CN104990969A - 一种小麦种子纯度鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦纯度的鉴定方法，为对现有技术的改进。本发明(1)样品提取液由无毒无害的乙醇替代剧毒的α-氯乙醇，有效的降低了对人体的毒害及环境的污染；（2）通过对丙稀酰胺浓度和交联度进行了适当调整，不仅可以使胶片坚韧有弹性而且也能更好的发挥分子筛的作用；（3）改进后可一次性灌制好凝胶，节省了步骤。本发明具有工艺流程简洁、操作简单、耗时短、环保等特点。同时，由于增加了胶片的清洗和保存创新技术，经过清洗后的胶片背景清晰，置于保存液湿润后用保鲜膜密封，可长期保存，便于后续的鉴定及研究。

Description

一种小麦种子纯度鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种小麦种子纯度鉴定的改进方法，具体应用于小麦种子纯度快速鉴定及种质资源鉴定领域。

背景技术

小麦是我国用种量最多的作物，种子纯度是体现种子质量的重要指标之一，是种子分级和评定种子质量优良程度的根本依据。种子纯度检验生产上能防止种子混杂退化，提高种子品质，使良种种性得到保持，并能不断提高农作物产量。

    种子品种纯度的鉴定技术依据检测的手段可以分为四类：形态学标记、物理化学特性鉴定、生理生化鉴定、分子生物学鉴定等。小麦种子纯度鉴定技术是当前我国种子检验工作的重点和难点之一，也是种子管理工作中迫切需要解决的问题。聚丙烯酰胺电泳法作为生理生化鉴定技术用于小麦种子纯度鉴定已列入《农作物种子检验规程GB/T 3543.5-1995》中，并广泛应用于生产实践中。由于该鉴定技术快速、准确、稳定、可靠，是目前常用的小麦室内种子纯度检验方法之一，可有效地预控生产中伪劣种子流入市场，防止坑农害农现象发生。但该方法中存也在以下问题：药品浓度配比不够精准，实验程序繁琐，导致该技术程序可操性不强，制成的电泳介质凝胶韧性有余而强度不足，个别药品毒性大且难以采购，大大影响了检测的效率和成功率。

专利号为CN201310325497名称为“一种玉米种子纯度鉴定方法”的发明专利所述的方法不能用于鉴定小麦纯度，玉米种子所鉴定的是盐溶蛋白，在玉米品种间具有特异性，而在小麦品种间没有差异，因而不能用于鉴定小麦的纯度。小麦纯度鉴定方法鉴定的是小麦中醇溶蛋白成分，在小麦品种具有特有的遗传性、稳定性和差异性，能正确区分小麦品种之间的差异，故鉴定玉米种子纯度的方法不能用于小麦品种的鉴定。

发明内容：

为克服现有电泳技术的不足，本发明在试剂配制、样品提取、凝胶制备、电泳、染色、胶片的处理与保存等过程做了大量技术改进及创新，具有工艺流程简洁、耗时短、可操作性强等特点。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种小麦种子纯度鉴定方法，该方法步骤如下：

1)      溶液配制

a.       样品提取液

称取甲基绿0.05g，溶于100 mL 70%(wt)乙醇中，4℃保存；

b.      凝胶溶液

称取丙烯酸胺150.0g，N，N’一亚甲基双丙烯酰胺15.0g，尿素60.0g，抗坏血酸1.0g，甘氨酸1.0g，硫酸亚铁0.05g，加水溶解后，加入20 mL冰乙酸，定容至1000mL，在4℃条件下保存；

c.       0.6%(wt)过氧化氢溶液

取30%(wt)的过氧化氢2mL，加水定容至100 mL，在4℃条件下保存；

d.      染色液

称取考马斯亮蓝（R250）0.25g，加25mL无水乙醇溶解，加入50g三氯乙酸，加水至500 mL，混匀；

e.       凝胶胶片清洗液

称取碳酸钠6.0g，十二烷基苯磺酸2.0g，羧甲基纤维素（CMC）0.6g，三聚磷酸钠1.0g，40 %(wt)的硅酸钠溶液0.4g，用水溶解，定容至500mL备用；

2）样品提取

取粉碎后的小麦种子，放入1.5mL离心管中（小麦粉与样品提取液的比例），用移液管加入样品提取液200μL，在30℃恒温箱中静置提取30分钟，取上清液；

3）凝胶制备

将预先洗净晾干的玻璃板装人胶框中，插好梳子，平放在桌面上，取适量分离胶溶液于烧杯中，用微量进样器按凝胶液∶0.6%(wt)过氧化氢溶液为500:1（v/v）的比例加过氧化氢溶液，迅速摇匀，沿长玻璃板边缘底部倒入，静置；

4）点样

凝胶聚合后，拔出样品梳并将样品槽清理干净，用微量进样器在样品槽中加入的步骤2）中获得的样品上清液15μL，每点一粒后，都要用去离子水清洗进样器3次；

 5）电泳

加样完毕后，倒入电极缓冲液，上槽电极缓冲液面要高于短玻璃板，下槽电极缓冲液面要高于铂金丝，将电源线正极接中槽，负极接两侧槽，接通电源，采用350V稳压进行电泳，1小时后，关闭电源；

6）卸板

倒出电极液，从电泳槽内取出胶室，卸下胶条，启开玻璃板，取出胶片，浸入染色液中；

7）凝胶染色与清洗凝胶胶片

在35℃恒温条件下胶片置于染色液中染色60分钟，将胶片取出置于凝胶胶片清洗液中，并振荡3分钟，清洗完毕。

    本发明还具有以下附加步骤：

优选的，还包括凝胶胶片的保存方法，其步骤为：

a.       配置凝胶胶片保存液，取甘油300mL，用水稀释定容至1000mL备用；

b.      将清洗后的凝胶胶片置于步骤a制得的凝胶胶片保存液中湿润5分钟；

c.       凝胶胶片浸润期间把保鲜膜摊平于平整桌面，取浸润的胶片置于保鲜膜上，排除气泡后将胶片密封，编号。

    优选的，还包括电极缓冲液的配置方法，该方法为称取甘氨酸0.4g，加水溶解，加入4 mL冰乙酸，再加蒸馏水定容至1000mL，混匀。

    优选的，所述水为蒸馏水或去离子水。

 优选的，步骤2）中所述的小麦种子粉碎为用单籽粒粉碎机粉碎。

 优选的，步骤2）中所述粉碎后的小麦种子粒度为10-25μm。

 优选的，步骤7）中所述震荡的频率为0-100r/min。

本发明的创新点：

(1)样品的提取剂由无毒无害的乙醇替代剧毒的α-氯乙醇，有效的降低了对人体的毒害及环境的污染。

(2)凝胶染色后胶片的清洗：凝胶胶片清洗液的配置为：取碳酸钠6.0g，十二烷基苯磺酸2.0g，羧甲基纤维素（CMC）0.6g，三聚磷酸钠1.0g，40wt %的硅酸钠溶液0.4g，用水溶解，定容至500mL备用。清洗胶片时用毛刷蘸取少量清洗液轻轻清洗胶片正反面，去除残留的染色液及其他杂质。

(3)胶片的保存：所述凝胶片保存液配置为：取甘油300mL，用水稀释定容至1000mL备用。把保鲜膜摊平于平整桌面，将染色、清洗后的电泳胶片置于凝胶片保存液中湿润5分钟，取浸润的胶片置于保鲜膜上，排除气泡后将胶片密封。

    本发明相对现有技术的方法改进：

(1)试剂浓度的改变：

根据《1996国际种子检验规程》和《GB/T3543-1995农作物种子检验规程》中小麦种子纯度检测方法所述，凝胶液的浓度均为10%(wt)、交联度为3.8%，以此浓度制作的凝胶片韧性有余而强度不足，造成了剥离胶片的困难，同时在该浓度下样品易扩散从而影响了分辨率。通过对丙稀酰胺浓度和交联度进行了适当调整，试验发现，凝胶浓度为15.5 %(wt)及交联度为3.2%时，具有较好的效果，不仅可以使胶片坚韧有弹性而且也能更好的发挥分子筛的作用。

(2)凝胶液制备方法的改进：

在原标准方法中凝胶液及凝胶缓冲液中多种成分分别配制后，然后再混合。改进后，可将所用的几种试剂称量后直接混合，制胶时直接加入过氧化氢即可，简化了凝胶液配制的步骤，降低了实验误差。

(3)凝胶制备：

原方法制备凝胶，需要先用凝胶液封底，聚合后再加入分离胶，整个过程需要两步。经改进后可一次性灌制好凝胶，节省了步骤。

(4)电压调整：

在原方法中，电泳时电压为恒压500V，15-20℃温度下电泳，然而由于电压偏高，电泳速度较快，很容易产生较多的热量，造成胶片粘板，不易剥离。通过试验，我们将电压降为350V，待指示剂移至前沿的时间2倍时（约为1h左右），停止电泳，这样不会因高电压产生热量而影响胶片剥离，为下一步的染色及观察创造了有利条件。

(5)样品提取和胶片染色时间的调整：

传统的电泳技术样品提取在室温下，提取时间为4小时，离心，取上清液用于电泳。改进后，在30℃恒温箱提取时间只需30分钟，然后直接取上清液用于电泳；原电泳技术胶片染色需要1-2天，改进后在35℃恒温箱内染色60分钟即可达到相同效果，本技术改进大大缩短鉴定时间，提高了鉴定效率。

(6)量化操作：

小麦种子籽粒虽然较小，但籽粒间大小差异不大，在加提取液时，每管可根据需要定量加入提取液，这样可以简化操作手续，节约时间。在制备凝胶时过氧化氢的加入量由原来方法中的加入几滴定量为以1ml凝胶液∶2μl过氧化氢(0.6%)的比例加入，使凝胶在5分钟左右聚合，因而更具有可操作性。

本发明的有益效果：本发明在溶液配制、凝胶制备、染色及胶片的清洗及保存等过程做了大量技术改进及创新，具有工艺流程简洁、操作简单、耗时短、环保等特点。原方法的电泳技术整个流程需要2-3天，经过改进后的鉴定技术只需约3个小时就能完成整个流程，大大提高了效率。同时，由于增加了胶片的清洗和保存创新技术，经过清洗后的胶片背景清晰，置于保存液湿润后用保鲜膜密封，可长期保存，便于后续的鉴定及研究。

附图说明

图1为本发明凝胶改进后的电泳图谱，其中1-3为济南17号，4-6济麦19号，7-9济麦20，10-12济麦21，13-15潍麦8号。

图2为使用国家标准《农作物种子检验规程GB/T3543.5-1995》方法的电泳图谱，其中，1-3为潍麦8号，4-6济南17号，7-9济麦19号，10-12济麦20，13-15济麦21。

图3为使用70%(wt)乙醇作样品提取液做济麦22电泳图谱。

图4为使用25% (wt)α-氯乙醇作样品提取液做济麦22电泳图谱。

具体实施方式

实施例1

1.溶液配制

(1)电极缓冲液

称取甘氨酸0.4g，加入蒸馏水溶解，加入4 mL冰乙酸，再加蒸馏水定容至1000mL，混匀。

(2)样品提取液

称取甲基绿0.05g，溶于100 mL 70%(wt)乙醇中，4℃保存，本提取液为实质为一种蛋白质提取液。

(3)凝胶溶液

称取丙烯酸胺150.0g，N，N’一亚甲基双丙烯酰胺15.0g，尿素60.0g，抗坏血酸1.0g，甘氨酸1.0g，硫酸亚铁0.05g，加蒸馏水溶解后，加入20 mL冰乙酸，定容至1000mL，在4℃条件下保存。

(4)0.6%(wt)过氧化氢溶液

取30%(wt)的过氧化氢2mL，加蒸馏水定容至100 mL，在4℃条件下保存。

(5)染色液

称取考马斯亮蓝（R250）0.25g，加25mL无水乙醇溶解，加入50g三氯乙酸，加水至500 mL，混匀。

(6)凝胶胶片清洗液

称取碳酸钠6.0g，十二烷基苯磺酸2.0g，羧甲基纤维素（CMC）0.6g，三聚磷酸钠1.0g，40 %(wt)的硅酸钠溶液0.4g，用水溶解，定容至500mL备用。

(7)凝胶片保存液

取甘油300mL，用水稀释定容至1000mL备用。

2．样品提取

从送验样品中随机分取小麦种子至少100粒，用单籽粒粉碎器粉碎为粒度为10μm，放入1.5mL离心管中，用移液管加入样品提取液200μL，在30℃恒温箱静置提取30分钟，取上清液用于电泳。

3．凝胶制备

将预先洗净晾干的玻璃板装人胶框中，插好梳子，平放在桌面上，取适量分离胶溶液于烧杯中，用微量进样器按比例加入0.6%(wt)过氧化氢溶液（每1mL分离胶溶液加0.6%过氧化氢2μL），迅速摇匀，沿长玻璃板边缘底部倒入，静置。

4．点样

凝胶聚合后，拔出样品梳并将样品槽清理干净，用微量进样器在每个样品槽中加入不同籽粒的样品上清液约15μL，每点一粒后，都要用去离子水清洗进样器3次。

5．电泳

加样完毕后，倒入电极缓冲液，上槽电极缓冲液面要高于短玻璃板，下槽电极缓冲液面要高于铂金丝；将电源线正极接中槽，负极接两侧槽，接通电源，采用350V稳压进行电泳，约1小时后，关闭电源。

6．卸板

倒出电极液，从电泳槽内取出胶室，卸下胶条，启开玻璃板，取出胶片，浸入染色液中。

7．凝胶染色与清洗凝胶胶片

在35℃恒温条件下胶片染色60分钟，将胶片取出置于凝胶胶片清洗液，并置于恒温振荡器中常温振荡3分钟，振荡频率为40r/min。清洗完毕后，用水清洗三次后可直接观察电泳图谱。

8．凝胶胶片的保存

首先将染色后的电泳胶片置于凝胶片保存液中湿润5分钟。胶片浸润期间把保鲜膜摊平于平整桌面。取浸润的胶片置于保鲜膜上，排除气泡后将胶片密封，用记号笔标记检测编号、品种等内容于保鲜膜上，此方法密封胶片保存可至2年。

实施例2  对比实例

对不同品种的小麦种子济南17、济麦19、济麦20、济麦21、潍麦8号进行鉴定，分别按照实施例1中的方法和中华人民共和国国家标准《农作物种子检验规程GB/T3543.5-1995》的方法进行鉴定，结果对应图1、图2。

比较图1、图2，对改进前后的图谱进行比较，结果表明：图1中电泳技术改进后的蛋白质谱带界限更明显，特征带和共有带更清晰、稳定，分辨率得到大大提高，实施效果良好。

实施例3  对比实例

按照实施例1中的方法对小麦品种“济麦22”用不同的提取剂进行电泳，样品提取液分别为70%(wt)乙醇和25%(wt)α-氯乙醇，电泳图谱对应见图3、图4。

通过比对替代物乙醇和原提取剂的电泳效果图，可以看到两张图谱没有差异。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种小麦种子纯度鉴定方法，其特征在于，该方法步骤如下：

 1）溶液配制

样品提取液

称取甲基绿0.05g，溶于100 mL 70%(wt)乙醇中，4℃保存；

凝胶溶液

称取丙烯酸胺150.0g，N，N’一亚甲基双丙烯酰胺15.0g，尿素60.0g，抗坏血酸1.0g，甘氨酸1.0g，硫酸亚铁0.05g，加水溶解后，加入20 mL冰乙酸，定容至1000mL，在4℃条件下保存；

0.6%(wt)过氧化氢溶液

取30%(wt)的过氧化氢2mL，加水定容至100 mL，在4℃条件下保存；

染色液

称取考马斯亮蓝（R250）0.25g，加25mL无水乙醇溶解，加入50g三氯乙酸，加水至500 mL，混匀；

凝胶胶片清洗液

称取碳酸钠6.0g，十二烷基苯磺酸2.0g，羧甲基纤维素（CMC）0.6g，三聚磷酸钠1.0g，40 %(wt)的硅酸钠溶液0.4g，用水溶解，定容至500mL备用；

2）样品提取

取一整粒粉碎后的小麦种子，放入1.5mL离心管中，用移液管加入样品提取液200μL，在30℃恒温箱中静置提取30分钟，取上清液；

3）凝胶制备

将预先洗净晾干的玻璃板装入胶框中，插好梳子，平放在桌面上，取凝胶溶液于烧杯中，用微量进样器按凝胶溶液∶0.6%(wt)过氧化氢溶液为500:1（v/v）的比例加0.6%(wt)过氧化氢溶液，迅速摇匀，沿长玻璃板边缘底部倒入，静置；

4）点样

凝胶聚合后，拔出样品梳并将样品槽清理干净，用微量进样器在样品槽中加入的步骤2）中获得的样品上清液15μL，每点一粒后，都要用去离子水清洗进样器3次；

 5）电泳

加样完毕后，倒入电极缓冲液，上槽电极缓冲液面要高于短玻璃板，下槽电极缓冲液面要高于铂金丝，将电源线正极接中槽，负极接两侧槽，接通电源，采用350V稳压进行电泳，1小时后，关闭电源；

6）卸板

倒出电极液，从电泳槽内取出胶室，卸下胶条，启开玻璃板，取出胶片，浸入染色液中；

7）凝胶染色与清洗凝胶胶片

在35℃恒温条件下胶片置于染色液中染色60分钟，将胶片取出置于凝胶胶片清洗液中，并振荡3分钟，清洗完毕。

2.根据权利要求1所述的一种小麦种子纯度鉴定方法，其特征在于，还包括凝胶胶片的保存方法，其步骤为：

a.配置凝胶胶片保存液，取甘油300mL，用水稀释定容至1000mL备用；

b.将清洗后的凝胶胶片置于步骤a制得的凝胶胶片保存液中湿润5分钟；

c.凝胶胶片浸润期间把保鲜膜摊平于平整桌面，取浸润的胶片置于保鲜膜上，排除气泡后将胶片密封，编号。

3.根据权利要求1所述的一种小麦种子纯度鉴定方法，其特征在于，还包括电极缓冲液的配置方法，该方法为称取甘氨酸0.4g，加水溶解，加入4 mL冰乙酸，再加水定容至1000mL，混匀。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种小麦种子纯度鉴定方法，其特征在于，所述水为蒸馏水或去离子水。

5.根据权利要求1所述的一种小麦种子纯度鉴定方法，其特征在于，步骤2）中所述的小麦种子粉碎为用单籽粒粉碎机粉碎。

6.根据权利要求1所述的一种小麦种子纯度鉴定方法，其特征在于，步骤2）中所述粉碎后的小麦种子粒度为10-25μm。

7.根据权利要求1所述的一种小麦种子纯度鉴定方法，其特征在于，步骤7）中所述震荡的频率为0-100r/min。