KR20200043727A - 노화 모델 피부세포주의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 피부세포주 및 그 피부세포주를 이용한 항노화 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

노화 모델 피부세포주의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 피부세포주 및 그 피부세포주를 이용한 항노화 물질의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특정 범위의 농도의 피루브산을 처리하여 배양된, 노화 현상의 연구에 사용할 수 있는 노화 모델 피부세포주를 제조하는 방법, 그 방법에 의해 제조된 노화 모델 피부세포주와, 그 세포를 이용하여 항노화 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 노화 모델 피부세포주는 피루브산이 결핍된 상태에서 피부세포를 배양할 때 발생하는 세포 독성을 완화시킬 수 있고, 인 비보(in vivo) 모델과 유사한 환경에서 항노화 물질을 스크리닝할 수 있는 우수한 효과가 있다.

Description

노화 모델 피부세포주의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 피부세포주 및 그 피부세포주를 이용한 항노화 물질의 스크리닝 방법{Method for preparing senescent model skin cell lines, skin cell lines therefrom and method for screening anti-aging material using the same}
본 명세서에는 특정 범위의 농도의 피루브산을 처리하여 배양된 노화 현상의 연구에 사용할 수 있는 노화 모델 피부세포주를 제조하는 방법, 그 방법에 의해 제조된 노화 모델 피부세포주와, 그 세포를 이용하여 항노화 물질을 스크리닝하는 방법이 개시된다.
최근 생활수준이 향상됨에 따라 현대인들은 건강한 신체를 유지하는 것에 더하여 건강한 피부를 유지하는 데에도 많은 관심을 기울이고 있다. 따라서 피부미용과 피부노화 개선에 대한 관심이 높아지고 있다.
피부는 인체의 가장 큰 기관으로서 전체 인체 부피의 약 16%를 차지하고, 외부환경과 직접 접해 있으면서, 인체 안으로 침입하려는 치명적인 많은 유해인자, 예를 들면, 온도, 습도 및 자외선 등으로부터 인체를 보호하는 중요한 보호막 역할을 담당한다. 그러나, 각종 오염물질, 강한 자외선과 같은 외부환경으로 인해 피부 세포들이 손상을 입게 되어, 세포 증식이 제대로 이루어지지 않게 되어 피부에 주름, 탄력 손실 및 각질화, 불규칙한 색소 침착 등이 발생한다.
피부 노화는 크게 자연 노화(또는, 내인성 노화)와 외인성 노화로 구분되며, 자연 노화는 유전적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 어려운 반면 외인성 노화는 환경적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 비교적 용이하다. 대표적인 외인성 노화 인자로는 자외선, 활성 산소종(reactive oxygen species) 및 스트레스 등이 알려져 있다.
따라서, 최근 외인성 노화를 개선하기 위한 방법들이 활발히 연구되고 있으며, 특히 노화방지 또는 개선을 위한 물질을 규명하기 위한 노력이 계속되고 있다. 종래 피부세포 노화 모델 제조 기술에는 제작 기간이 오래 걸리는 복제적 노화(replicative senescence) 모델 또는 과도한 스트레스 유발 모델(산화제 처리, UV, 방사선 처리 등) 제조 기술이 있으며, 이를 이용하여 제조한 노화 모델 피부세포주를 활용하여 항노화 물질 검증 및 발굴 연구에 사용하였다. 그러나, 이러한 모델들은 제조하는 데에 시간이 오래 걸리거나 생체 내에서 발생하지 않는 과도한 스트레스로 인해 in vivo 노화 모델에 적용되지 않는 단점이 있다.
이에, 본 발명자는 과도한 스트레스 없이 보다 짧은 시간 내에 제조 가능하고 생체와 유사한 환경 상태로 제조하기 위한 노화 모델 제조방법을 연구하여, 본 발명을 완성하였다.
JP 2015-051654 A KR 10-2015-0085546 A
Na Liu 외 8인, Pyruvate prevents aging of mouse oocytes, Reproduction. 2009 Aug;138(2):223-34.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 분리된 피부세포를 특정 농도 범위의 피루브산(pyruvate)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 노화 모델 피부세포주 제조방법을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 상기 노화 모델 피부세포주 제조방법에 의하여 제조된, 분리된, 노화 모델 피부세포주를 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 특정 농도 범위의 피루브산(pyruvate)을 유효성분으로 포함하는 노화 모델 피부세포주 제조용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 상기 노화 모델 피부세포주 제조방법에 의하여 제조된 노화 모델 피부세포주에, 항노화 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질 처리 전후의 노화 지표를 검출하거나 세포 증식 속도를 측정하는 단계를 포함하는, 항노화 물질 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 상기 노화 모델 피부세포주 제조방법에 의하여 제조된 노화 모델 피부세포주를 포함하는, 항노화 물질 스크리닝을 위한 인 비트로(in vitro) 모델을 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 상기 노화 모델 피부세포주 제조방법에 의하여 제조된 노화 모델 피부세포주; 및 지시서를 포함하는, 항노화 물질 스크리닝용 키트를 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 분리된 피부세포를 0.01 내지 0.9 mM의 피루브산(pyruvate)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 노화 모델 피부세포주 제조방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 상기 노화 모델 피부세포주 제조방법에 의하여 제조된, 분리된, 노화 모델 피부세포주를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 0.01 내지 0.9 mM 이하의 피루브산(pyruvate)을 유효성분으로 포함하는 노화 모델 피부세포주 제조용 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 상기 노화 모델 피부세포주 제조방법에 의하여 제조된 노화 모델 피부세포주에, 항노화 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질 처리 전후의 노화 지표를 검출하거나 세포 증식 속도를 측정하는 단계를 포함하는, 항노화 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 상기 노화 모델 피부세포주 제조방법에 의하여 제조된 노화 모델 피부세포주를 포함하는, 항노화 물질 스크리닝을 위한 인 비트로(in vitro) 모델을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 상기 노화 모델 피부세포주 제조방법에 의하여 제조된 노화 모델 피부세포주; 및 지시서를 포함하는, 항노화 물질 스크리닝용 키트를 제공한다.
본 발명은 생체 내 피루브산 농도와 유사한 0.01 내지 0.9 mM 이하의 피루브산을 포함하는 배지에서 피부세포를 배양 시, 과도한 스트레스 없이 약 2 주 내에 생체와 유사한 환경 상태로 노화 모델 피부세포주를 제조할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 노화 모델 피부세포주는 피루브산이 결핍된 상태에서 피부세포를 배양할 때 발생하는 세포 독성을 완화시킬 수 있고, 인 비보(in vivo) 모델과 유사한 환경에서 항노화 물질을 스크리닝할 수 있는 우수한 효과가 있다.
도 1은 배양배지에 포함된 피루브산 농도에 따른 노화 모델 피부세포주의 노화 정도를 비교한 도이다. 도 1a는 각각 0 mM, 0.1 mM, 1 mM의 피루브산이 포함된 배양배지에서 제조한 3종의 노화 모델 피부세포주의 세포 증식 속도를 나타낸 그래프이며, 도 1b는 상기 3종의 노화 모델 피부세포주의 노화-관련 베타-갈락토시다아제(SA-βgal) 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 피루브산 결핍 환경(0 mM의 피루브산)에서 제조한 노화 모델 피부세포주에 항노화 후보물질 처리 시 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 각각 0 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.5 mM 및 1 mM의 피루브산이 포함된 배양배지에서 제조한 5종의 노화 모델 피부세포주 각각에 항노화 후보물질 처리 시 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 피루브산 결핍 환경(0 mM의 피루브산)에서 제조한 노화 모델 피부세포주에 항노화 후보물질 처리 시 각 항노화 후보물질의 항노화 평가 결과를 나타낸 도이다. 도 4a는 세포 증식 속도 평가 결과를 나타낸 그래프이며, 도 4b는 노화-관련 베타-갈락토시다아제(SA-βgal) 활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 0.1 mM 피루브산이 포함된 배양배지에서 제조한 노화 모델 피부세포주에 항노화 후보물질 처리 시 각 항노화 후보물질의 항노화 평가 결과를 나타낸 도이다. 도 5a는 세포 증식 속도 평가 결과를 나타낸 그래프이며, 도 5b는 노화-관련 베타-갈락토시다아제(SA-βgal) 활성을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은 분리된 피부세포를 0.01 내지 0.9 mM의 피루브산(pyruvate)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 노화 모델 피부세포주 제조방법을 제공한다.
본 발명의 노화 모델 피부세포주 제조방법에서, 배지에 포함된 피루브산의 농도는 0.01 내지 0.9 mM일 수 있고, 구체적으로 0.01 내지 0.5 mM일 수 있으며, 보다 구체적으로 0.01 mM 이상, 0.02 mM 이상, 0.03 mM 이상, 0.04 mM 이상, 0.05 mM 이상, 0.06 mM 이상, 0.07 mM 이상, 0.08 mM 이상, 0.09 mM 이상, 0.1 mM 이상, 0.11 mM 이상, 0.12 mM 이상, 0.13 mM 이상, 0.14 mM 이상, 0.15 mM 이상, 0.16 mM 이상, 0.17 mM 이상, 0.18 mM 이상, 0.19 mM 이상, 0.2 mM 이상, 0.21 mM 이상, 0.22 mM 이상, 0.23 mM 이상, 0.24 mM 이상, 0.25 mM 이상, 0.26 mM 이상, 0.27 mM 이상, 0.28 mM 이상, 0.29 mM 이상, 0.3 mM 이상, 0.31 mM 이상, 0.32 mM 이상, 0.33 mM 이상, 0.34 mM 이상, 0.35 mM 이상, 0.36 mM 이상, 0.37 mM 이상, 0.38 mM 이상, 0.39 mM 이상, 0.4 mM 이상, 0.41 mM 이상, 0.42 mM 이상, 0.43 mM 이상, 0.44 mM 이상, 0.45 mM 이상, 0.46 mM 이상, 0.47 mM 이상, 0.48 mM 이상, 0.49 mM 이상 또는 0.5 mM 이상일 수 있고, 0.9 mM 이하, 0.8 mM 이하, 0.7 mM 이하, 0.6 mM 이하, 0.5 mM 이하, 0.49 mM 이하, 0.48 mM 이하, 0.47 mM 이하, 0.46 mM 이하, 0.45 mM 이하, 0.44 mM 이하, 0.43 mM 이하, 0.42 mM 이하, 0.41 mM 이하, 0.4 mM 이하, 0.39 mM 이하, 0.38 mM 이하, 0.37 mM 이하, 0.36 mM 이하, 0.35 mM 이하, 0.34 mM 이하, 0.33 mM 이하, 0.32 mM 이하, 0.31 mM 이하, 0.3 mM 이하, 0.29 mM 이하, 0.28 mM 이하, 0.27 mM 이하, 0.26 mM 이하, 0.25 mM 이하, 0.24 mM 이하, 0.23 mM 이하, 0.22 mM 이하, 0.21 mM 이하, 0.2 mM 이하, 0.19 mM 이하, 0.18 mM 이하, 0.17 mM 이하, 0.16 mM 이하, 0.15 mM 이하, 0.14 mM 이하, 0.13 mM 이하, 0.12 mM 이하, 0.11 mM 이하 또는 0.1 mM 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 노화 모델 피부세포주 제조방법에서, 상기 피부세포는 피부 노화 정도를 측정하기 위해 노화 지표를 검출하거나 세포 증식 속도를 측정할 수 있는 피부세포이면 제한되지 않으며, 구체적으로 항노화 물질 스크리닝에 이용할 수 있는 피부세포일 수 있으며, 보다 구체적으로 섬유아세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 노화 모델 피부세포주 제조방법에서, 상기 배양단계는 분리된 피부세포를 0.01 내지 0.9 mM의 피루브산을 포함하는 배지에서 7 내지 30일 동안 배양하는 것일 수 있고, 구체적으로 10 내지 20일 동안 배양하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상, 15일 이상, 16일 이상, 17일 이상, 18일 이상, 19일 이상, 20일 이상, 21일 이상, 22일 이상, 23일 이상, 24일 이상, 25일 이상, 26일 이상, 27일 이상, 28일 이상 또는 29일 이상 배양하는 것일 수 있고, 30일 이하, 29일 이하, 28일 이하, 27일 이하, 26일 이하, 25일 이하, 24일 이하, 23일 이하, 22일 이하, 21일 이하, 20일 이하, 19일 이하, 18일 이하, 17일 이하, 16일 이하, 15일 이하, 14일 이하, 13일 이하, 12일 이하, 11일 이하, 10일 이하, 9일 이하 또는 8일 이하 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 배양배지에 포함된 피루브산의 농도가 1 mM일 때보다, 0 mM 또는 0.1 mM일 때 피부세포의 세포 노화가 촉진되어 보다 짧은 시간 동안 노화 모델 피부세포주를 제조할 수 있음을 확인하였다(실험예 1). 또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 배양배지에 포함된 피루브산의 농도가 0.1 내지 0.5 mM일 때 항노화 물질에 의한 세포 독성이 완화되고, 항노화 물질 스크리닝에 가장 최적화된 상태의 노화 모델 피부세포주를 얻을 수 있음을 확인하였다(실험예 2 및 3).
본 명세서에서 최적화된 상태의 노화 모델 피부세포주는, 예컨대, 세포 군집 중 노화가 진행되지 않은 정상세포 및 이미 세포 사멸이 일어나서 살아있지 않은 세포를 제외하고 대사 활동이 저하된 세포로서, 세포 노화 정도를 측정하는 노화 지표가 증가 또는 감소하는 세포일 수 있고, 세포 증식 속도가 감소하는 세포일 수 있으며, 항노화 물질 처리시, 노화가 지연되거나 일어나지 않을 수 있는 세포를 의미할 수 있다. 즉, 더 이상 세포 증식을 유도하지 않으면서, 허용 가능한 생존률을 보이는 상태의 세포를 의미할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 노화 모델 피부세포주 제조방법에 의해 제조된, 분리된, 노화 모델 피부세포주를 제공한다. 상기 노화 모델 피부세포주는 항노화 물질을 스크리닝하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 피루브산 결핍 환경(0 mM의 피루브산)에서 제조한 노화 모델 피부세포주는 항산화 물질에 의해 세포 독성이 발생하고(실험예 2-1), 항노화 물질(후보물질) 처리 전후의 노화 지표 또는 세포 증식 속도의 변화가 거의 없어(실험예 3-1), 항노화 물질 스크리닝에 이용하기에 적절하지 않다. 반면에, 0.1 내지 0.5 mM의 피루브산을 포함하는 배양배지에서 배양된 노화 모델 피부세포주는 항노화 물질에 의한 세포 독성을 완화 내지 억제하고(실험예 2-2), 특히 0.1 mM 피루브산이 포함된 배양배지에서 제조한 노화 모델 피부세포주는 항노화 후보물질 처리 전후의 노화 지표의 뚜렷한 변화를 검출할 수 있고 세포 증식 속도가 차이가 있어, 항노화 물질 스크리닝에 이용하기에 적절함을 확인하였다(실험예 3-2).
또 다른 측면에서, 본 발명은 0.01 내지 0.9 mM 이하의 피루브산(pyruvate)을 유효성분으로 포함하는 노화 모델 피부세포주 제조용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 노화 모델 피부세포주를 제조하기 위한 배양배지일 수 있으며, 상기 피루브산 농도, 노화 모델 피부세포주, 노화 모델 피부세포주 제조에 관한 설명은 상술한 바와 같다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된, 분리된 노화 모델 피부세포주에, 항노화 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질 처리 전후의 노화 지표를 검출하거나 세포 증식 속도를 측정하는 단계를 포함하는, 항노화 물질 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 제조방법, 노화모델 피부세포주에 관한 설명은 상술한 바와 같다.
상기 항노화 물질 스크리닝 방법은 상기 후보물질의 처리 후의 노화 지표의 발현량이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 10% 이상 감소하면 항노화 물질로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 노화 지표란, 노화된 세포 또는 세포주에서 특이적으로 발현양이 증가하거나 감소하여, 세포의 노화 정도를 확인할 수 있는 유전자, 그 유전자의 발현산물을 의미할 수 있다. 상기 노화 지표는, 예컨대, 베타-갈락토시다아제(β- galactosidase) 또는 노화-관련 베타-갈락토시다아제(SA-βgal, senescence-associated β-galactosidase)의 활성, p16, p21 또는 p53 유전자 또는 그 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 업계에 알려진 공지의 노화 지표를 포함한다. 상기 항노화 물질 결정 단계는 상기 후보물질의 처리 후의 노화 지표의 발현량이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 10% 이상 감소하면 항노화 물질로 결정하는 단계일 수 있고, 구체적으로 10% 이상, 12% 이상, 14% 이상, 16% 이상, 18% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 32% 이상, 34% 이상, 36% 이상, 38% 이상, 40% 이상, 42% 이상, 44% 이상, 46% 이상, 48% 이상, 50% 이상, 52% 이상, 54% 이상, 56% 이상, 58% 이상, 60% 이상, 62% 이상, 64% 이상, 66% 이상, 68% 이상, 70% 이상, 72% 이상, 74% 이상, 76% 이상, 78% 이상, 80% 이상, 82% 이상, 84% 이상, 86% 이상, 88% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 96% 이상 또는 98% 이상 감소하면 항노화 물질로 결정하는 단계일 수 있다.
상기 항노화 물질 스크리닝 방법은 상기 후보물질의 처리 후의 세포 증식 속도가 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 1.1 배 이상 증가하면 항노화 물질로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 세포 증식 속도는 시간이 지남에 따라 세포가 증식하는 속도가 수치화된 것을 의미하며, 하기 식 1을 이용하여 측정된 세포 증식 속도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 업계에 알려진 공지의 세포 증식 속도 측정 방법에 의해 측정된 것을 포함한다.
[식 1]
Figure pat00001
상기 항노화 물질로 결정하는 단계는 상기 후보물질의 처리 후의 세포 증식 속도가 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 1.1 배 이상 증가하면 항노화 물질로 결정하는 단계일 수 있고, 구체적으로 1.1 배 이상, 1.2 배 이상, 1.3 배 이상, 1.4 배 이상, 1.5 배 이상, 1.6 배 이상, 1.7 배 이상, 1.8 배 이상, 1.9 배 이상, 2 배 이상, 2.1 배 이상, 2.2 배 이상, 2.3 배 이상, 2.4 배 이상, 2.5 배 이상, 2.6 배 이상, 2.7 배 이상, 2.8 배 이상, 2.9 배 이상 또는 3 배 이상 증가하면 항노화 물질로 결정하는 단계일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된, 분리된 노화 모델 피부세포주를 포함하는, 항노화 물질 스크리닝을 위한 인 비트로(in vitro) 모델을 제공한다. 상기 제조방법, 노화모델 피부세포주, 항노화 물질 스크리닝에 관한 설명은 상술한 바와 같다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된, 분리된 노화 모델 피부세포주; 및 지시서를 포함하며, 상기 지시서에는, 후보물질 처리 전후의 노화 지표를 검출하거나 세포 증식 속도를 측정한 후, 상기 후보물질의 처리 후의 노화 지표의 발현량이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 10% 이상 감소하거나 후보물질의 처리 후의 세포 증식 속도가 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 1.1 배 이상 증가하면 항노화 물질로 판단하는 내용을 포함하는, 항노화 물질 스크리닝용 키트를 제공한다. 상기 제조방법, 노화모델 피부세포주, 항노화 물질 스크리닝, 노화 지표, 세포 증식 속도에 관한 설명은 상술한 바와 같다.
상기 피부세포주는 냉동보존 또는 담체 보존된 상태인 것일 수 있다. 상기 키트 내에 포함되는 노화 모델 피부세포주는, 추가적인 세포 증식이나 노화를 최소화하기 위해, 상기 나열된 기술 외에도 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해, 최적의 노화 상태가 보존된 채로 키트 내에 포함될 수 있다.
상기 노화 지표는, 예컨대, 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase) 또는 노화-관련 베타-갈락토시다아제(SA-βgal, senescence-associated β-galactosidase)의 활성, p16, p21 또는 p53 유전자 또는 그 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 업계에 알려진 공지의 노화 지표를 포함한다.
상기 세포 증식 속도는, 하기 식 1을 이용하여 측정된 세포 증식 속도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 업계에 알려진 공지의 세포 증식 속도 측정 방법에 의해 측정된 것을 포함한다.
[식 1]
Figure pat00002
이하, 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[ 참고예 ] 항노화 후보물질 제조
하기와 같은 방법으로 4종의 항노화 후보물질 각각을 제조하였다.
1) 항노화 후보물질 1 (발아 종자 및 열매 혼합물(Sprouted seed and fruit complex)) 제조
항노화 후보물질 1(Sprouted seed and fruit complex)은 매화나무 열매(Prunus mume fruit), 잣나무 종자(Pinus koraiensis seed), 모과나무 열매(Chaenomeles sinensis fruit), 발아 찔레나무 열매(germinated Rosa multiflora fruit) 및 발아 검은참깨 종자(germinated black Sesamum indicum seed)를 포함하는 5종의 물질의 혼합물이다. 같은 부피의 상기 5종의 물질을 4 또는 5 배의 부피(v/w)의 에탄올 수용액(50% (v/v) ethanol-water)을 이용하여 60 내지 70℃에서 6시간 동안 추출하였다. 이 때, 녹은 물질들을 여과 후 건조시켜 분말화하여 항노화 후보물질 1을 제조하였다.
2) 항노화 후보물질 2 (탱자나무 열매 추출물( Poncirus trifoliata fruit extract)) 제조
탱자나무 열매(Poncirus trifoliata fruit)를 식염수(salt solution, 0.5%)와 혼합 후 7 일 동안 1 내지 4℃에서 녹이고, 5배 부피(v/w)의 70% 에탄올 수용액을 섞어 준 후 여과하여 녹은 용액만 얻었다. 이 때, 분리된 물질은 건조시켜 분말화하여 항노화 후보물질 2를 제조하였다.
3) 항노화 후보물질 3 (자움 밸런싱 혼합물(Jaum balancing complex)) 제조
항노화 후보물질 3(Jaum balancing complex)은 작약 뿌리(the roots of Paeonia lactiflora), 연꽃(flowers of Nelumbo nucifera), 지황 뿌리(roots of Rehmannia glutinosa), 백합 구근(bulbs of Lilium candidum) 및 둥굴래 근경(rhizomes of Polygonatum officinale)를 포함하는 5종의 물질의 혼합물이다. 상기 혼합물과 같은 부피의 10% 에탄올 수용액에 상기 혼합물을 18시간 이상 녹인 후, 녹인 혼합물을 여과 후 건조시켜 분말화하여 항노화 후보물질 3을 제조하였다.
4) 항노화 후보물질 4 (매화나무 추출물( Prunus mume extract)) 제조
건조된 매화나무(Prunus mume) 꽃을 상온에서 10배 부피(v/w)의 70% 에탄올 수용액에서 2시간 동안 녹인 후, 여과 후 건조시켜 분말화하여 항노화 후보물질 4를 제조하였다.
[ 실험예 1] 피루브산 농도에 따른 노화 모델 피부세포주의 노화 정도 비교
정상 인간 섬유아세포(Normal human dermal fibroblasts, Lonza 사)를 12-well plate에 1~5 X 104 로 시딩(seeding)한 후, 각각 0 mM, 0.1 mM, 1 mM의 피루브산이 포함된 배양배지(DMEM, WelGene 사)에서 CO2 배양기를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 2주 간 배양하여, 3종의 노화 모델 피부세포주를 제조하였다.
그런 다음, 상기 제조된 3종의 노화 모델 세포주의 피루브산 농도에 따른 노화 정도를 비교하기 위해 세포 증식 속도 및 노화-관련 베타-갈락토시다아제(SA-βgal, senescence-associated β-galactosidase) 활성을 측정하였다.
구체적으로, 상기 3종의 노화 모델 세포주 각각을 하기 식 1을 이용하여 세포 증식 속도를 수치화하였으며, 그 결과를 도 1a에 나타내었다.
[식 1]
Figure pat00003
또한, 상기 3종의 노화 모델 세포주 각각을 SA-βgal 키트(Abcam 사)를 이용하여 염색(staining)한 후 200개 세포 이상을 MetaMorph(Molecular Devices)를 이용하여 계수(counting)하였으며, 그 결과를 도 1b에 나타내었다.
도 1a에 나타난 바와 같이, 1 mM의 피루브산이 포함된 배양배지에서 배양된 노화 모델 세포주의 증식 속도가 각각 0 mM, 0.1 mM의 피루브산이 포함된 배양배지에서 배양된 노화 모델 세포주에 비해 약 3배 정도로 확인되었다. 또한, 도 1b에 나타난 바와 같이, 각각 0 mM, 0.1 mM의 피루브산이 포함된 배양배지에서 배양된 노화 모델 세포주가 1 mM의 피루브산이 포함된 배양배지에서 배양된 노화 모델 세포주에 비해 SA-βgal 활성이 약 12배 이상 매우 증가함을 확인하였다. 이 때, 피루브산의 농도가 0 mM, 0.1 mM일 때의 노화 모델 세포주의 세포 노화 정도는 큰 차이가 없는 것으로 확인되었다.
이를 통해, 섬유아세포 배양배지에 포함된 피루브산의 농도가 1 mM 미만일 때, 예를 들어 0 내지 0.1 mM일 때 세포 노화가 촉진되어 보다 짧은 시간동안 노화 모델 피부세포주를 제조할 수 있음을 알 수 있었다.
[실험예 2] 노화 모델 피부세포주를 이용하여 항노화 물질 스크리닝 시 세포 독성 평가
노화 모델 피부세포주의 항노화 후보물질에 의한 세포 독성 발생 여부를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
실험예 2-1. 피루브산 결핍 환경에서 제조한 노화 모델 피부세포주를 이용하여 항노화 물질 스크리닝 시 세포 독성 평가
피루브산 결핍 환경(0 mM의 피루브산)에서 제조한 노화 모델 피부세포주의 항노화 후보물질에 의한 세포 독성 발생 여부를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 노화 모델 피부세포주를 제조하되, 1 mM의 피루브산이 포함된 배양배지에 항노화 후보물질을 처리하지 않고 2주간 섬유아세포를 배양하여 노화 모델 피부세포주를 제조하였고(1 mM 피루브산 처리군), 0 mM의 피루브산이 포함된 배양배지에는 상기 참고예에서 제조한 상기 항노화 후보물질 1 내지 4 각각을 도 2의 농도로 각각 포함하도록 하여 여기에 2주 간 섬유아세포를 배양하여 노화 모델 피부세포주를 제조하였다(0 mM 피루브산 처리군). 그런 다음, 상기 제조된 노화 모델 피부세포주를 트리판 블루(trypan blue)로 염색 후 염색된 세포의 비율을 비교하여 하기 식 2을 이용하여 세포 생존율을 계산하였다. 상기 도출된 세포 생존율을 통해 세포 독성을 측정하였으며, 그 결과는 도 2와 같다.
[식 2]
Figure pat00004
도 2에 나타난 바와 같이, 항노화 물질을 처리하지 않은 노화 모델 피부세포주의 경우, 1 mM 피루브산 처리군에 비해 0 mM 피루브산 처리군의 세포 생존율이 낮음을 확인하였다. 또한, 0 mM 피루브산 처리군은 항노화 후보물질 1, 3 및 4를 함께 처리하여도 세포 생존율에 차이가 없는 반면, 항노화 후보물질 2를 함께 처리하였을 때 세포 생존율이 항노화 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 세포 생존율이 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다.
이를 통해, 피루브산 결핍 환경(0 mM의 피루브산)에서 제조한 노화 모델 피부세포주는 세포 노화 촉진 효과가 우수하지만, 세포 독성으로 인해 항노화 물질 스크리닝에 이용하기에 적절하지 않음을 알 수 있었다.
실험예 2-2. 피루브산 농도를 다르게 하여 제조한 노화 모델 피부세포주를 이용하여 항노화 물질 스크리닝 시 세포 독성 평가
항노화 물질(후보물질)에 의한 세포 독성을 완화할 수 있는 피루브산의 농도를 확인하기 위해, 0, 0.1 0.2, 0.5, 1 mM 농도의 피루브산을 각각 포함하는 배양배지에 상기 항노화 후보물질 2을 함께 처리하여 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 노화 모델 피부세포주를 제조하고, 상기 노화 모델 피부세포주의 세포 생존율을 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 피루브산 결핍 환경(0 mM의 피루브산)에서 제조한 노화 모델 피부세포주는 세포 생존율이 매우 낮아 항노화 물질에 의한 세포 독성이 발생하는 반면, 1 mM 미만 농도, 구체적으로 0.1 내지 0.5 mM의 피루브산을 포함하는 배양배지에서 배양된 노화 모델 피부세포주는 항노화 물질에 의한 세포 독성을 억제함을 알 수 있었다.
[실험예 3] 노화 모델 피부세포주를 이용하여 항노화 물질 스크리닝 시 항노화 후보물질의 항노화 평가
노화 모델 피부세포주의 항노화 물질 스크리닝에의 이용 여부를 확인하기 위해 하기와 같은 방법으로 항노화 후보물질의 항노화 평가실험을 수행하였다.
실험예 3-1. 피루브산 결핍 환경에서 제조한 노화 모델 피부세포주를 이용한 항노화 후보물질의 항노화 평가
피루브산 결핍 환경(0 mM의 피루브산)에서 제조한 노화 모델 피부세포주를 이용한 항노화 후보물질의 항노화 평가를 위해, 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 1 mM 피루브산 처리군(1 mM의 피루브산이 포함된 배양배지에 항노화 후보물질을 처리하지 않고 2주간 섬유아세포를 배양하여 제조된 노화 모델 피부세포주) 및 0 mM 피루브산 처리군(0 mM의 피루브산, 및 상기 항노화 후보물질 1, 3 및 4 각각을 도 4a의 농도로 포함하는 배양배지에서 2주 간 섬유아세포를 배양하여 제조된 노화 모델 피부세포주)을 제조하였다.
그런 다음, 상기 제조된 노화 모델 피부세포주 각각을 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 세포 증식 속도 및 노화-관련 베타-갈락토시다아제(SA-βgal) 활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다. 이 때, 0 mM 피루브산 처리군 중 항노화 후보물질 미처리군을 대조군으로 사용하였다.
도 4a에 나타난 바와 같이, 0 mM 피루브산 처리군 중 항노화 후보물질을 처리하지 않은 군(대조군)의 세포 증식 속도는 약 0.2 일로, 항노화 후보물질 1, 3 및 4 각각을 처리하였을 때의 세포 증식 속도는 대조군과 비슷한 것으로 확인되었다. 또한, 도 4b에 나타난 바와 같이, 0 mM 피루브산 처리군은 항노화 후보물질 처리 전후의 SA-βgal 활성에 차이가 거의 없는 것을 확인하였다.
이를 통해, 피루브산 결핍 환경(0 mM의 피루브산)에서 제조한 노화 모델 피부세포주는 항노화 후보물질 처리 전후의 노화 지표 또는 세포 증식 속도의 변화가 거의 없어, 항노화 물질 스크리닝에 이용하기에 적절하지 않음을 알 수 있었다.
실험예 3-2. 0.1 mM 피루브산이 포함된 배양배지에서 제조한 노화 모델 피부세포주를 이용한 항노화 후보물질의 항노화 평가
상기 실험예 2-2를 통해, 0.1 내지 0.5 mM의 피루브산을 포함하는 배양배지에서 배양된 노화 모델 피부세포주는 항노화 물질에 의한 세포 독성을 억제함을 확인하였는바, 0.1 mM 피루브산이 포함된 배양배지에서 제조한 노화 모델 피부세포주를 이용한 항노화 후보물질의 항노화 평가를 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 1 mM 피루브산 처리군(1 mM의 피루브산이 포함된 배양배지에 항노화 후보물질을 처리하지 않고 2주간 섬유아세포를 배양하여 제조된 노화 모델 피부세포주) 및 0.1 mM 피루브산 처리군(0.1 mM의 피루브산, 및 상기 항노화 후보물질 1 내지 4 각각을 도 5a의 농도로 포함하는 배양배지에서 2주 간 섬유아세포를 배양하여 제조된 노화 모델 피부세포주)을 제조하였다.
그런 다음, 상기 제조된 노화 모델 피부세포주 각각을 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 세포 증식 속도 및 노화-관련 베타-갈락토시다아제(SA-βgal) 활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다. 이 때, 0.1 mM 피루브산 처리군 중 항노화 후보물질 미처리군을 대조군으로 사용하였다.
도 5a에 나타난 바와 같이, 0.1 mM 피루브산 처리군 중 항노화 후보물질을 처리하지 않은 군(대조군)의 세포 증식 속도는 약 0.2 일로, 항노화 후보물질 1을 처리하였을 때의 세포 증식 속도는 대조군과 비슷하고, 항노화 후보물질 2를 처리하였을 때의 세포 증식 속도는 대조군보다 감소한 반면, 항노화 후보물질 3 및 4 각각을 처리하였을 때의 세포 증식 속도는 대조군에 비해 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 도 5b에 나타난 바와 같이, 0.1 mM 피루브산 처리군 중 항노화 후보물질 1 및 2 각각을 처리한 전후의 SA-βgal 활성은 차이가 거의 없는 반면, 항노화 후보물질 3 및 4 각각을 처리하였을 때의 SA-βgal 활성은 대조군에 약 1/3 내지 1/5 수준으로 감소하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 항노화 후보물질 1 내지 4 중 항노화 후보물질 3 및 4 처리 시 항노화 효과가 발생함을 알 수 있으며, 0.1 mM 피루브산이 포함된 배양배지에서 제조한 노화 모델 피부세포주는 항노화 후보물질 처리 전후의 노화 지표의 뚜렷한 변화를 검출할 수 있고 세포 증식 속도가 차이가 있어, 항노화 물질 스크리닝에 이용하기에 적절함을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 일 측면에 따른 분리된 피부세포에 0.01 내지 0.9 mM 이하의 피루브산을 처리하는 단계를 포함하는 노화 모델 피부세포주 제조방법에 따라 제조된 노화 모델 피부세포주는 항노화 물질을 스크리닝하는 데에 우수한 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (17)

  1. 분리된 피부세포를 0.01 내지 0.9 mM의 피루브산(pyruvate)을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 노화 모델 피부세포주 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 피부세포는 섬유아세포인, 노화 모델 피부세포주 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배양은 상기 분리된 피부세포를 7 내지 30일 동안 배양하는 것인, 노화 모델 피부세포주 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 배양은 상기 분리된 피부세포를 10 내지 20일 동안 배양하는 것인, 노화 모델 피부세포주 제조방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된, 분리된, 노화 모델 피부세포주.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 노화 모델 피부세포주는 항노화 물질을 스크리닝하기 위한 것인, 노화 모델 피부세포주.
  7. 0.01 내지 0.9 mM 이하의 피루브산(pyruvate)을 유효성분으로 포함하는 노화 모델 피부세포주 제조용 조성물.
  8. 제5항의 노화 모델 피부세포주에 항노화 후보물질을 처리하는 단계; 및
    상기 후보물질 처리 전후의 노화 지표를 검출하거나 세포 증식 속도를 측정하는 단계를 포함하는, 항노화 물질 스크리닝 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 후보물질의 처리 후의 노화 지표의 발현량이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 10% 이상 감소하면 항노화 물질로 결정하는 단계를 더 포함하는, 항노화 물질 스크리닝 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 노화 지표는 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)인, 항노화 물질 스크리닝 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 후보물질의 처리 후의 세포 증식 속도가 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 1.1 배 이상 증가하면 항노화 물질로 결정하는 단계를 더 포함하는, 항노화 물질 스크리닝 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 세포 증식 속도 측정은 하기 식 1을 이용하여 측정하는 것인, 항노화 물질 스크리닝 방법.
    [식 1]
    Figure pat00005
  13. 제5항의 노화 모델 피부세포주를 포함하는, 항노화 물질 스크리닝을 위한 인 비트로(in vitro) 모델.
  14. 제5항의 노화 모델 피부세포주; 및
    지시서를 포함하며,
    상기 지시서에는, 후보물질 처리 전후의 노화 지표를 검출하거나 세포 증식 속도를 측정한 후, 상기 후보물질의 처리 후의 노화 지표의 발현량이 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 10% 이상 감소하거나 후보물질의 처리 후의 세포 증식 속도가 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 1.1 배 이상 증가하면 항노화 물질로 판단하는 내용을 포함하는, 항노화 물질 스크리닝용 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 피부세포주는 냉동보존 또는 담체 보존된 상태인, 항노화 물질 스크리닝용 키트.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 노화 지표는 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)인, 항노화 물질 스크리닝용 키트.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 세포 증식 속도 측정은 하기 식 1을 이용하여 측정하는 것인, 항노화 물질 스크리닝용 키트.
    [식 1]
    Figure pat00006
KR1020180124487A 2018-10-18 2018-10-18 노화 모델 피부세포주의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 피부세포주 및 그 피부세포주를 이용한 항노화 물질의 스크리닝 방법 KR102175470B1 (ko)

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