CN116473060B - 一种防治稻瘟病的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治稻瘟病的药物。该药物有效成分包括黄芩苷。本发明研究显示，黄芩苷能干扰稻瘟病菌分生孢附着胞的形成，抑制稻瘟病菌的致病力、抑制稻瘟病菌侵染水稻，并且抑制稻瘟病菌生长，可用于防控稻瘟病菌及其引起的病害。而且，黄芩苷对环境、人体和植物均无毒害作用，以及低浓度亦效果优异，产生耐药性的风险极低，是一个理想的防控稻瘟病菌的药物，有成为防控农作物病害的一种新型绿色高效的稻瘟病防控药剂的巨大价值。
Description
技术领域
本发明属于生物与农药技术领域。更具体地，涉及一种防治稻瘟病的药物。
背景技术
稻瘟病，是由稻瘟病菌引起的、发生在水稻的一种严重影响产量的病害。稻瘟病的防治方法主要有选用抗病品种、培育优质秧苗、加强田间管理、化学药剂控制等。其中，使用化学药剂控制稻瘟病是最常见和最有效的方式，目前主要的药剂包括苯菌灵、三环唑、异丙硫脲和抗生素（如杀稻瘟菌素和春雷霉素）。但多年的使用表明，化学药剂产生耐药性的风险较高。
目前的研究显示，天然植物来源成分在耐药性问题上表现出更好的优势。专利CN101971867B公开了一种治疗稻瘟病的药物，由丙硫咪唑10%~20%、中草药提取液70%~75%、助剂5%~30%组成，其中所述中草药提取液是采用中草药材板蓝根、黄芩、连翘按照1：1：1的质量配比，混合后用65%酒精提取的提取液。该专利宣称药物不易产生抗性，但实际上，该药物最主要的有效成分还是化学成分丙硫咪唑，经过计算丙硫咪唑的质量浓度高达10%（10g/100g）；且在该药物中，中草药成分发挥什么作用、具体有效成分均不清楚。
因此，开发成分明确、效果优异、且耐药性风险低的稻瘟病防治药物具有重要的价值和意义。
发明内容
本发明旨在为防治稻瘟病提供一种新的耐药性风险低、防控效果优异的药物新选择。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明研究显示，黄芩苷能干扰稻瘟病菌分生孢附着胞的形成，阻断稻瘟病菌侵染水稻叶鞘细胞过程中所引起的ROS和Fe3+的响应；抑制稻瘟病菌的致病力、抑制稻瘟病菌侵染水稻，并且抑制稻瘟病菌生长，可用于防控稻瘟病菌及其引起的病害。而且在低浓度下就显示出优异的作用效果，在不直接杀灭稻瘟病菌的情况下，阻断稻瘟病菌侵染水稻，产生耐药性的风险极低，是一个理想的防控稻瘟病菌的药物。
因此，本发明要求保护如下方案：
一种有效成分包括黄芩苷的防治稻瘟病的药物。
该药物还可包括药学上可接受的载体，制备成不同的剂型。
黄芩苷在防治稻瘟病方面的应用。
黄芩苷在制备稻瘟病防治产品中的应用。
黄芩苷在抑制稻瘟病菌方面的应用。
黄芩苷在制备能够抑制稻瘟病菌的产品中的应用。
黄芩苷在抑制稻瘟病菌致病力或抑制稻瘟病菌生长方面的应用。
黄芩苷在制备能抑制稻瘟病菌致病力或抑制稻瘟病菌生长的产品中的应用。
黄芩苷在抑制稻瘟病菌侵染水稻方面的应用。
黄芩苷在制备能够抑制稻瘟病菌侵染水稻的产品中的应用。
黄芩苷在防治稻瘟病菌引起的病害方面的应用。
黄芩苷在制备稻瘟病菌引起病害的防治产品中的应用。
黄芩苷在干扰稻瘟病菌分生孢附着胞形成方面的应用。
黄芩苷在制备能够干扰稻瘟病菌分生孢附着胞形成的产品中的应用。
所述产品可为药物或肥料。
在实际应用中，黄芩苷浓度不低于50 μM。
另外，为了达到更好的效果，建议黄芩苷浓度不低于80 μM。
更优选地，黄芩苷浓度不低于100 μM。
另外，综合考虑成本、耐药性风险、病害程度等因素，建议如下：
建议黄芩苷浓度控制在80 μM~500 μM范围内。
或，建议黄芩苷浓度控制在100 μM~500 μM范围内。
或，建议黄芩苷浓度控制在80 μM~200 μM范围内。
或，建议黄芩苷浓度控制在100 μM~200 μM范围内。
本发明具有以下有益效果：
本发明研究显示，黄芩苷能干扰稻瘟病菌分生孢附着胞的形成，阻断稻瘟病菌侵染水稻叶鞘细胞过程中所引起的ROS和Fe3+的响应；抑制稻瘟病菌的致病力、抑制稻瘟病菌侵染水稻，并且抑制稻瘟病菌生长，可用于防控稻瘟病菌及其引起的病害。
而且，黄芩苷对环境、人体和植物均无毒害作用，以及低浓度亦效果优异，在不直接杀灭稻瘟病菌的情况下，阻断稻瘟病菌侵染水稻，产生耐药性的风险极低，是一个理想的防控稻瘟病菌的药物，有成为防控农作物病害的一种新型绿色高效的稻瘟病防控药剂的巨大价值。
附图说明
图1显示黄芩苷干扰了稻瘟病菌附着胞的形成。图中，A：黄芩苷浓度0、50、100、200和500 μM，在疏水玻片上诱导分生孢子萌发并形成附着胞，于6 h和24 h观察并拍照，统计6h的附着胞形成率，标尺=10µm。B：黄芩苷不同浓度对稻瘟病菌菌丝生长的影响，接种后第7天观察和拍照。
图2显示黄芩苷抑制稻瘟病菌的致病力。图中，A：水稻叶鞘接种，WT：对照组，分生孢子悬浮液的浓度105个/ml，0.5% DMSO；Bac：黄芩苷处理组（100 μM），接种48h后观察；Water，清水作为阴性对照；BF：明场；GFP：绿色荧光蛋白，标尺=10µm。B：水稻离体叶片接种，离体叶片接种7天后观察病斑形成并拍照。
图3显示黄芩苷对稻瘟病菌的防治效果。图中，WT：对照组，分生孢子悬浮液的浓度105个/ml；WT+Bac：分生孢子加入100 μM黄芩苷；Water：清水处理。
图4显示黄芩苷影响了稻瘟病菌侵染水稻过程中ROS和铁离子的积累。DAB和普鲁士蓝染色检测分生孢子接种水稻叶鞘在48h的胞内ROS和铁离子积累，分生孢子分别用0.5%DMSO对照组（WT）和100µM黄芩苷（Bac）处理，PBD为普鲁士蓝染色，箭头为侵染菌丝，标尺=10µm。
图5显示黄芩苷抑制分生孢子萌发的脂滴分解；荧光图片显示出有和没有黄芩苷处理下的分生孢子发育过程中脂滴分布，WT：对照组，0.5% DMSO；WT+Bac：黄芩苷处理组（100 μM），Nile red：尼罗红染色，BF：明场，标尺=10 μm。
图6显示黄芩苷影响稻瘟病菌附着胞形成过程中的分生孢子死亡；A： HistoneH1-GFP标记观察稻瘟病菌分生孢子的细胞核（箭头所示）。B：统计对照组和黄芩苷处理组的分生孢子死亡率。柱状图根据（A）结果统计，3次独立重复实验，每次100个分生孢子。**：处理与对照组之间具有统计学极显著差异（P<0.01）。WT：对照组，0.5% DMSO；Bac：黄芩苷处理组（100 μM）。
图7显示黄芩苷延缓分生孢子萌发的自噬过程；荧光图片显示出有和没有黄芩苷处理下的分生孢子发育过程中GFP-Atg8的亚细胞定位，WT：对照组，0.5% DMSO；WT+Bac：黄芩苷处理组（100 μM）；GFP：绿色荧光；BF：明场，标尺=10 μm。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明研究来自基金项目：广东省农业科学院科技人才引进专项资金项目(R2022YJ-YB3017)。
以下实施例中所用的稻瘟病菌WT菌株为稻瘟病菌B157，来源华南农业大学。该菌已公开披露在文献《Meiling Liang,etal.,Tangeretin inhibits fungal ferroptosisto suppress rice blast [J] Journal of Integrative Plant Biology.2021》（https://doi.org/10.1111/jipb.13175）。以下实施例中所用的表达Histone H1-GFP标记的稻瘟病菌（即稻瘟病菌Histone H1-GFP菌株），以及表达GFP-Atg8标记的稻瘟病菌（即稻瘟病菌GFP-Atg8菌株），已公开披露在文献《Meiling Liang,etal.,Tangeretin inhibitsfungal ferroptosis to suppress rice blast [J]Journal of Integrative PlantBiology.2021》（https://doi.org/10.1111/jipb.13175）。
黄芩苷CAS号 21967-41-9，结构式如下：
PA培养基，即Prune-agar，每升培养基包含：40 ml 西梅（Prune）果汁，2.5 g乳糖，2.5 g蔗糖，1 g酵母提取物，20 g琼脂粉，PH=6.5。
实施例1黄芩苷干扰稻瘟病菌附着胞的形成
1、黄芩苷对稻瘟病菌附着胞形成的影响
收集PA培养基平板培养的稻瘟病菌WT的分生孢子，分生孢子悬浮液的浓度调至105个/ml，测试稻瘟病菌分生孢子萌发对不同浓度梯度黄芩苷的敏感性。
0~500 μM（0、50、100、200和500 μM）黄芩苷分别加入到分生孢子悬浮液后，取20 μl放置疏水玻片，置于28℃培养箱黑暗培养，培养6 h后在光学显微镜观察附着胞的形成情况并拍照。
诱导6 h后，0 μM黄芩苷处理下附着胞形成率达到90%以上，50 μM黄芩苷处理下附着胞形成率降至80%以下（约77%），100 μM与200 μM黄芩苷处理下附着胞形成率都在10%以下，而500 μM黄芩苷处理下的完全不能形成附着胞（图1）。另外，这些浓度黄芩苷处理的分生孢子继续培养24 h后，稻瘟病菌的附着胞形成部分恢复（图1），这一结果说明这些浓度黄芩苷没有直接杀灭稻瘟病菌，是通过干扰附着胞正常形成即可防稻瘟病害了，不易产生耐药性。
2、黄芩苷对稻瘟病菌营养菌丝的生长影响
进一步通过检测不同浓度黄芩苷对营养菌丝的生长影响，我们将稻瘟病菌WT的菌块分别接种在已混合0~500 μM（0、50、100、200和500 μM）黄芩苷的PA培养基平板上，置于28℃培养箱黑暗培养，培养7天后观察菌落生长情况并拍照。结果显示，500 μM显著抑制了稻瘟病菌的生长，但50、100和200 μM的平板上的菌株生长没有显著被抑制。
综上，研究结果表明黄芩苷能够抑制稻瘟病菌附着胞形成、抑制稻瘟病菌生长；而且，不同浓度下效果有差异，50 μM黄芩苷即已表现出抑制稻瘟病菌附着胞形成的作用，100μM浓度下附着胞形成率降至10%以下，且在此浓度下不会直接杀灭稻瘟病菌，不会影响稻瘟病菌的菌丝生长。
因此，较低浓度的黄芩苷（优选100 μM~200 μM）即能显著干扰稻瘟病菌附着胞正常形成，而附着胞形成是稻瘟病菌侵染水稻的关键因素，因此，较低浓度黄芩苷即可实现抑制稻瘟病菌侵染的作用，且不直接杀灭稻瘟病菌，产生耐药性的风险极低。而500 μM黄芩苷不仅抑制稻瘟病菌附着胞形成，抑制稻瘟病菌侵染，还显著的影响稻瘟病菌的菌丝生长，因此作为稻瘟病防治药物效果更加强劲。因此，黄芩苷可作为一个理想的稻瘟病防治药物。
实施例2黄芩苷抑制稻瘟病菌的致病力
为了确定黄芩苷干扰附着胞的形成是否影响稻瘟病菌的致病性，我们用易感病水稻CO39分别进行了叶鞘和离体水稻叶片定量接种稻瘟病菌分生孢子的侵染致病试验，以及活体水稻苗盆栽接种试验。
1、黄芩苷处理的离体水稻叶鞘接种试验
培养至三叶一心阶段的水稻苗，剪取5 cm的叶鞘，分生孢子悬浮液调至浓度105个/ml，将100 μM黄芩苷和孢子悬浮液、不加黄芩苷的对照组孢子悬浮液注射入叶鞘内。接种离体叶鞘放置于黑暗的培养箱28℃条件下培养48 h，在显微镜下拍照并记录发病情况。
在水稻叶鞘中接种的结果，对照组中稻瘟病菌Cyto-GFP菌株（绿色荧光蛋白标记WT菌株分生孢子的细胞质）的分生孢子在侵染水稻叶鞘细胞后，从初始侵染部位向周围细胞蔓延；而用100μM黄芩苷处理WT的分生孢子，黄芩苷处理下稻瘟病菌的分生孢子在叶鞘细胞形成侵染菌丝能力下降，其侵染菌丝没有向周边细胞扩展（图2中A）。
2、黄芩苷处理的离体水稻叶片接种试验
培养至三叶一心阶段的水稻苗，剪取5 cm的叶片，分生孢子悬浮液调至浓度105个/ml，加入浓度0.05% tween-20，分别将加入100 μM黄芩苷的孢子悬浮液、不加黄芩苷的对照组的孢子悬浮液各吸取20 μl滴至叶片上，叶片上等间距滴入3-5滴孢子悬浮液。将接种离体叶片放置于培养箱中进行保湿、黑暗培养24 h后，以光照/黑暗各12 h的条件下培养，第7天进行拍照并记录发病情况。
在水稻离体叶片接种的结果，对照组处理的水稻叶片形成了典型的黄色晕圈梭形的病斑，而用100μM黄芩苷处理组，病斑都是明显丧失或者减少，可有效抑制稻瘟病菌引起的叶片病斑形成（图2中B）。
结果表明，在叶鞘接种和离体叶片侵染的实验条件下，黄芩苷能显著抑制稻瘟病病菌的侵染。
3、黄芩苷处理的活体水稻苗接种试验为了进一步明确黄芩苷对稻瘟病菌的防治效果，我们进行了水稻苗盆栽喷雾接种，将稻瘟病菌WT分生孢子接种于易感病水稻苗CO39上，测试黄芩苷在活体水稻苗接种条件下对病斑形成是否同样具有抑制作用。
培养至三叶一心阶段的水稻苗，收集分生孢子并将悬浮液浓度调至105个/ml，分生孢子悬浮液加入浓度0.05%吐温-20，处理组含100 μM黄芩苷，对照组加相同体积的溶剂。处理组与对照组的孢子悬浮液分别喷洒在水稻苗叶片上。接种后的水稻苗放置在培养箱中于保湿、黑暗条件下培养24 h后，以光照/黑暗各12 h的条件下培养，第7天进行拍照并记录发病情况。
结果表明，喷雾接种的水稻苗，在黄芩苷处理条件下形成少量或不形成病斑；而非处理组的病斑很明显（图3）。
综上所述，黄芩苷能显著抑制稻瘟病病菌的侵染，有效抑制稻瘟病菌在水稻叶片形成病斑，因此可用于稻瘟病的防治。
实施例3黄芩苷阻断了水稻叶鞘细胞中ROS和Fe3+的积累
为了明确黄芩苷在稻瘟病菌侵染水稻过程中的影响，我们用DAB和普鲁士蓝染色分别观察稻瘟病菌侵染水稻叶鞘后的ROS和Fe3+的积累。
培养至三叶一心阶段的水稻苗，剪取5 cm的叶鞘，接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液，分生孢子悬浮液浓度调至105个/ml，注射孢子悬浮液进入叶鞘中，28℃黑暗保湿的培养箱进行静置培养48 h，分别用DAB检测叶鞘细胞中ROS的含量，普鲁士染色检测叶鞘细胞中的铁离子含量，方法参考已报道的文献（Dangolet al., 2019）。染色结果在光学显微镜下观察并拍照。
在黄芩苷处理的稻瘟病菌分生孢子侵染水稻叶鞘中，发现叶鞘细胞中的ROS和Fe3+的积累与对照组相比明显减弱（图4），表明黄芩苷干扰了稻瘟病菌的正常形成附着胞，从而阻断了稻瘟病菌侵染水稻叶鞘细胞过程中所引起的ROS和Fe3+的响应。
实施例4黄芩苷抑制稻瘟病菌脂滴的分解
为了研究黄芩苷是否干扰了脂滴的分解，我们进行了尼罗红染色，在荧光显微镜下观察对照组与黄芩苷处理组（100 μM）的分上孢子萌发过程的脂滴分解情况。
收集PA平板培养菌株的分生孢子，分生孢子悬浮液的浓度调至105个/ml，20 μl液滴置于疏水玻片上28℃的黑暗诱导萌发6 h。将2.5 μg/ml尼罗红染料加入后，黑暗染色5min后在荧光显微镜的RFP通道观察与拍照。
结果显示（图5），在诱导8h后，对照组的分生孢子内的脂滴出现大部分的分解，而处理组中的仍然有大量的脂滴存在。说明了黄芩苷在干扰附着胞形成的过程中，也抑制了分生孢子萌发的脂滴分解。
实施例5黄芩苷影响稻瘟病菌附着胞形成过程中的分生孢子死亡
将表达Histone H1-GFP标记的稻瘟病菌的分生孢子悬浮液浓度调至105个/ml，置于疏水玻片上诱导萌发、诱导附着胞形成，处理组通过黄芩苷处理稻瘟病菌Histone H1-GFP菌株的分生孢子。15 h后通过显微镜的GFP荧光通道观察分生孢子细胞核情况并拍照，统计分生孢子死亡率。
对照组的分生孢子死亡率超过60%，而黄芩苷处理的分生孢子死亡率显著降低到10%以下（图6）。这一结果揭示了黄芩苷干扰稻瘟病菌附着胞形成的原因可能是抑制了分生孢子的程序性死亡。
实施例6黄芩苷对自噬在附着胞形成过程中的影响
我们利用表达GFP-Atg8作为自噬标记物的菌株检测黄芩苷对自噬在稻瘟病菌附着胞形成过程中的影响。
将表达GFP-Atg8标记的稻瘟病菌的分生孢子悬浮液浓度调至105个/ml，置于疏水玻片上诱导萌发，处理组通过黄芩苷处理稻瘟病菌GFP-Atg8菌株的分生孢子。6 h后通过显微镜的GFP荧光通道观察并拍照，统计分生孢子细胞死亡情况。
在分生孢子萌发6 h，对照组的GFP-Atg8在分生孢子细胞的液泡大量积累，在芽管和初形成的附着胞里还有少量的点状自噬小体（图7），而黄芩苷处理下的自噬小体主要积累在细胞质中，有部分进入液泡中（图7）。表明了黄芩苷能延缓自噬小体进入液泡中，这有助于黄芩苷抑制稻瘟病菌的附着胞形成和功能。总的来说，我们的研究结果表明了，黄芩苷直接或者间接影响了稻瘟病菌分生孢子形成附着胞过程中的自噬降解。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1. 黄芩苷作为唯一有效成分在干扰稻瘟病菌B157分生孢附着胞形成方面的应用，或在制备干扰稻瘟病菌B157分生孢附着胞形成的产品中的应用，其特征在于，所述黄芩苷的使用浓度或在产品中的浓度为100 μM~200 μM。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述产品为药物或肥料。
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