CN113854302B - 脯氨酸和丙氨酸在防治小麦赤霉病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了脯氨酸和丙氨酸在防治小麦赤霉病中的应用。本发明首先基于非靶向代谢组学技术，在电离子全扫描模式下，通过筛选抗感赤霉病小麦品种中抗性相关差异代谢物，并进行代谢通路富集分析，发现氨基酸途径与抗赤霉病相关，然后通过靶向代谢组学技术鉴定出氨基酸途径中脯氨酸和丙氨酸为赤霉病抗性相关代谢物。本发明通过脯氨酸和丙氨酸在小麦离体叶片和穗部接菌前进行处理，能够对小麦起到有效的保护和治疗作用，对防治小麦赤霉病有重要意义。

Description

脯氨酸和丙氨酸在防治小麦赤霉病中的应用

技术领域

本发明涉及代谢组学应用技术领域，具体涉及脯氨酸和丙氨酸在防治小麦赤霉病中的应用。

背景技术

小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌复合种引起的小麦上的一类流行性病害。近年来，由于全球气候变暖、秸秆还田、免耕技术的推广应用等耕作制度的改变，同时国家对粮食需求量的日益增加，生产中小麦种植密度过大造成田间小气候的变化，小麦赤霉病在我国呈现逐年加重趋势，造成小麦产量的巨大损失。小麦赤霉病不但导致粮食严重减产和品质下降，而且病原菌在感病麦粒中产生的真菌毒素严重威胁食品安全和人畜健康。因此，防治小麦赤霉病与粮食安全和食品安全息息相关。

种植抗病品种是防治小麦赤霉病最直接、最经济有效的措施，但是抗赤霉病的小麦品种选育一直是世界性难题。由于缺乏对赤霉病高度抗病或完全免疫的小麦种质资源，因此，目前小麦赤霉病赤霉病的防治仍主要依赖于化学防治。虽然生产中有些杀菌剂在一定程度上可以防治小麦赤霉病，但是当病原菌侵染麦穗后会刺激病原菌产生更多的毒素，如三唑类杀菌剂戊唑醇，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂嘧菌酯。因此，开发既能防病又绿色安全的新型杀菌剂显得尤为重要。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供脯氨酸和丙氨酸在防治小麦赤霉病中的应用。本发明首先基于非靶向代谢组学技术，在电离子全扫描模式下，通过筛选抗感赤霉病小麦品种中抗性相关差异代谢物，并进行代谢通路富集分析，发现氨基酸途径与抗赤霉病相关，然后通过靶向代谢组学技术鉴定出氨基酸途径中脯氨酸和丙氨酸为赤霉病抗性相关代谢物。本发明通过脯氨酸和丙氨酸在小麦离体叶片和穗部接菌前进行处理，能够对小麦起到有效的保护和治疗作用，对防治小麦赤霉病有重要意义。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供如下(1)-(3)任一项所述的物质在防治小麦赤霉病中的应用：

(1)脯氨酸；

(2)丙氨酸；

(3)组合物，所述组合物由脯氨酸和丙氨酸按摩尔比1：1组成。

本发明的第二方面，提供如下(1)-(3)任一项所述的物质在制备防治小麦赤霉病的药物制剂中的应用：

(1)脯氨酸；

(2)丙氨酸；

(3)组合物，所述组合物由脯氨酸和丙氨酸按摩尔比1：1组成。

本发明的第三方面，提供一种防治小麦赤霉病的药物制剂，所述药物制剂以脯氨酸、丙氨酸或者由脯氨酸和丙氨酸按摩尔比1：1组成的组合物为活性成分。

进一步的，所述药物制剂中还可以包含辅料或载体；所述辅料或载体包括但不限于：乳化剂、分散剂、助剂、增稠剂、防冻剂、稳定剂、粘结剂等。

优选的，所述药物制剂的剂型为粉剂、可湿性粉剂、悬浮剂或水剂；更优选的，所述药物制剂的剂型为水剂。

本发明的第四方面，提供一种防治小麦赤霉病的方法，包括以下步骤：

在小麦扬花期将脯氨酸溶液、丙氨酸溶液或者脯氨酸-丙氨酸混合溶液均匀喷施于小麦的穗部和叶面。

优选的，所述脯氨酸溶液、丙氨酸溶液是分别将脯氨酸和丙氨酸加入到适量的水中，经搅拌溶解得到；所述脯氨酸溶液、丙氨酸溶液的浓度均为10mM；所述脯氨酸-丙氨酸混合溶液由10mM的脯氨酸溶液和10mM的丙氨酸溶液按体积比1:1混合而成。

本发明的有益效果：

本发明首次研究发现，外源喷施脯氨酸和丙氨酸能够提高感病小麦对赤霉病的抗性，对小麦起到有效的保护和治疗作用。而且，脯氨酸和丙氨酸不同于化学杀菌剂，其使用更为绿色、安全，将其开发成为药物制剂，对于小麦赤霉病的防治具有重要意义。

附图说明

图1：本发明抗病品种苏麦3号和感病品种山农20的感染赤霉病表型图(A)和统计图(B)。

图2：本发明非靶向代谢组学的PCA分析图(A)、PLS-DA分析图(B)；图中，R-0、R-3、R-6、R-9分别表示苏麦3号接菌0、3、6、9天；S-0、S-3、S-6、S-9分别表示山农20接菌0、3、6、9天；QC表示质量控制。

图3：本发明差异代谢物的代谢通路富集图。

图4：本发明抗感病品种和感病品种中氨基酸的含量图。

图5：(A)本发明外施不同氨基酸对小麦离体叶片感染赤霉病的表型图(A)和病斑面积统计图(B)，及对小麦穗部感染赤霉病的表型图(C)、病穗数统计图(D)和禾谷镰刀菌定量图(E)。

图6：本发明感病品种喷施脯氨酸、丙氨酸和组合物后感染赤霉病表型图(A)和统计图(B)。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

其中：本发明实施例中所使用的氨基酸都为可以构成天然蛋白质的L-氨基酸。可通过市售渠道购买得到，例如上海麦克林生化科技有限公司。

实施例1：抗病品种苏麦3号和感病品种山农20感染赤霉病的表型分析

1、试验方法：

(1)菌种活化：本实验使用的禾谷镰刀菌为PH-1菌种，4℃条件下通过PDA培养基保存菌种，每隔三个月进行一次菌种活化。手术刀切一平方厘米的菌丝生长的PDA培养基放入CMC培养基。28℃条件下，200rpm摇菌三天。摇菌完成后，菌液用滤布过滤，50ml离心管分装。2000rpm离心10min。弃去上清液，加30ml灭菌水震荡混匀。弃去上清液，沉淀物用少量灭菌水重悬。显微镜下检测菌量，并根据孢子量稀释至1-5×10⁵/ml浓度

(2)小麦穗部赤霉病接种方法及抗病性鉴定：处于扬花期的苏麦3号，山农20小麦材料，取中上部小穗用记号笔点点做标记，每穗接种4个小花，每个小花接种10μl，每种小麦材料10个重复。喷壶喷水，加套自封袋以保湿。在接种后第9、14、21天观察并记录赤霉病的发病情况、发病小穗数，并对统计数据进行显著性分析。

2、试验结果：

试验结果见图1，由图1可以看出：小麦品种苏麦3号和山农20对小麦赤霉病病原菌的抵抗能力存在显著差异。

实施例2：基于代谢组学进行差异代谢物分析

1、非靶向代谢组学分析：

(1)代谢物提取方法：

分别取接菌(禾谷镰刀菌PH-1)0、3、6、9天后的苏麦3号和山农20号的小穗，将小穗样品磨碎后，加入提取液(甲醇：乙腈：水，体积比2:2:1)，超声10min，13000prm离心5min，取上清移至离心管内，进样前通过0.22μm的滤膜过滤后即可上样。

(2)UPLC-QE-MS的液相和质谱条件：

液相条件：色谱柱：Thermo HYPERSIL GOLD C18色谱柱(2.1×150，1.7μm)；柱温：35℃；流动相：A：0.04％乙酸溶液，B：0.04％乙腈；洗脱梯度：0-0.2min，A＝90％；0.2-6min，A递减至10％；6-8min，A＝10％；8.1min，A递增至90％；8.1-10min，A＝90％；进样体积：3μl。

质谱条件：正离子模式：喷雾电压：3.8kv；鞘气：40；辅助气：10；离子传输管温度：350℃。分辨率：17500；微扫数：1；AGC target：2e5；归一化碰撞能量：30。负离子模式：喷雾电压：2.9kv；鞘气：4；辅助气：0；离子传输管温度：350℃。分辨率：17500；微扫数：1；AGCtarget：2e5；归一化碰撞能量：30。

(3)数据分析方法：

通过ProteoWizard软件，将质谱原始数据转换成mzML格式。利用UPLC-QE-MS预处理软件XCMS(https://xcmsonline.scripps.edu/)对质谱检测获得的原始文件进行数据预处理。将转化完的数据通过XCMS软件进行峰提取、峰对齐、归一化等操作，获得质荷比(m/z)和保留时间(retention time)，相似度及峰面积的二维数据矩阵，构建成多维数据集，初步确定正离子相变量和负离子相变量，导出至EXCEL进行进一步的分析，去掉检出率低于80％的peak，最小值补值法对缺失数据进行补值，四分位法对数据结果进行去噪处理，最终确定符合要求的正离子相和负离子相变量。对数据进行峰面积的归一化处理，进行后续的分析。确定符合要求的正离子相和负离子相变量后采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)分别对质谱数据进行可信性分析，并根据PLS模型的VIP值(阈值>1)、不同小麦品种间代谢产物峰面积学生氏t检验的p值(阈值<0.05)及峰面积倍性变化，结果如图2所示。

PCA分析图(A)中R-0、R-3、R-6、R-9,S-0、S-3、S-6、S-9和QC有明显的分离，各样本组内聚集，该PCA模型能够有效的解释各组样本间的代谢差异，表明赤霉病侵染和小麦基因型对小麦产生差异代谢物有显著影响。采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)(图B)比较R-0组与S-0组、R-3组与S-3组、R-6组与S-组、R-9组与S-9组之间的差异，结果表明苏麦3号和山农20在接种赤霉菌过程中导致相关代谢物水平上发生了变化。

进而对供试次生代谢产物差异进行分析，并对筛选到的差异代谢物进行KEGG代谢通路富集分析(https://www.kegg.jp/)，结果如图3所示。

结果表明：不同品种感染赤霉病差异代谢物富集的代谢通路中，大部分代谢途径属于氨基酸代谢途径，包括组氨酸代谢、精氨酸生物合成、丙氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢途径。

2、靶向代谢组学分析：

(1)代谢物提取方法：

分别取接菌(禾谷镰刀菌PH-1)0、3、6、9天后的苏麦3号和山农20号的小穗，将小穗样品磨碎后，加入提取液无菌水，超声10min，13000prm离心5min，取上清转移至一新离心管内，进样前通过0.22μm的滤膜过滤后即可上样。

(2)UPLC-QQQ-MS的液相和质谱条件：

液相条件：色谱柱：Thermo HYPERSIL GOLD C18色谱柱(2.1×150，1.7μm)；柱温：35℃；流动相：A：0.1％甲酸溶液，B：甲醇；洗脱梯度：0-0.2min，A＝90％；0.2-6min，A递减至10％；6-8min，A＝10％；8.1min，A递增至90％；8.1-10min，A＝90％；进样体积：3μl。

质谱条件：正离子模式：喷雾电压：3.8kv；鞘气：40；辅助气：10；离子传输管温度：350℃。微扫数：1；AGC target:2e5。

表1：

(3)数据分析方法：

外标法是通过测定目标性化合物在不同浓度水平的峰面积，以峰面积的值绘制标准曲线。采用外标法对抗感病品种的小麦接菌第0，3，6，9天的穗部进行氨基酸的绝对定量。

结果如图4所示，由图4可以看出：脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、蛋氨酸(Met)、精氨酸(Arg)、半胱氨酸(Cys)含量随着时间的延长含量呈增长趋势。而在苏麦3号的抗性品种中，脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、蛋氨酸(Met)含量都高于易感品种山农20中的含量，甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、半胱氨酸(Cys)含量低于易感品种山农20中的含量，可能这6种化合物在造成小麦赤霉病抗感差异过程中起着重要作用。

实施例3：外施不同种类氨基酸对小麦感染赤霉病的影响

1、试验方法：

以敏感型小麦山农20为试验材料，首先将种子在4℃条件下放置24小时后转移到常温下萌发出芽，在16h光照、8h黑暗条件下进行培养。取三叶期小麦的第二片叶，切至4厘米长，将离体叶片的两端浸入10mM氨基酸(甘氨酸、蛋氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸和半胱氨酸)中24小时，以水作为对照处理。然后，在叶片近轴面中间位置轻轻戳出一个伤口，在小麦叶片上接种禾谷镰刀菌PH-1(3μL)。3天之后，观察并拍照记录叶片上的病斑面积，统计数据进行显著性分析。

为了进一步验证外源氨基酸对小麦穗部的影响，对扬花期小麦叶片和穗部喷施10mM氨基酸(丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸)，喷施量为20ml/盆；以水作为对照处理。24小时后，在距离基部第三个小穗上接种10μL禾谷镰刀菌，然后将穗部装入袋子以保持水分，3天后将袋子丢弃。在7和14天后，观察并拍照记录小麦穗部的感病表型，统计病穗数进行显著性分析。用qRT-PCR检测感病小麦穗部的相对菌量，测定了禾谷镰刀菌DNA(GAPDH，正向引物：5′-AAGTTCTACTCTGAGCGTGACCC-3′,反向引物:5′-TTGGAGGAAGGACCATCGAC-3′)与小麦DNA(β-actin，正向引物：5'-GCAAAGAGATCACGGCCCTT-3'，反向引物：5'-GCA ACTTCCACACTTGAGAGG-3')的比例，所有这些试验至少独立重复三次。

2、试验结果：

试验结果如图5所示。由图5可以看出：外施不同种类的氨基酸对小麦感染赤霉病后的防治效果存在显著的差异，其中，脯氨酸和丙氨酸对小麦感染赤霉病后能够起到很好的防治效果；而甘氨酸、蛋氨酸、精氨酸、半胱氨酸等种类的氨基素不能起不到防治效果，反而会加重小麦感染赤霉病后的病情。

实施例4：外施脯氨酸、丙氨酸及其组合物对小麦感染赤霉病的影响

1、试验方法：

在小麦扬花期，对每盆感病品种Fielder分别喷施水、10mM脯氨酸水溶液、10mM丙氨酸水溶液、组合物水溶液(由10mM脯氨酸水溶液和10mM丙氨酸水溶液按体积比1:1配制而成)各20毫升，24小时以后采用单花滴注法进行赤霉病抗性实验。在小麦开花期在穗顶部第三个小穗的左右两个基部小花上各接种10μL禾谷镰刀菌PH-1(浓度为每亳升1-5×10⁵个)，并套袋保湿，3天后拆袋，在之后的7天和14天观察并记录赤霉病的发病情况，并对统计数据进行显著性分析。

2、试验结果：

试验结果如图6所示，由图6可以看出：外源喷施10mM丙氨酸水溶液对小麦赤霉病的防治效果最优。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东国仓健生物科技有限公司，山东农业大学

<120> 脯氨酸和丙氨酸在防治小麦赤霉病中的应用

<130> 2021

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagttctact ctgagcgtga ccc 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttggaggaag gaccatcgac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcaaagagat cacggccctt 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcaacttcca cacttgagag g 21

Claims (2)

1.丙氨酸在制备抑制禾谷镰刀菌在小麦穗部增殖的药剂中的应用。

2.一种防治小麦赤霉病的方法，其特征在于，包括以下步骤：

在小麦扬花期将丙氨酸溶液均匀喷施于小麦的穗部和叶面；

所述丙氨酸溶液的浓度均为10mM。

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