, etwa 5% Volumen/Volumen Äthylenglykol, etwa 0,1% Gewicht/Volumen Natriumazid, sowie den obengenannten Puffer auf.

Gemäß einer dritten Ausführungsform der Erfindung weist das Elektrophorese-Gel vorzugsweise von 0,4 bis 1,5% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose, von 0,01 bis 2% Gewicht/Volumen Arabinsäure, von 0,001 bis 2% Gewicht/Volumen Guargummi, bis zu 20% Volumen/Volumen Äthylenglykol, bis zu 0,5% Gewicht/Volumen Natriumazid, sowie einen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 7 bis 10 auf. Besonders bevorzugt weist das Elektrophorese-Gel gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung von 0,7 bis 1,2% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose, von 0,5 bis 1% Gewicht/Volumen Arabinsäure, von 0,01 bis 0,1% Gewicht/Volumen Guargummi, von 1 bis 10% Volumen/Volumen Äthylenglykol, von 0,05 bis 0,15% Gewicht/Volumen Natriumazid, sowie einen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 8 bis 9 auf. Optimal weist das Elektrophorese-Gel gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung etwa 1% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose, etwa 0,75% Gewicht/Volumen Arabinsäure, etwa 0,05% Gewicht/Volumen Guargummi, etwa 5% Volumen/Volumen Äthylenglykol, etwa 0,1% Gewicht/Volumen Natriumazid, sowie den obengenannten Puffer auf.

Die Elektrophorese-Gele gemäß der vorliegenden Erfindung können nach einem beliebigen, dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, vergleiche beispielsweise die oben angegebene Literaturstelle Cawley, a. a. O. Allgemein werden zur Herstellung der Gel-Lösung die verschiedenen Bestandteile miteinander vermischt bei gleichzeitiger Erhitzung des Gemischs auf eine Temperatur im Bereich von 80 bis 100°C. Das Elektrophorese-Gel kann nach herkömmlichen Formgebungs- oder Gießverfahren hergestellt werden. Die Gele können bei einer beliebigen zweckmäßigen Temperatur gelagert werden, beispielsweise bei einer Temperatur im Bereich von 2 bis 40°C, vorzugsweise im Bereich von 15 bis 26°C. Vorzugsweise werden die elektrophoretischen Gele in dicht verschlossenen Kunststoffbehältern bis zur Gebrauchsverwendung gelagert.

Auf die Elektrophorese-Gele gemäß der vorliegenden Erfindung können Proben nach einem beliebigen bekannten Verfahren aufgebracht werden, beispielsweise mittels einer Mikroliter-Injektionsspritze. Die Elektrophorese-Gele können sodann bei 100 V 20 Minuten lang der Elektrophorese-Behandlung unterworfen werden. Danach werden die Gele bei einer geeigneten Temperatur, beispielsweise Zimmertemperatur bis 50°C, während einer geeigneten Zeitdauer, beispielsweise bis zu 2 Stunden, mit einem beliebigen bekannten, mit den darin enthaltenen LD-Enzymen reaktionsfähigen Substrat inkubiert. Falls erwünscht, können die Gele in einer Essigsäurelösung (5%) gespült werden. Außerdem können die Gele wahlweise bei 80 bis 90°C getrocknet werden.

Beispiel 1

Die vier in der Tabelle I angegebenen Elektrophorese-Gel-Ansätze wurden jeweils gemäß dem nachfolgenden Versuchsprotokoll verwendet, zur Veranschaulichung des verbesserten Elektrophorese-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung zur Trennung von LD-Isoenzymen sowie des verbesserten elektrophoretischen Gels zur Verwendung in diesem Verfahren. Der einzige Unterschied zwischen den vier in diesem Vergleichsexperiment verwendeten Elektrophorese-Gelen bestand darin, daß die innerhalb des Rahmens der Erfindung liegenden Elektrophorese-Gele entweder Arabinsäure, d. h. ein spezielles saures Polysaccharid, und/oder Guargummi enthielten, während das außerhalb des Rahmens der Erfindung liegende Elektrophorese-Gel weder ein saures Polysaccharid noch ein Galaktomannan-Polysaccharid enthielt.

Versuchsprotokoll Elektrophorese-Behandlung

1. Auf die einzelnen Gele wurde nach einem Schabloneverfahren ein Kontrollserum aufgebracht.
2. Die Gele wurden bei 100 V 20 Minuten lang der Elektrophorese unterworfen.
3. Auf die Gele wurde ein Kolorimetrisches Standard-LD-Substrat aufgebracht und jedes Gel jeweils 30 Minuten lang bei 45°C inkubiert.
4. Die Gele wurden in 5%iger Essigsäure getränkt und bei 80 bis 90°C getrocknet.
5. Die Gele wurden in einem Densitometer bei 600 nm durchgemessen.

Die bei der Vorgangsweise gemäß dem vorstehenden Protokoll für die einzelnen Gel-Ansätze der Tabelle I erzielten Ergebnisse sind in den Fig. 1 bis 4 veranschaulicht.

Tabelle I

Wie aus Fig. 1 ersichtlich, wird bei einem Elektrophorese-Verfahren zur Trennung von LD-Isoenzymen unter Verwendung eines Elektrophorese-Gels nach dem Stande der Technik, das weder ein saures Polysaccharid (in welchem der Säurebestandteil wenigstens eine Carboxylgruppe aufweist) noch ein Galaktomannan-Polysaccharid enthält, eine LD-Isoenzym-Verteilung erhalten, welche an der Vorderkante der LD₁-Bande eine beträchtliche Schulter aufweist. Demgegenüber wird bei einem Elektrophorese-Verfahren zur Trennung von LD-Isoenzymen unter Verwendung eines verbesserten Elektrophorese-Gels gemäß einer der drei verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung diese Schulter bzw. dieser Höcker an der Vorderkante der LD₁-Bande stark reduziert.

Claims

1. Elektrophrorese-Gel zur Verwendung bei der elektrophoretischen Analysebestimmung der relativen Verteilung von Lactatdehydrogenase-Isoenzymen, wobei das Elektrophorese-Gel ein oder mehrere Grundpolysaccharid(e) sowie einen Puffer mit einem basischen pH-Wert enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Elektrophorese-Gel zusätzlich ein saures Polysaccharid aus der Gruppe Arabinsäure, Tragantsäure, Karaya-Säure, Alginsäure und Pektinsäure und/oder Salz(e) hiervon enthält.

2. Elektrophorese-Gel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das bzw. die Salz(e) aus der Gruppe Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze gewählt ist/sind.

3. Elektrophorese-Gel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es des weiteren ein Konservierungsmittel, vorzugsweise Natriumazid, enthält.

4. Elektrophorese-Gel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es des weiteren ein Alkylpolyol mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und 2 bis 4 Hydroxylgruppen, vorzugsweise Äthylenglykol, aufweist.

5. Elektrophorese-Gel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das bzw. die Grund-Polysaccharid(e) aus der Gruppe Agar und Agarose gewählt ist bzw. sind.

6. Elektrophorese-Gel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche in Verbindung mit Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 10, und vorzugsweise im Bereich von 8 bis 9, aufweist.

7. Elektrophorese-Gel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch die folgenden Gehalte:

(a) von 0,4 bis 1,5% Gewicht/Volumen, vorzugsweise von 0,7 bis 1,2% Gewicht/Volumen, und besonders bevorzugt etwa 1% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose,
(b) von 0,1 bis 2% Gewicht/Volumen, vorzugsweise von 0,5 bis 1% Gewicht/Volumen, und besonders bevorzugt etwa 0,75% Gewicht/Volumen Arabinsäure,
(c) bis zu 0,5% Gewicht/Volumen, vorzugsweise von 0,05 bis 0,15% Gewicht/Volumen, und besonders bevorzugt etwa 0,1% Gewicht/Volumen Natriumazid,
(d) bis zu 20% Volumen/Volumen, vorzugsweise von 1 bis 10% Volumen/Volumen, und besonders bevorzugt etwa 5% Volumen/Volumen Äthylenglykol, sowie
(e) einen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 7 bis 10, vorzugsweise von 8 bis 9, und besonders bevorzugt mit einem pH-Wert von etwa 8,4.

8. Elektrophorese-Gel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Elektrophorese-Gel des weiteren zusätzlich ein Galaktomannan-Polysaccharid enthält.

9. Elektrophorese-Gel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Galaktomannan-Polysaccharid aus der Gruppe Guargummi und Johannisbrotgummi gewählt ist.

10. Elektrophorese-Gel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach den Ansprüchen 8 und 9, gekennzeichnet durch die folgenden Gehalte:

(a) von 0,4 bis 1,5% Gewicht/Volumen, vorzugsweise von 0,7 bis 1,2% Gewicht/Volumen, und besonders bevorzugt von etwa 1% Gewicht/Volumen hoch-elektroendosmotische Agarose,
(b) von 0,001 bis 2% Gewicht/Volumen, vorzugsweise von 0,01 bis 1% Gewicht/Volumen, und besonders bevorzugt von etwa 0,05% Gewicht/Volumen Guargummi,
(c) bis zu 0,5% Gewicht/Volumen, vorzugsweise von 0,05 bis 0,15% Gewicht/Volumen, und besonders bevorzugt etwa 0,1% Gewicht/Volumen Natriumazid,
(d) bis zu 20% Volumen/Volumen, vorzugsweise von 1 bis 10% Volumen/Volumen, und besonders bevorzugt etwa 5% Volumen/Volumen Äthylenglykol, sowie
(e) einen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 7 bis 10, vorzugsweise von 8 bis 9, und besonders bevorzugt mit einem pH-Wert von etwa 8,2.

11. Elektrophorese-Gel nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach den Ansprüchen 7 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer etwa 0,3% Gewicht/Volumen Asparaginsäure, etwa 0,4% Gewicht/Volumen Bicin, etwa 0,3% Gewicht/Volumen Natriumbarbital und etwa 0,4% Gewicht/Volumen 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol aufweist.