NL9000997A - Werkwijze voor het bepalen van de hybride kwaliteit van zaden. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het bepalen van de hybride kwaliteit van zaden.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van de hybride kwaliteit van zaden, waarbij zaadeiwitten bij een geschikte pH gradient door middel van isoelektrische focussering van elkaar worden gescheiden, waarna de aldus gescheiden eiwitten op gebruikelijke wijze worden gekleurd en visueel gedetecteerd.

De hybride kwaliteit van zaden is een kenmerk van zaadpartijen, welke van bijzonder groot belang is voor het zaadbedrijf. Gedurende de laatste tien, twintig jaren heeft het gebruik van hybride zaden een enorme vlucht genomen. Tegenover de zaden van open bestoven rassen bieden de zaden van F1 hybride rassen bijzondere voordelen. Dit hangt samen met de manier van ontwikkeling en produktie van hybride rassen. In het eenvoudigste geval gaat men uit van twee verschillende ouderlijnen (de mannelijke ouder welke het pollen levert en de vrouwelijke lijn, welke bestoven wordt en waarvan uiteindelijk het zaad geoogst wordt), welke door recombinatie, selectie en inteling verkregen zijn. Door het proces van in-teling of zelfbevruchting zijn de ouders van hybriden homo-zygoot voor de meeste eigenschappen. Doordat beide ouders die gebruikt worden voor het produceren van hybriden, door het proces van zelfbevruchting zo homogeen zijn, zal het uiteindelijk te oogsten hybride zaad ook zeer homogeen van genetische samenstelling zijn. Het uiteindelijke gewas dat uit het hybride zaad groeit is dan ook bijzonder uniform, ten aanzien van eigenschappen zoals morfologie, opbrengst, oogst-tijdstip, teeltwijze, etc. Naast uniformiteit geven hybride rassen ook vaker een meeropbrengst tegenover open bestoven rassen. Deze voordelen van de hybride rassen zijn voor de koper van de hybride zaden van groot belang (bijvoorbeeld mechanische oogst is mogelijk geworden door de uniformiteit van het gewas). Daarmede is ook het belang van de hybride kwaliteit van het gewas aangetoond. Als de moederlijn van de hybride door welke oorzaak dan ook zelfbevrucht wordt, leidt dit tot moederzaad in plaats van hybride zaad. Ook zelfbevruchting van de vaderlijn kan voorkomen en door omstandig- heden kan zaad van de vader geoogst worden. Zelfbevruchting van de moederlijn leidt tot inteeltzaad in het hybride zaad.

Dit is slechts in zeer geringe mate aanvaardbaar voor de koper van het hybride zaad. Daarom wordt de hybride kwaliteit van zaad in de praktijk vastgesteld door een steekproef te nemen.

Die bestaat hieruit, dat men een bepaald aantal zaden uitzaait, de planten onder de juiste omstandigheden laat groeien tot volwassen vruchtdragend stadium, en vervolgens een gedetineerde analyse van alle eigenschappen van de hybride planten uitvoert. Omdat de hybride een "som” 'is van beide ouders, en de ouders in de meeste gevallen verschillen in eigenschappen zal een dergelijke analyse een betrouwbaar resultaat opleveren. Maar deze methode is langdurig en kostbaar. Doordat het verkrijgen van de gegevens aangaande de hybride kwaliteit van i het zaad lang (enige maanden) op zich kan doen wachten, kan het zaad niet direct na de oogst verkocht worden. Dat betekent dat het zaad in veel gevallen heel lang, wel langer dan een jaar, opgeslagen moet worden, met alle kosten van dien. Dat veroorzaakt niet alleen meerkosten door opslag op zich, maar i ook door kwaliteitsverlies, het missen van verkoopmogelijkheden, en een moeilijker planning van volgende produkties.

Een meer moderne werkwijze voor de bepaling van de hybride kwaliteit van zaden, waarbij gebruik wordt gemaakt van isoelektrische focussering, is bekend uit het artikel ) van R.J. Cooke en S.R. Draper uit J. natn.Inst.agric.Bot., (1983),16, 173-181. In dit artikel wordt een methode beschreven voor de toepassing van ultradunne-laag isoelektrische focussering voor het karakteriseren van zaden, waartoe de afzonderlijke zaden worden fijngemaakt, waarna het fijngemaakte zaad ) of gedeelten daarvan worden geëxtraheerd in een gering volume (100-250 yl) 1,0 M ureum met of zonder 2 volumeprocent 2.mer-captoethanol (afhankelijk van de soorten) in een polypropyleen centrifugebuis.

Na eventueel ontvetten wordt de uremumoplossing j behandeld met Amberlite MB-1, waarna de uiteindelijk verkregen heldere supernatant werd gebruikt voor focussering.

Naast zaden, zoals van tarwe, haver, luzerne en raapzaad kan men ook de zaadeiwitten van erwten en bonen bepalen.

Een gebruikelijke techniek is hierbij het gebruik maken van amfolyten voor het creëren van de pH-gradient in de gel, waardoor de resolutie van de eiwitten wordt bevorderd.

Volgens dit artikel heeft de bekende werkwijze het voordeel, dat er een uitstekende resolutie van de zaad-proteinen wordt verkregen op een veel snellere wijze dan in het geval van de conventionele gelelektroforesetechnieken.

Van de toepassing van een dergelijke isoelektrische focusseringsmethode voor het bepalen van de hybride kwaliteit van de zaden van tuinbouwgewassen, zoals tomaten, koolgewassen, meloenen, pepers enz. werd in dit artikel met geen woord gerept.

Verrassenderwijze is gebleken, dat wanneer men de isoelektrische focusseringstechniek toepast op zaadeiwitten van tomaten, kool, meloenen, paprika, pepers enz., zulk een methode een succesvol instrument bleek te zijn voor het bepalen van de F1 hybride zuiverheid van dergelijke rassen.

Dienovereenkomstig omvat de onderhavige uitvinding een werkwijze voor het bepalen van de hybride kwaliteit van zaden, waarbij zaadeiwitten bij een geschikte pH-gradient door middel van isoelektrische focussering van elkaar worden gescheiden, waarna de aldus gescheiden eiwitten op gebruikelijke wijze worden gekleurd en visueel gedetecteerd, met het kenmerk, dat de hybride kwaliteit van Fl hybride zaden van tuinbouwgewassen wordt bepaald door gebruik te maken van het verschil tussen de isoelektrische punten van moeder- en vaderspecifieke zaadeiwitten.

De onderhavige uitvinding verschaft een methode om zeer snel en goedkoper de hybride kwaliteit van doorgaans kostbare hybride zaden van tuinbouwgewassen vast te stellen.

De methode volgens de uitvinding berust op de analyse van zaadeiwitten uit de hybride zaden. Omdat hybride zaden eigenschappen hebben welke de "som" is van de eigenschappen van de ouders, zal het hybride zaad zowel moeder- als vader-specifieke eiwitten bevatten. Deze analyse is zeer snel uit te voeren en is significant goedkoper dan de tot nu gebruikte methode, waarbij gebruik wordt gemaakt van volwassen planten. De methode is bovendien betrouwbaarder. Immers, het ontbreken van vaderspecifieke eiwitten (alleen zaad van de moeder wordt geoogst) geeft onomstotelijk aan dat zelfbevruchting van de moeder is opgetreden.

De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding biedt een groot economisch voordeel voor het zaadbedrijf/ i omdat hierdoor het bedrijf in staat wordt gesteld veel sneller en derhalve op meer economische wijze de F1 hybride kwaliteit van het gewenste zaad te bepalen.

Bijzonder geschikt bleek de isoelektrische focus-seringsmethode te zijn voor het bepalen van de hybride kwa-I liteit van tomaten, waarbij gebruik wordt gemaakt van het isoelektrische punt van moeder- en vaderspecifieke eiwitten, dat 7,1 en 6,1 is voor respectievelijk PRS-1+ en PRS-11.

Voor tomaten waren er reeds twee andere methoden beschikbaar, te weten de z.g. enzympolymorfie, namelijk voor > de enzymen zuur fosfatase, afkomstig van bladweefsel, alsmede alcohol dehydrogenase, afkomstig van geïmbibeerd zaad.

Aan deze twee bekende methoden voegt de uitvinding een derde methode toe, waardoor een snelle en betrouwbare hybride kwaliteitsbepaling van tomatenzaden mogelijk is.

) Voor de bepaling van de hybride kwaliteit van kool- gewassen maakt men gebruik van de moeder- en vaderspecifieke eiwitten, die wateroplosbare PRS-1 eiwitten zijn met een iso-elektrisch punt van 6,4 en 7,4 respectievelijk voor PRS-1+ en PRS-11.

) Ook ingeval van koolgewassen, net als in het geval van tomaten, voegt de uitvinding aan de bestaande methoden een nieuwe, snelle en betrouwbare hybride kwaliteitsbepalings-methode toe.

Opgemerkt wordt, dat in het geval van meloenen ) en pepers tot nu toe geen enkele methode beschikbaar was voor de bepaling van de hybride kwaliteit van de zaden ervan.

Verrassenderwijze is gebleken, dat de werkwijze volgens de uitvinding bijzonder geschikt is voor de bepaling van de hybride kwaliteit van zowel meloenen als pepers.

> Bij het bepalen van de hybride kwaliteit van meloenen maakt men gebruik van de moeder- en vaderspecifieke PRS eiwitten, die wateroplosbare eiwitten zijn met een iso-elektrisch punt van 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 7,0, 8,5, 8,6, 8,7 en eiwitten oplosbaar in 8M ureum met een isoelektrisch punt van 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 6,1, 6,5, 8,9, 9,0, 9,7, 9,9.

Indien men de hybride kwaliteit van pepers wil bepalen maakt men gebruik van de in 8 M ureum oplosbare moeder- en vaderspecifieke PRS-1 eiwitten met een isoelek-trisch punt van 4,0 en 5,2 respectievelijk voor PRS-1+ en PRS-1-1.

In het algemeen omvat de procedure van de onderhavige werkwijze het fijnmaken of homogeniseren van zaad, dat afkomstig is van een partij zaad, waarvan men de hybride kwaliteit wil bepalen, in een bepaalde vloeistof, waarvan water een hoofdbestanddeel is, in welke vloeistof de eiwitten in oplossing gaan. Een bepaalde fractie van de vloeistof wordt op een gel gebracht, waarna de scheiding van de eiwitten plaatsvindt door middel van isoelektrische focussering.

Dan na afloop van de scheiding vindt de detectie plaats van de vader- en moederspecifieke eiwitten door middel van geeigende kleurstof of zilvernitraat. De lokatie van de moeder- en vaderspecifieke eiwitten in de gel wordt experimenteel vastgesteld. Wanneer nu in bijvoorbeeld het tomate-zaad beide, d.w.z. moeder- en vaderspecifieke, eiwitten aanwezig zijn, hetgeen kan worden afgeleid door de isoelektrische punten van de moeder- en vaderspecifieke eiwitten uit het zaadextract, dan kan worden gesteld, dat we hier te maken hebben met een F1 hybride, waarin de eigenschappen van zowel moeder als vader aanwezig zijn.

Zo wordt bijvoorbeeld bij tomaten gebruik gemaakt van twee eiwitten, te weten met een isoelektrisch punt van respectievelijk 7,1 en 6,1, die gecodeerd worden door "respec- . . + 1 tievelijk de allelen Prs-1 en PRS-1 .

Deze methode berust op genetische variatie voor het gen Prs-1. Dit gen codeert dus voor twee eiwitten PRS-1 en PRS-11.

De kracht van de isoelektrische focussering ter bepaling van inteelt ligt daarin, dat de detectie on-afhankelijk is van milieuomstandigheden. Immers, ook in opeenvolgende generaties blijven dé genen"in öe ouderlijnen zitten.

Zoals reeds eerder vermeld, is de onderhavige werkwijze in het bijzonder geschikt voor de bepaling van de hybride zuiverheid van zaden van tuinbouwgewassen, zoals bijvoorbeeld de zoëven genoemde tomaten, meloenen, pepers, koolgewassen, maar ook aubergines, augurk, courgettes, komkommers, radijs etc.

Bij de isoelektrische focussering ontstaan er in een gel elektroforesepatronen, die als volgt worden geïnterpreteerd. Men gaat aan de hand van het patroon onderzoeken welke zaden F1 hybride zuiver zijn en welke niet. Bij de F1 hybride zijn de karakteristieke banden van zowel moeder als vader terug te vinden. Ontbreekt er in het referentiepatroon de vaderspecifieke band dan is het zaad niet hybride zuiver. Wanneer we er van uitgaan dat er honderd zaden worden onderzocht, die dan ook op het isoelektrische focusseringspatroon worden meegenomen, dan is het zo, dat bij tomaten alle honderd zuiver moeten zijn wil men spreken van een goede zaadkwaliteit voor een bepaalde partij. Mocht er zelfs één niet zuiver zijn, dan is een dergelijke partij minder gewenst. In het algemeen wordt de prijs van een zaad primair bepaald door de mate van hybride zuiverheid. De gewenste mate van hybride zuiverheid en de relatie tussen prijs is van gewas tot gewas verschillend. Bij tomaten bijvoorbeeld stelt men hoge eisen aan de hybride zuiverheid. Bij koolgewassen daarentegen zijn de toleranties gewoonlijk groter en men vindt dat hybride onzuiverheid van enkele procenten bij koolgewassen aanvaardbaar is. Daarbij is bovendien nog van belang, of er sprake is van bloemkool, witte kool, rode kool etc.

De uitvinding wordt thans toegelicht aan de hand van de volgende figuren, waarbij

Fig. 1 een isoelektrisch focusseringspatroon voor tomaat F1 hybride Bornia aangeeft,

Fig.2 een isoelektrisch focussingspatroon voor bloemkool F1 hybride Plana weergeeft, en

Fig. 3 een schematische weergave van de hybride kwaliteitsbepaling ofwel de inteeltbepaling van zaden via isoelektrische focussering voorstelt.

In fig. 1 is het volgens isoelektrische focussering verkregen F1 hybride patroon voor de tomaat Bornia weergegeven, waarin zowel de band voor het vaderspecifieke eiwit 3 als de band voor het moederspecifieke eiwit 2 zijn weergegeven.

In fig. 2 is het volgens isoelektrische focus-i sering verkregen F1 hybride patroon voor de bloemkool Plana weergegeven, waarin zowel de vaderspecifieke band 6 als de moederspecifieke band 4 voorkomen.

In fig. 3 wordt de bepaling van de hybride kwaliteit, ook wel de inteeltbepaling genoemd, van een partij zaden via de isoelektrische focussering schematisch weergegeven. Er wordt gebruik gemaakt van een gelplaat 7, die is voorzien van een positieve elektrode 8 en een negatieve elektrode 9. Vlak boven de positieve elektrode bevindt zich een van holtes 11 voorziene rubber monsteropbrengstrook 10. Voorts zijn moederspecifieke, respectievelijk vaderspecifieke eiwitbanden 12 en 13 afgebeeld, alsmede een F1 hybride patroon 14, waarin zowel de moeder- als vaderspecifieke eiwitbanden voorkomen.

Bij de inteeltbepaling van een partij zaden wordt een waterige eiwitoplossing van telkens één zaad uit de partij zaden overgebracht in een holte 11 van de monsteropbrengstrook 10.

Dan neemt men een eiwitoplossing van een zaad, waarin slechts moederspecifieke eiwitten aanwezig zijn en van een zaad waarin slechts vaderspecifieke eiwitten voorkomen en tenslotte een van een Fl hybride, waarin beide ei-witsoorten aanwezig zijn. Bij het aanleggen van het gewenste spanningsverschil tussen de positieve en negatieve elektrodes 8 en 9 verkrijgt men bij een bepaalde pH gradient en na kleuring met een geëigende kleurstof of zilvernitraat het in fig. 3 weergegeven eiwitpatroon. In de eerste drie holtes van links naar rechts zijn respectievelijk de moederspecifieke,

Fl hybride en vaderspecifieke eiwitoplossingen ondergebracht en in de overige holtes de eiwitoplossingen van de zaden waarvan men de hybride kwaliteit, d.w.z. de inteelt, wil bepalen.

De moeder- en vaderspecifieke eiwitten worden ook wel marker-eiwitten genoemd. Mocht er een van de markereiwitten ontbreken, zoals bijvoorbeeld bij 15 (bij 15 ontbreekt het vaderspecifieke eiwit) dan is er sprake van inteelt.

Op die manier kan men de hybride kwaliteit van allerlei Fl hybride zaden van tuinbouwgewassen bepalen, waaronder die van tomaten, koolgewassen, pepers, meloenen enz.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding gebruikt men gewoonlijk water, dat was gezuiverd door het Milli-Q

systeem (Millipore, Bedford, Ver.Staten van Amerika).

Bovendien gebruikt men: Acrylamide, bis-acrylamide, kathodevloeistof 10 (op basis van arginine, lysine en ethyleendiamine), amfolyten (servalyt pH 6-9), Coomassie Brilliant Blue R-250 (Serva Blue R), kerosine, en pi eiwit kit (gebied 3.6 - 9.6) van Serva (Heidelberg, Bondsrepubliek Duitsland); azijnzuur, glycine, glycerol, pi eiwit kit (gebied 5,65 - 8.3), en TCA van BDH (Poole, Verenigd Koninkrijk).

De volgens de uitvinding toegepaste gelfixatie voor bekledingen en gelfixatie voor PAGE (265 x 193 mm) en elektrodestroken (300 x 6 x 1 mm) zijn afkomstig van Serva (Heidelberg, Bondsrepubliek Duitsland). Vlakke bodem micro-titerplaten met 96 holtes zijn afkomstig van Costar (Cambridge, Ver. Staten van Amerika). Plakband (tesa, 100 -μπΟ was van Beun de Ronde (Abcoude, NL).

De volgens de uitvinding toegepaste ultradunne laag isoelektrische focussering, afgekort UTLIEF, is een bekende methode, waarbij men aldus te werk gaat. Eerst bereidt men gelen.

UTLIEF gelen werden bereid volgens de ''flap" techniek, zoals beschreven door Radola. Plakband werd gebruikt als afstandsstrook langs elke kant van de gelfixatiefilm (265 mm x 193 mm). Onder gebruikmaking van drie elektroden konden twee gelen van de afmeting 250 x 90 mm tegelijkertijd in bedrijf zijn. De gelfixatie en bekledingsfilms werden op glasplaten uitgerold met een paar druppels water tussen de glasplaat en de film. Het polymerisatiemengsel bevatte 1.32 ml acrylamide (30% mono gew./v, 3% bis gew./v); 5.72 ml 16% glycerol; 0,6 ml amfolyten van het gewesnte pH traject; 0.4 ml 1.5% ammonium persulfaat. De uiteindelijke acrylamide-concentratie was 5%. Dit mengsel werd grondig ontgast op een vacuumleiding gedurende 3 min. Na "flapping" en polymerisatie werden de gelen direct gebruikt (na tenminste 1 uur) of opgeslagen bij 4°C gedurende niet meer dan een week.

De uitvinding wordt aan de hand van de volgende niet-limitatieve voorbeelden nader toegelicht.

Voorbeeld I

Er werden tomatezaden in microtiterplaten overgebracht (96 holtes met een volume van 380 uL, in elke holte een zaad), en de holtes werden gevuld met 80 uL 5mM NaCl oplossing (4 °C.)· De zaden werden gehomogeniseerd onder gebruikmaking van een zelfgemaakte inrichting, die aan een boormachine was bevestigd. Van de aldus verkregen homogene eiwitoplossingen werd een bepaalde hoeveelheid met een micropipet op het geloppervlak aangebracht onder gebruikmaking van een monsteropbrengstrook, die is voorzien van een aantal holtes. De opbrengstrook bevindt zich op ca. 5 mm afstand van de anode. Dan werd de isoelektrische focussering als volgt uitgevoerd.

Er werd gebruik gemaakt van een Desaga elektro-forese inrichting (DESAPHOR HE 200), die was voorzien van een gekoelde plaat van 200 x 265 x 1 mm, die was aangesloten op een Pharmacia constante stroomtoevoer ECPS 3000/150 en een Lauda RC3 koelapparaat (bij een temperatuur van 10°C). De gelen werden op de koelplaat gelegd met een paar druppels kerosine om een goed contact te waarborgen. De elektrode-stroken werden geweekt in 0,5 M glycine (anodestroken) en kathodevloeistof 10 (kathodestroken). De elektroden werden op de stroken geplaatst en daarna bedekt met een glasplaat om een goed elektrisch contact te waarborgen. Vooraf focussering werd uitgevoerd bij een opstelling van 10 W, 2000 V en 12 mA. De vooraf focussering begon bij ongeveer 240 V en 3.5 W totdat de spanning ongeveer 800 V bereikte (15 - 20 min.). Na het aanbrengen van de monsters werd de focussering voortgezet bij dezelfde opstellingen voor 3000 Vh (80 - 90 min.).

Dan werd de eiwitkleuring als volgt gerealiseerd.

Na de focussering werden de gelen geweekt in 20% TCA gedurende 5 min.; vervolgens werden de gelen gedurende 10 min. geïncubeerd in een kleuringsoplossing (0,05% Serva Blue R in ontkleuringsoplossing; Serva Blue R werd eerst opgelost in 10 mL methanol). De gelen werden ontkleurd in drie wassingen gedurende 5 min. met een ontkleuringsoplossing (10% azijnzuur; 40% methanol; 50% water; v/v/v), totdat de achtergrondkleuring volledig was verwijderd. Na spoelen met water werden de gelen aan de lucht gedroogd en bewaard.

Nomenclatuur

Een symbool voor het eiwit, dat het onderwerp van deze studie was, is gekozen in overeenstemming met de regels van de Tomato Genetic Cooperative. Het eiwit is aangeduid met drie hoofdletters en een getal: PRS-1 betekent Proteïne voor zaad (Seed)). Dit getal is gegeven aangezien genetische varianten van andere zaadeiwitten zijn gevonden (waarvan de resultaten niet zijn gepubliceerd). De variëteit Marglobe, gekozen als referentie, bevat het allel Prs-1+ (aangeduid in cursief met een hoofdletter en een kleine letter), die voor het eiwit PRS-1 (het eiwit met pi = 7.1) codeert. Andere allelen en hun gecodeerde eiwitten zullen worden genummerd: *1 de open bestoven variëteit Moneymaker heeft het allel Prs-1 , dat codeert voor het eiwit PRS-11 (het eiwit met pi = 6,1).

Resultaten

Detectie en isoelektrische focusseringsvariatie van de PRS-1 eiwitten.

Een isoelektrische focussseringsstudie van de in water oplosbare eiwitten van zaden van open bestoven tomaat-variëteiten door UTLIEF in het gebied van pH 6-9 toonde, naast vele andere banden, twee variabele eiwitbanden. Het variabele eiwit in de aangeduide variëteit Marglobe is genoemd PRS-i (zie nomenclatuur) en de andere variant, die werd gevonden in de open bestoven variëteiten Moneymaker en Napoli, is aangeduid met PRS-11.

De isoelektrische punten, te weten pi's van de beide eiwitten, werden geschat met gebruikmaking van referentie eiwitten met bekende pi onder standaard elektroforetische omstandigheden. De pi's voor PRS-1+ en PRS-11 bleken respectievelijk 7.1 en 6.1 te zijn.

De intensiteit van de PRS-1 band als resultaat van de UTLIEF analyse van het ruwe extract van één tomate-zaad was te laag voor een goede rroutinedetectie van de PRS-1+ variant. Dit was zelfs nog meer het geval voor planten die beide PRS-1 varianten bevatten. Voorts neigt het PRS-11 eiwit nabij zijn isoelektrische punt neer te slaan. Derhalve werden verscheidene mogelijkheden onderzocht om een betrouwbare detectie van het PRS-1+ eiwit te garanderen. Het gebruik van ureum en een hoge zoutconcentratie in het monster buffer resulteerde in de verschijning van talrijke eiwitten in de gel, hetgeen een ondubbelzinnige identificatie van de PRS-1 eiwitten onmogelijk maakte. Het gebruik van een monsterbuffer met een lage ionogene sterkte resulteerde in een betere oplosbaarheid van de PRS-1 eiwitten en in een verbeterde stabiliteit van de PRS-1+ variant rondom zijn pi gedurende isoelektrische focussering.

Voorbeeld II

Volgens de procedure van voorbeeld I werd de F1 hybride kwaliteit van koolgewassen bepaald, waarbij gebruik werd gemaakt van de moeder- en vaderspecifieke eiwitten met een isoelektrisch punt van respectievelijk 6,7 en 7,4 voor + 1 PRS-1 en PRS-1 . Zaden werden gemalen afhankelijk van grootte, in 80 tot 150 ya.l water. De pH gradient was 6-9. De kleuring was met zilvernitraat zoals beschreven door Merrill.

Voorbeeld III

Onder toepassing van de procedure van voorbeeld I werd de hybride kwaliteit van meloenen bepaald. Hierbij werd gebruik gemaakt van de moeder- en vaderspecifieke PRS eiwitten, die oplosbaar zijn in water, met een isoelektrisch punt van 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 7,0, 8,5, 8,6, 8,7. Voorts werd gebruik gemaakt van in 8M ureum oplosbare eiwitten met een isoelektrisch punt van 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 6,1, 6,5, 8,9, 9,0, 9,7, 9,9. Zaden werden gemalen in 1 ml vloeistof in vlakbodem micro •titerplaten (26 holtes, 3,8 ml inhoud) in .8M ureum.

Kleuring met Coomassie of zilvernitraat. Diverse pH gradiënten werden toegepast.

Voorbeeld IV

Volgens de procedure van voorbeeld I werd de hybride kwaliteit van pepers bepaald onder gebruikmaking van de moeder- en vaderspecifieke eiwitten in 8M ureum met een 4.

isoelektrisch punt van 4,0 en 5,2 respectievelijk voor PRS-1 en PRS-1^. Zaden werden gemalen in 100 yul 8M ureum. De pH gradient was 3-6. Kleuring met Coomassie.

Het zal duidelijk zijn, dat de uitvinding niet is beperkt tot de bovengenoemde voorbeelden, maar dat onder toepassing van de procedure onder voorbeeld I ook de hybride kwaliteit van andere tuinbouwgewassen, zoals aubergines, augurk, courgettes, komkommers, radijs enz. snel en betrouwbaar kan worden bepaald.

Claims (5)

1. Werkwijze voor het bepalen van de hybride kwaliteit van zaden, waarbij zaadeiwitten bij een geschikte pH-gradient door middel van isoelektrische focussering van elkaar worden gescheiden, waarna de aldus gescheiden eiwitten op gebruikelijke wijze worden gekleurd en visueel gedetecteerd, met het kenmerk, dat de hybride kwaliteit van F1 hybride zaden van tuinbouwgewassen wordt bepaald door gebruik te maken van het verschil tussen de isoelektrische punten van moeder- en vaderspecifieke zaadeiwitten.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de hybride kwaliteit van tomaten wordt bepaald, waarbij het isoelektrische punt van moeder- en vaderspecifieke eiwitten 7,1 en 6,1 is voor respectievelijk PRS-1+ en PRS-1.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de hybride kwaliteit van koolgewassen wordt bepaald, waarbij de moeder- en vaderspecifieke eiwitten wateroplosbare PRS-1 eiwitten zijn met een isoelektrisch punt van 6,4 en 7,4 respectievelijk voor PRS-1+ en PRS-11.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de hybride kwaliteit van meloenen wordt bepaald, waarbij de moeder- en vaderspecifieke PRS eiwitten wateroplosbare eiwitten zijn met een isoelektrisch punt van 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 7,0, 8,5, 8,6, 8,7 en eiwitten oplosbaar in 8M ureum met een isoelektrischpunt van 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 6,1, 6,5, 8,9, 9,0, 9,7, 9,9.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de hybride kwaliteit van pepers wordt bepaald, waarbij de moeder- en vaderspecifieke eiwitten in 8M ureum oplosbare PRS-1 eiwitten zijn met een isoelektrisch + 1 punt van 4,0 en 5,2 respectievelijk voor PRS-1 en PRS-1 .