CN112175059A - 一种能够在籽粒发育早期进行小麦种子纯度鉴定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能够在籽粒发育早期进行小麦种子纯度鉴定的方法，包括如下实施步骤：醇溶蛋白的提取：调整传统的小麦醇溶蛋白提取试剂的主要成分，明确小麦籽粒授粉后蛋白积累规律，实现早期小麦籽粒醇溶蛋白的大量快速提取；B.醇溶蛋白多态性检测：通过凝胶的配置、添加特定剂量的loading buffer、改变电泳液浓度，得到稳定性和分辨率均提高的醇溶蛋白条带。本发明的方法解决小麦种子纯度鉴定在种子收获后的难题，建立了一套适用于小麦收获前的纯度鉴定方法，为开展小麦种子的纯度鉴定、品种管理以及大面积推广研究提供了有力的技术支持。

Description

一种能够在籽粒发育早期进行小麦种子纯度鉴定的方法
技术领域
本发明涉及植物检测技术领域，尤其是一种植物籽粒发育早期醇溶蛋白提取和检测技术。
背景技术
与本发明相关和接近的参考文献包括：
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小麦是全球最重要的粮食作物，养活了世界上40％的人口，提供全球20％的人类营养所需的热能和蛋白质[1,2]。小麦是我国第二大口粮作物，我国是世界上最大的小麦生产国，也是最大的消费国，小麦生产在保障国家粮食安全和全面食品消费中具有举足轻重的地位[3]。
随着科学技术的发展，小麦遗传育种研究取得了丰硕的成果，向着优质、抗病、高产、广适的方向前进，同时根据新修订的《主要农作物品种审定办法》的相关规定，在充分利用现有国家和省级品种比较试验资源的基础上，积极利用社会品种比较试验资源，扩大试验容量，主要包括：育繁推一体化种子企业自主研发品种自行开展的绿色通道试验；企业联合体、科企联合体和科研单位联合体自行开展自由品种的小麦联合体试验；国家小麦良种联合攻关广适性品种试验。这些措施，逐步推进了商业化育种进程的发展[4,5]。育成品种之多，推广面积增大，使得种子公司在良种繁育、推广中必须进一步重视种子纯度的问题，确保种子质量，保证“种植安全”从而保证“粮食安全”，因此种子生产企业需要一套快速、准确种子纯度检验技术。
目前，农作物种子纯度检验方法为国标GB/T 3543.5-1995，主要包括(1)外观鉴定；(2)生理生化鉴定。随着分子时代的到来也出现了DNA水平上的“分子鉴定”。
种子外观鉴定主要根据种子形状、大小、色泽、质地、表面的光与毛以及种子外表各部位的特征来加以鉴别，以区分本品种与异品种[6]。该法简单、经济、快速，但准确性较差，且不同品种间种子外观形态的差异越来越小，因此靠区别种子形态上的差异来鉴定种子纯度可靠性较低。种苗形态检验法该法根据不同品种幼苗的独特性状进行检验，如幼苗芽鞘颜色、幼苗生长锥、于叶的形状、颜色、大小等[7-10]。该法简便、省时，但受环境的影响颇大，检验结果不够可靠。目前在“国标中”推行的田间小区种植检验法(成株期形态检验法)将一定量的作物种子在田间种植一个小区，单粒播种，不间苗，不定苗，并设有标准品种小区作对照，成株期依据其主要特征鉴定纯度，这是最为通用的且比较可靠的方法。但此法所需时间较长，当年所生产的种子要等下一个生长季节或异地鉴定才能得到结果，往往丧失商机，且费工占地。而且这种方法受环境影响颇大，使得鉴定结果的准确性受到一定程度的影响。
品种间形态和生化上的区别归根到底是基因(DNA)上的区别[11,12]。DNA分子标记技术即是通过对品种DNA的多态性，即DNA碱基序列的差异进行分析，从而鉴别不同品种。其检测对象是种子的DNA片段(基因)，没有器官的特异性，不受环境的影响，有较高的准确性、稳定性和重复性。目前，在作物品种鉴定中应用的有RFLP技术、RAPD技术、微卫星技术和AFLP技术等[13-17]。该技术灵敏度高、快速、多态性强、DNA的用量少、具较好的重复性。但是存在需要育苗提取DNA进行PCR检测及电泳等过程，同时需要进行数以千计的检测引物，且引物需要在染色体上平均分布，工作量较大，所以该法不宜大面积普及推广。同时DNA序列上一致，并不能代表氨基酸表达一致。例如，DNA的甲基化程度及组蛋白的修饰等表观遗传学层面的修饰都会造成蛋白的差异，最终导致表型不一致，而导致种子纯度鉴定出现偏差，此外，DNA鉴定的植株，而种子为下世代的产物，DNA只能鉴定上一世代纯度，无法鉴定是否存在串粉等混杂问题。
蛋白质电泳技术检验法是指利用电泳技术对备检样品的种子或幼苗的蛋白质进行分离、染色，形成蛋白质电泳谱带的差异，并与标准品种相比较，从而鉴定品种的真实性和纯度的一种方法[18,19]。不同作物品种，基因不同，基因的直接表达产物—蛋白质在种类、数量、结构等方面亦不同。该法即是利用蛋白质的多态性来反映不同品种DNA组成上的差异，从而进行品种鉴定。该法快速、可靠，不受环境影响。GB/T3543.5-1995检测规程中建议麦类作物采用醇溶蛋白进行种子纯度鉴定，但是规程中提供的操作方法提取负责，且带谱清晰度较差，电泳过程繁琐，因此使利用小麦醇溶蛋白鉴定种子纯度的方法受到了限制。
根据谷物籽粒蛋白的溶解性分类标准，将小麦籽粒蛋白分为溶于水的清蛋白(Albumin)、溶于NaCl的球蛋白(Globulin)、溶与醇类物质的醇溶蛋白(Gliadin)和溶与酸或者碱溶液的谷蛋白(Glutenin)四大类[20,21]。其中，清蛋白和球蛋白为非储藏蛋白，主要为细胞质中的酶类。谷蛋白和醇溶蛋白为储藏类蛋白，决定了小麦的加工品质。
醇溶蛋白(Gliadin)占小麦籽粒蛋白的40％左右[22,23]，与麦谷蛋白共同形成面筋，醇溶蛋白(Gliadin)作为面筋的主要总分之一，决定了面筋的粘性和延展性[24,25]。不同于麦谷蛋白，Gliadin为单体蛋白，分子量介于20KDa到100KDa之间，没有分子间二硫键，依托分子内二硫键、氢键及疏水作用力形成球状结构[26]。
醇溶蛋白在多种作物的籽粒中均有表达，同时其具有品种间多态性，被称为植物的“指纹”。在麦类作物中，醇溶蛋白的积累几乎不受环境因素的影响，而且具有品种间异质性，因此可通过醇溶蛋白的多态性进行品种的纯度鉴定。1986年国际种子检验协会(ISTA)颁布了用于小麦、大麦品种鉴定的酸性聚丙烯酞胺凝胶电泳(A-PAGE)标准程序，用于检测作物的纯度及亲缘关系。由于A-PAGE设备及试剂限制，很难得到清晰的理想带谱，因而限制了醇溶蛋白的研究进展。随着科技的进步，多个实验室陆续改良了A-PAGE流程，从而适用于各自的实验目的，促进了对醇溶蛋白的应用[27-30]。研究表明，不同水稻品种的谷蛋白和醇溶蛋白在不同品种间存在总量、各个组分的含量的多态性，可以为群体结构划分和纯度鉴定提供可靠数据支撑[31,32]。同时，谷子醇溶蛋白的研究也表明，不同材料间，谷子醇溶蛋白的多态性明显，说明醇溶蛋白也可作为谷子不同品种的“指纹”[33-35]。醇溶蛋白在小麦不同品种、材料中具有广泛的等位变异，影响醇溶蛋白的积累的的QTL位点分布于1B、2A、2B、2D、3A、3B、4A、5A、6A、6B、7A、7B上[36]，换言之，影响和参与小麦醇溶蛋白积累的基因在染色体上均有分布，这也是小麦醇溶蛋白可作物“小麦指纹”的重要原因之一。
目前，小麦醇溶鉴定主要在田间收获后，进行检。对于种子企业而言，如果收获的种子，经过醇溶鉴定，纯度达不到制种要求，需要作为商品粮处理，从而增加了种子企业在收获、晾晒环节的成本。因此，急需建立有效、实用的小麦籽粒发育早期、单粒醇溶蛋白多态性检测技术，从而实现小麦收获前种子纯度鉴定体系。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够在籽粒发育早期进行小麦种子纯度鉴定的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
一种能够在籽粒发育早期进行小麦种子纯度鉴定的方法，包括如下步骤：
A.醇溶蛋白的提取：调整传统的小麦醇溶蛋白提取试剂的主要成分，并采用特定的摇床处理工艺，实现早期小麦籽粒醇溶蛋白的大量快速提取；
B.醇溶蛋白多态性检测：通过凝胶的配置、添加特定剂量的loading buffer、改变胶浓度，得到稳定性和分辨率均提高的醇溶蛋白条带。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，所述小麦醇溶蛋白提取试剂包括小麦醇溶蛋白提取buffer、A-PAGE loading buffer。
作为本发明的一种优选技术方案，所述小麦醇溶蛋白提取buffer的配方见下表：
Figure BDA0002718071760000041
作为本发明的一种优选技术方案，所述A-PAGE loading buffer的配方见下表：
Figure BDA0002718071760000042
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，所述摇床处理工艺是指：将待提取样品中加入小麦醇溶蛋白提取液中，密闭摇床震荡提取1-2h。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，所述凝胶的配方及加入顺序见如a表，凝胶buffer配方见b表：
a凝胶配方；100ml，2板胶
Figure BDA0002718071760000051
1L凝胶buffer配方
Figure BDA0002718071760000052
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A的实施步骤包括：
A-3.样品的准备：将目的种子砸成粉末状，将粉末放置于2.0ml离心管中；
A-4.提取液的配制：按照下表配制醇溶蛋白提取液：
小麦醇溶蛋白提取buffer配方
Figure BDA0002718071760000053
A-5.醇溶蛋白的提取：
A-5-1.将A-3制备的每个样品中加入A-4制备的蛋白提取液200μl，盖好盖子，摇床震荡提取1.5h；
A-5-2.按照下表配置A-PAGE loading buffer，并在A-5-1完成提取的离心管中加入300μl A-PAGE loading buffer，将离心管放入离心机，严格配平，12000rpm，离心5min，即得醇溶蛋白；
A-PAGE loading buffer配方
Figure BDA0002718071760000054
Figure BDA0002718071760000061
作为本发明的一种优选技术方案，步骤B的实施步骤包括：
B-1.将电泳用的耳板和大板仔细清洗干净；
B-2.步骤B-1胶板清洗干净后，配制凝胶，配方及加入顺序见下表；配置前将烧杯、量筒洗刷干净，并配制好FeSO4工作液，FeSO4 0.04g+1ml ddH2O；
凝胶配方；100ml，2板胶
Figure BDA0002718071760000062
1L凝胶buffer配方
Figure BDA0002718071760000063
B-3.取B-1清洗的玻璃板，将玻璃板耳板与大阪拼合，耳板朝外，安装到做胶架上，并用长尾夹固定到做胶架上，双面安装好后，放到封底架上，封底；
B-4.检查梳子是否干净，确保梳齿上无胶粒，并用毛巾擦干，确保无杂物；
B-5.配制H2O2工作液：将30％的H2O2储存液剧烈晃动混匀，吸取出100μl加入三角瓶中，并加入1ml ddH2O，混匀；
B-6.将步骤B-2中配置好的凝胶buffer用玻璃棒再次搅动、混匀，检查药品是否充分溶解，混匀后分装到2个干净的100ml的烧杯中；
B-7.用移液枪上下吸吹混匀B-5配制的H2O2工作液，然后吸出100μl H2O2工作液，加入到步骤B-6准备的烧杯中，轻轻晃动混匀，迅速倒入步骤B-3安装好的玻璃板中，倒满后插入步骤B-4中准备好的梳子；
B-8.配制1X电极buffer：用量筒取50ml 20X A-PAGE电极buffer，配方见下表，加入量杯中，并在量杯中加入950ml ddH2O，置于磁力搅拌器上混匀；
1L 20X电buffer/电极缓冲液配方
Figure BDA0002718071760000071
B-9.步骤B-7的胶体凝固后，拔下梳子，打开封底架，拆下长尾夹，耳板朝内，将玻璃板安装到电泳仪上，四个角的螺丝均匀上紧，然后将安装好的电泳仪放置到电泳槽内；
B-10.将该步骤B-8配制的1X电极buffer倒入步骤B-9准备的电泳槽中；
B-11.从左到右依次上样4μl，加样后，接上电极；在500v电压下，电泳1h 30min；
B-12.步骤B-11完成电泳后，卸下玻璃板；小心剥离步骤耳板，将带胶大板，放入白瓷盘中，记好顺序，倒入考马斯亮蓝染液，配方见下表，染色；
考马斯亮蓝R-250染色液配方
Figure BDA0002718071760000072
B-13.步骤B-12染色结束后，将胶板放置的新的盒子中，小心加入清水，10-30min后换水，随时观察，及时拍照；
B-13.依据带谱结果进行品种纯度统计。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，所述小麦籽粒醇溶蛋白采用能够提取到小麦清晰醇溶蛋白带谱的最早时期。
作为本发明的一种优选技术方案，所述最早时期为授粉第20天。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
总体来看，本发明的方法通过明确小麦籽粒醇溶蛋白不同发育天数表达量，确定可以提取、鉴定蛋白图谱的籽粒发育时期，解决小麦种子纯度鉴定在种子收获后的难题；根据小麦醇溶蛋白亚基多的特点，通过改变有机溶剂，用对醇溶蛋白提取率高的“N,N-二甲基甲酰胺”替代“2-氯乙醇”，解决用“2-氯乙醇”为有机溶剂时，醇溶蛋白溶解度偏低、条带不整齐、难以观察的难题，也解决“2-氯乙醇”为提取剂时，易燃、易爆、剧毒带来的安全问题；通过调整loading buffer用量，凝聚醇溶蛋白，防止飘样，解决醇溶蛋白带谱弥散问题。该方法在选取有代表的小麦品种，跟踪不同天数醇溶蛋白表达情况，明确醇溶蛋白带谱信息，明确籽粒发育过程中，可以提取到清晰醇溶蛋白带谱的最早时期，实现小麦种子收获前醇溶鉴定；获取醇溶蛋白后，通过加适宜剂量的loading buffer，保证样品全部、致密加入点样孔，降低点样难度；通过调整胶浓度，增加条带稳定性，提升带谱清晰度，以保证小麦醇溶蛋白普带尽量多而清晰的显现出来，充分反映供试材料的醇溶蛋白多态性。
具体来看，①本发明根据小麦籽粒醇溶蛋白积累随着授粉天数逐渐增加的特点，跟踪不同授粉天数的醇溶蛋白表达量，明确可以检测到清晰、完成醇溶蛋带谱的最早发育时期，最大限度的提早小麦种子纯度鉴定是时间，实现收获前种子醇溶鉴定。②本发明根据小麦醇溶蛋白带谱多的特点，使用”机溶剂”替代“2-氯乙醇”，解决用“2-氯乙醇”为有机溶剂时，有毒、有害危险，提升用小麦醇溶蛋白鉴定种子纯度的安全性。③本发明根据小麦醇溶蛋白亚基多的特点，在获取醇溶蛋白后，通过加适宜剂量的loading buffer，压紧上样样品，解决常规loading buffer使用量下，样品弥散，带谱层次性查的难题。④参见下文的实施例，申请人项目组已利用本发明的方法成功的检测到田间未成熟，授粉后20天的“津强11号”品种纯度，并以此为依据，准确的在收获前鉴定出了“津强11号”的纯度，并确定该地块生产的“津强11号”是否可以作为种子，为小麦提早纯度检测、品种管理及示范推广等相关研究奠定了坚实的基础。
综上所述，本发明的方法建立了一套适用于小麦收获前的纯度鉴定方法，为开展小麦种子的纯度鉴定、品种管理以及大面积推广研究提供了有力的技术支持。
附图说明
图1为春麦品种标准图谱。
图2为实施例3中“津强11号”不同授粉天数醇溶蛋白表达图谱。
图3为实施例3中“津强11号”种子的鉴定图。
图4为实验员混入杂株鉴定情况图。
图5为种子纯度分析图。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
在以下实施例的描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定系统结构、技术之类的具体细节，以便透彻理解本申请实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本申请。在其它情况中，省略对众所周知的系统、装置、电路以及方法的详细说明，以免不必要的细节妨碍本申请的描述。
应当理解，当在本申请说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
还应当理解，在本申请说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
如在本申请说明书和所附权利要求书中所使用的那样，术语“如果”可以依据上下文被解释为“当...时”或“一旦”或“响应于确定”或“响应于检测到”。类似地，短语“如果确定”或“如果检测到[所描述条件或事件]”可以依据上下文被解释为意指“一旦确定”或“响应于确定”或“一旦检测到[所描述条件或事件]”或“响应于检测到[所描述条件或事件]”。
另外，在本申请说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。
实施例1、市售原料来源
蔗糖购自：生工生物工程(上海)股份有限公司；丙三醇购自：shanghai aiaddinbiochemical technology；甲基绿购自：北京酷来博科技有限公司；尿素购自：生工生物工程(上海)股份有限公司；40％Acr：Bis购自：北京酷来博科技有限公司；FeSO4购自：生工生物工程(上海)股份有限公司；抗抗坏血酸购自：生工生物工程(上海)股份有限公司；考马斯亮蓝R-250染色液购自：北京酷来博科技有限公司；甘氨酸购自：北京酷来博科技有限公司；离心机：eppendorf 5810R；电源：北京六一生物科技有限公司DYY-12D型，电泳槽：北京君意东方电泳设备有限公司JY-SCZ8型。
实施例2、自配试剂
本发明各实施例所用凝胶、溶液及缓冲液的配方如下表所示。
表1：小麦醇溶蛋白提取buffer配方
Figure BDA0002718071760000091
表2：A-PAGE loading buffer配方
Figure BDA0002718071760000092
表3：凝胶配方(100ml，2板胶)
Figure BDA0002718071760000101
表4：1L凝胶buffer配方
Figure BDA0002718071760000102
表5：1L20X电极buffer(电极缓冲液)配方
Figure BDA0002718071760000103
表6：考马斯亮蓝R-250染色液配方
Figure BDA0002718071760000104
实施例3、小麦“津强11号”收获前20天纯度鉴定
1.样本准备
小麦育种基地，随机选取来自不同小麦株的185个穗子，置于烘箱，60℃烘干，脱粒，每穗检测1粒种子。由实验人员随机插入25粒不同小麦品种的籽粒(包含“津强11号”)，由第二检测员进行醇溶蛋白提取及检测与杂株分析，分析后与实验人员进行数据整合，剔除混入杂株，鉴定种子纯度，以确保实验准确性。
2.醇溶蛋白提取
(1)样品的准备：每粒种子分别装入1个内壁光滑的小纸袋中；用锤子将种子砸成粉末状，将粉末放置于2.0ml离心管中。
(2)配制醇溶蛋白提取液。
(3)向每个装有小麦籽粒粉末样品的离心管中，加入蛋白提取液200μl，盖好盖子，放入摇床，提取1.5h。
(4)取出步骤(3)中的离心管，加入300ul A-PAGE loading buffer放入离心机，严格配平，12000rpm，离心5min。即为提取到的醇溶蛋白。
2.醇溶蛋白多态性检测
(1)将电泳用的耳板和大板仔细清洗干净。
(2)配制凝胶，并配制好FeSO4工作液(FeSO4 0.04g+1ml ddH2O)。
(3)将步骤(1)的玻璃板耳板与大阪拼合，耳板朝外，安装到做胶架上，并用长尾夹固定到做胶架上，双面安装好后，放到封底架上，封底。
(4)检查梳子是否干净，确保梳齿上无胶粒，并用毛巾擦干，确保无杂物。
(5)配制H2O2工作液：将30％的H2O2储存液剧烈晃动混匀，吸取出100μl加入三角瓶中，并加入1ml ddH2O，混匀
(6)配置凝胶buffer搅动、混匀，检查药品是否充分溶解，混匀后分装到2个干净的100ml的烧杯中。
(7)用移液枪上下吸吹混匀步骤(5)配制的H2O2工作液，然后吸出100μl H2O2工作液，加入到步骤(6)准备的烧杯中，轻轻晃动混匀，迅速倒入步骤步骤(3)安装好的玻璃板中，倒满后插入步骤步骤(4)中准备好的梳子。
(8)配制1X电极buffer：用量筒取50ml 20X A-PAGE电极buffer，加入量杯中，并在量杯中加入950ml ddH2O，置于磁力搅拌器上混匀。
(9)步骤(7)的胶体凝固后，拔下梳子，打开封底架，拆下长尾夹，耳板朝内，将玻璃板安装到电泳仪上，四个角的螺丝均匀上紧，然后将安装好的电泳仪放置到电泳槽内。
(10)将该步骤(8)配制的1X电极buffer倒入步骤B-9准备的电泳槽中。
(11)从左到右依次上样4μl，加样后，接上电极。在500v电压下，电泳1h 30min。
(12)步骤(11)完成电泳后，卸下玻璃板。小心剥离步骤耳板，将带胶大板，放入白瓷盘中，记好顺序，倒入考马斯亮蓝染液，染色。
(12)步骤(12)染色结束后，将胶板放置的新的盒子中，小心加入清水，10-30min后换水，随时观察，及时拍照。
以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种能够在籽粒发育早期进行小麦种子纯度鉴定的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
A.醇溶蛋白的提取：调整传统的小麦醇溶蛋白提取试剂的主要成分，明确小麦籽粒授粉后蛋白积累规律，实现早期小麦籽粒醇溶蛋白的大量快速提取；
B.醇溶蛋白多态性检测：通过凝胶的配置、添加特定剂量的loading buffer、改变电泳液浓度，得到稳定性和分辨率均提高的醇溶蛋白条带。
2.根据权利要求1所述的一种能够在籽粒发育早期进行小麦种子纯度鉴定的方法，其特征在于：步骤A中，所述小麦醇溶蛋白提取试剂包括小麦醇溶蛋白提取buffer、A-PAGEloading buffer。
3.根据权利要求2所述的一种能够在籽粒发育早期进行小麦种子纯度鉴定的方法，其特征在于：所述小麦醇溶蛋白提取buffer的配方见下表：
Figure FDA0002718071750000011
4.根据权利要求2所述的一种能够在籽粒发育早期进行小麦种子纯度鉴定的方法，其特征在于：所述A-PAGE loading buffer的配方见下表：
Figure FDA0002718071750000012
5.根据权利要求1所述的一种能够在籽粒发育早期进行小麦种子纯度鉴定的方法，其特征在于：步骤A中，所述摇床处理工艺是指：将待提取样品中加入小麦醇溶蛋白提取液中，密闭摇床震荡提取1-2h。
6.根据权利要求1所述的一种能够在籽粒发育早期进行小麦种子纯度鉴定的方法，其特征在于：步骤B中，所述凝胶的配方及加入顺序见如a表，凝胶buffer配方见b表：
a凝胶配方；100ml，2板胶
Figure FDA0002718071750000013
1L凝胶buffer配方
Figure FDA0002718071750000021
7.根据权利要求1所述的一种能够在籽粒发育早期进行小麦种子纯度鉴定的方法，其特征在于：步骤A的实施步骤包括：
A-3.样品的准备：将目的种子砸成粉末状，将粉末放置于2.0ml离心管中；
A-4.提取液的配制：按照下表配制醇溶蛋白提取液：
小麦醇溶蛋白提取buffer配方
Figure FDA0002718071750000022
A-5.醇溶蛋白的提取：
A-5-1.将A-3制备的每个样品中加入A-4制备的蛋白提取液200μl，盖好盖子，摇床震荡提取1.5h；
A-5-2.按照下表配置A-PAGE loading buffer，并在A-5-1完成提取的离心管中加入300μl A-PAGE loading buffer，将离心管放入离心机，严格配平，12000rpm，离心5min，即得醇溶蛋白；
A-PAGE loading buffer配方
Figure FDA0002718071750000023
8.根据权利要求1所述的一种能够在籽粒发育早期进行小麦种子纯度鉴定的方法，其特征在于：步骤B的实施步骤包括：
B-1.将电泳用的耳板和大板仔细清洗干净；
B-2.步骤B-1胶板清洗干净后，配制凝胶，配方及加入顺序见下表；配置前将烧杯、量筒洗刷干净，并配制好FeSO4工作液，FeSO40.04 g+1ml ddH2O；
凝胶配方；100ml，2板胶
Figure FDA0002718071750000024
Figure FDA0002718071750000031
1L凝胶buffer配方
Figure FDA0002718071750000032
B-3.取B-1清洗的玻璃板，将玻璃板耳板与大阪拼合，耳板朝外，安装到做胶架上，并用长尾夹固定到做胶架上，双面安装好后，放到封底架上，封底；
B-4.检查梳子是否干净，确保梳齿上无胶粒，并用毛巾擦干，确保无杂物；
B-5.配制H2O2工作液：将30％的H2O2储存液剧烈晃动混匀，吸取出100μl加入三角瓶中，并加入1ml ddH2O，混匀；
B-6.将步骤B-2中配置好的凝胶buffer用玻璃棒再次搅动、混匀，检查药品是否充分溶解，混匀后分装到2个干净的100ml的烧杯中；
B-7.用移液枪上下吸吹混匀B-5配制的H2O2工作液，然后吸出100μl H2O2工作液，加入到步骤B-6准备的烧杯中，轻轻晃动混匀，迅速倒入步骤B-3安装好的玻璃板中，倒满后插入步骤B-4中准备好的梳子；
B-8.配制1X电极buffer：用量筒取50ml 20X A-PAGE电极buffer，配方见下表，加入量杯中，并在量杯中加入950ml ddH2O，置于磁力搅拌器上混匀；
1L 20X电buffer/电极缓冲液配方
Figure FDA0002718071750000033
B-9.步骤B-7的胶体凝固后，拔下梳子，打开封底架，拆下长尾夹，耳板朝内，将玻璃板安装到电泳仪上，四个角的螺丝均匀上紧，然后将安装好的电泳仪放置到电泳槽内；
B-10.将该步骤B-8配制的1X电极buffer倒入步骤B-9准备的电泳槽中；
B-11.从左到右依次上样4μl，加样后，接上电极；在500v电压下，电泳1h 30min；
B-12.步骤B-11完成电泳后，卸下玻璃板；小心剥离步骤耳板，将带胶大板，放入白瓷盘中，记好顺序，倒入考马斯亮蓝染液，配方见下表，染色；
考马斯亮蓝R-250染色液配方
Figure FDA0002718071750000041
B-13.步骤B-12染色结束后，将胶板放置的新的盒子中，小心加入清水，10-30min后换水，随时观察，及时拍照；
B-13.依据带谱结果进行品种纯度统计。
9.根据权利要求1所述的一种能够在籽粒发育早期进行小麦种子纯度鉴定的方法，其特征在于：步骤A中，所述小麦籽粒醇溶蛋白采用能够提取到小麦清晰醇溶蛋白带谱的最早时期。
10.根据权利要求9所述的一种能够在籽粒发育早期进行小麦种子纯度鉴定的方法，其特征在于：所述最早时期为为授粉第20天。
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