CN105176841B - 一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法,提出“单叶内生真菌分布”概念，“尺度限制性沙磨”和“约束性散接培养”两种技术方法，以期完善艾纳香植物叶片内生真菌对植物叶片的生理生化和代谢产物产生怎样影响的研究，改善和解决现有方法中存在的某些菌种丢失的缺陷和培养过程中真菌生长相互干扰等问题。本发明提供的艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法,操作简单快捷,试验材料简单易得，成本较低。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别是指一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法。
背景技术
植物内生菌是指生活在健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，在其生活过程中宿主植物不表现出外在的病症，植物与其内生菌属于互惠共生的关系。植物为内生菌提供光合产物和矿物质，而内生菌的代谢产物则能刺激植物的生长发育，提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力。植物内生真菌通过“共生”现象，对寄主植物的生理生化和次生代谢产物产生影响，是天然产物的重要来源。由于将植物内生菌作为生防因子具有独特的优势：它们分布于植物的不同组织中，受到植物组织的保护，具有稳定的生态环境，与附生菌相比更易于发挥生防作用，因此，有关植物内生菌的研究正成为国内外环境、生物、化学等领域的焦点。
现有内生菌分离技术主要是将植物组织直接消毒后，通过组织切片培养、内生菌浸出涂布培养和植物组织培养后内生菌浸出涂布培养等方式。因存在很多内生菌可能仍然存在植物组织中未被分离，因而，常常导致所分离获取的植物内生菌种类和数量降低。目前，为了克服上述技术缺陷，造成植物内生真菌释放不充分，如中国发明专利CN103122331A公开的一种植物内生菌的分离方法，中国发明专利CN104250616A公开的一种植物内生菌的分离方法，均有采用组织研磨方法进行培养，但在实际操作中，对植物组研磨处理往往采取的是经验值，并未充分考虑到不同植物或植物的不同组织，在不同的生育期因其结构或生理特性的不同而造成的处理效果特异性，造成不合适的机械外力操作导致菌株细胞损伤或使得内生真菌不能充分释放出来，因而，常常导致所分离获取的植物内生菌种类和数量降低。另外，含菌液涂布培养过程中，若浓度过高而出现真菌生长相互干扰的问题；若浓度过低而出现消耗大量培养基，增加人力和物力成本。
艾纳香(Blumea flavanones)为菊科艾纳香属植物,具有镇痛、发汗、祛风除湿、祛痰止咳、通经止血等功效。其属重要中药材之一，药物价值较高；因此，研究艾纳香植物内生真菌对艾纳香植物生理生化和代谢产物影响，对研究艾纳香植物种植和病虫害防治以及其他基础性研究将具有重要意义。目前，国内外以艾纳香植物叶片作为材料分离内生真菌菌株的研究较为少见，技术尚未成熟。
本发明为更好地考查艾纳香单个叶片为单位的内生真菌的分布状况，采用完整叶片全培养的方式，为内生真菌对植物叶片的生理生化和代谢产物产生怎样的影响提供进一步研究的基础；提出了以限制尺寸的细沙为辅助材料共同研磨、采用改善植物组织的破碎程度和颗粒的均匀度的“尺度限制性沙磨”技术，和以接种针挑取、在约束范围内尽量散开接种的“约束性散接培养”方式，针对现有方法中存在的某些菌种丢失的缺陷或培养过程中真菌生长相互干扰等问题，提出进一步完善或解决方案。
发明内容
本发明针对现有植物叶片内生真菌的分离方法中存在的某些菌种丢失的缺陷或培养过程中真菌生长相互干扰等现有技术的不足，提供了一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法。
所述技术方案如下：
一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)艾纳香植物叶片组织的准备：采集、保存艾纳香植物健康叶片；
(2)艾纳香植物叶片组织的表面消毒和无菌检测：将新鲜的艾纳香植物叶片样品用流动清洁水冲洗干净，放入超净工作台内；然后无菌水冲洗2-3次，用75％的酒精消毒2-3min；再用无菌水冲洗2-3次，0.1％的升汞浸泡2-3min，最后用无菌水冲洗3次；将最后一次冲洗用的无菌水，分别汲取3次，按每次0.5mL平铺在3个PDA培养基上，置于恒温培养箱内，28℃黑暗条件下培养7天，无任何菌株生长；
(3)艾纳香植物叶片组织内生真菌的分离：在无菌条件下，剪去叶柄，再将叶片剪成小片，放入研钵，混入灭菌细沙，加入无菌水，共同研磨至粘稠状，得到植物组织、灭菌细沙和无菌水的混合物；用接种针挑取混合物至培养基接种后，置于恒温培养箱中培养3-10天，进一步纯化，得到内生真菌纯菌株。
进一步地，步骤(1)中叶片的采集是从叶柄与茎连接处剪下，并用保鲜膜封缠剪切面；
步骤(1)中叶片的保存是将采集的样品平整、无折皱、无挤压放入自封口袋中，4℃保存；
步骤(1)中健康叶片是指完整叶片，无虫咬、无机械损伤和无菌斑。
进一步地，步骤(2)中叶片组织的表面消毒优选用75％的酒精消毒2min，0.1％的升汞浸泡2min；
步骤(2)中流动清洁水冲洗是采用水流方向与叶面平行与地面垂直的垂直平行冲洗方式，出水口距离冲洗点高度15cm，冲洗流量为2L/min，冲洗面积为50cm2，冲洗时间为5min。
进一步地，步骤(3)中研磨使用“尺度限制性沙磨”技术：所用叶片大小为0.5×0.5cm2，灭菌细沙颗粒大小为通过100目筛同时200目筛截留的细沙，叶片、细沙和无菌水的比例为1:3:2；
步骤(3)中混合物采用人力手工研磨；
步骤(3)中真菌培养使用“约束性散接培养”技术：挑取植物组织、细沙和水混合物体积0.5×0.5×0.2cm3；接种面积1cm2；混合物在约束面积内均匀铺开；
步骤(3)中真菌培养使用PDA培养基。
本发明的有益效果：
(1)提出“单叶内生真菌分布”概念，主要针对植株叶片，不进行任何修剪，采用完整叶片全培养的方式，更好地考查以单个叶片为单位的生长环境内的内生真菌的分布状况，为内生真菌对植物叶片的生理生化和代谢产物产生怎样的影响提供进一步研究的基础；
(2)该方法主要采用限制尺寸的细沙为辅助材料进行共同研磨，改善植物组织的破碎程度和颗粒的均匀度的“尺度限制性沙磨”技术；和以接种针挑取，在约束范围内尽量散开接种的“约束性散接培养”方式，解决了组织研磨过程植物内生真菌受损及不能充分释放以及培养过程中的问题。同时，有利于增加植物组织与培养基的接触面积，提高菌种与培养基的接触几率，改善菌种初期的营养利用环境，缩短菌株生长周期中的调整期，又给菌株提供相对独立的生长空间，为后续的菌株纯化提供方便。
进一步地，为了更具体地说明本发明的技术方案，本发明还作出了如下部分试验，旨在进一步说明本发明，而不是对本发明的限定。
试验例：
本发明人通过大量的研究试验发现，影响艾纳香植物叶片内生真菌分离效果的因素主要有：叶片处理方式、培养方式、培养基的选择等，本发明采取择优原则，进行了如下的筛选试验：
试验1：组织研磨培养分离的方法考察
采用采集自贵州省罗甸县红水河镇的同一植株相邻、大小相似的艾纳香植物叶片，采用本发明培养分离的方法进行培养，按照如下不同的叶片组织研磨的方式进行试验，结果如下表1：
表1：组织研磨培养分离艾纳香植物组织内生真菌的考察
上述试验表明：影响艾纳香植物组织内生真菌分离效果与组织研磨的物料比例及细沙尺寸有关，其物料比例、灭菌细沙尺寸是叶片组织研磨是否充分与叶片组织内生真菌是否遭到破坏的关键控制点，其中试验组3，其叶片、细沙和无菌水比例为1:3:2，灭菌细沙尺寸为过100目筛，同时200目筛截留最佳。因此，
作为本发明的优选方案。
试验2：不同接种方式培养考察试验
采用采集自贵州省罗甸县红水河镇的同一植株相邻、大小相似的艾纳香植物叶片，进行内生真菌分离培养，按照如下不同接种培养方式进行培养试验，结果如下表2：
表2：培养基考察试验结果
上述试验表明：不同的接种方式会对内生真菌分离培养造成影响，组织切片培养及组织研磨后，菌液涂布接种培养方式，操作过程难以控制，容易造成培养过程中真菌互相干扰难以鉴别及分离，本发明采用约束性散接培养方法，真菌分离培养效果最佳，并且有利于增加植物组织与培养基的接触面积，提高菌种与培养基的接触几率，改善菌种初期的营养利用环境，缩短菌株生长周期中的调整期，方法简单，又能节约成本。
试验组3：内生真菌不同培养分离方式的考察
采用采集自贵州省罗甸县红水河镇的艾纳香植物叶片，同一植株相邻、大小相似的两枚叶片，通过组织切片培养和本发明方法培养进行对比，具体试验步骤如下：
(1)组织切片培养法
①艾纳香植物叶片组织的准备：采集、保存艾纳香植物健康叶片。
②艾纳香植物叶片组织的表面消毒和无菌检测：将新鲜的艾纳香植物叶片样品用流动清洁水冲洗干净，放入超净工作台内。然后无菌水冲洗2次，用75％的酒精消毒2min；再用无菌水冲洗2次，0.1％的升汞浸泡2min，最后用无菌水冲洗3次。将最后一次冲洗用的无菌水，分别汲取3次，按每次0.5mL平铺在3个PDA培养基上，置于恒温培养箱内，28℃黑暗条件下培养7天，无任何菌株生长。
③艾纳香植物叶片组织内生真菌的分离：在无菌条件下，用剪刀剪去叶柄，再将叶片剪成小片，每片约0.5×0.5cm2，用接种针挑至PDA培养基接种培养，每只培养皿接8片。置于恒温培养箱中28℃黑暗条件下培养5-14天，进一步纯化，得到内生真菌纯菌株。
(2)本发明培养方法
①艾纳香植物叶片组织的准备：采集、保存艾纳香植物健康叶片。
②艾纳香植物叶片组织的表面消毒和无菌检测：将新鲜的艾纳香植物叶片样品用流动清洁水冲洗干净，放入超净工作台内。然后无菌水冲洗2次，用75％的酒精消毒2min；再用无菌水冲洗2次，0.1％的升汞浸泡2min，最后用无菌水漂洗3次。将最后一次漂洗用的无菌水，分别汲取3次，按每次0.5mL平铺在3个PDA培养基上，置于恒温培养箱内，28℃黑暗条件下培养7天，无任何菌株生长。
③艾纳香植物叶片组织内生真菌的分离：在无菌条件下，用剪刀剪去叶柄，再将叶片剪成小片，放入研钵，混入灭菌细沙(尺度为过100目筛同时被200目筛截留)，加入无菌水，使叶片、细沙、无菌水比例为1:3:2；共同研磨，至粘稠状，得到植物组织、灭菌细沙和无菌水混合物样品。用接种针挑取混合物样品至PDA培养基，每只培养皿接种8个，接种后，置于恒温培养箱中28℃黑暗条件下培养3天，进一步纯化，得到内生真菌纯菌株。其试验结果如下：
表3：叶片质量对比
| 方法 | 质量(g) |
| 组织切片法 | 1.53 |
| 本发明方法 | 1.47 |
表4：分离得到的菌株数量对比
| 方法 | 真菌菌株数(株) |
| 组织切片法 | 23 |
| 本发明方法 | 38 |
表5：培养周期对比
| 方法 | 培养周期(天) |
| 组织切片法 | 5-14 |
| 本发明方法 | 3-10 |
表6：使用的培养培养皿数
| 方法 | 使用培养皿(Ф90mm)数(个) |
| 组织切片法 | 25 |
| 本发明方法 | 10 |
上述试验表明：
①同一植株，相邻部位，质量相近，有一定的可比性；
②分离菌株数量方面，本发明方法是组织切片法的1.65倍，说明采用完整叶片，比部分叶片获得的组织更完整，本发明方法更有利于内生真菌菌株的生长；
③在使用培养培养皿的数量上，组织切片法是本发明方法使用数量的2.5倍，在节约成本方面本发明方法有优势；
④培养周期方面，本发明方法比组织切片法用时短，分析原因应该是本发明方法中组织破碎颗粒度小、均匀，有利于缩短菌株生长周期中的调整期。
综合试验结果，本发明方法优于组织切片培养分离，在艾纳香植物叶片内生真菌分离方法中是一种优良的方法。
附图说明
图1：本发明培养图
图2：组织切片培养图
具体实施方式
以下实施方式旨在进一步说明本发明，而不是对本发明的限定。
实施例1：本发明培养方法
①艾纳香植物叶片组织的准备：采集、保存艾纳香植物健康叶片。
②艾纳香植物叶片组织的表面消毒和无菌检测：将新鲜的艾纳香植物叶片样品用流动清洁水冲洗干净，放入超净工作台内。然后无菌水冲洗2次，用75％的酒精消毒2min；再用无菌水冲洗2次，0.1％的升汞浸泡2min，最后用无菌水漂洗3次。将最后一次漂洗用的无菌水，分别汲取3次，按每次0.5mL平铺在3个PDA培养基上，置于恒温培养箱内，28℃黑暗条件下培养7天，无任何菌株生长。
③艾纳香植物叶片组织内生真菌的分离：在无菌条件下，用剪刀剪去叶柄，再将叶片剪成小片，放入研钵，混入灭菌细沙(尺度为过100目筛同时被200目筛截留)，加入无菌水，使叶片、细沙、无菌水比例为1:3:2；共同研磨，至粘稠状，得到植物组织、灭菌细沙和无菌水混合物样品。用接种针挑取混合物样品至PDA培养基，每只培养皿接种8个，接种后，置于恒温培养箱中28℃黑暗条件下培养3天，进一步纯化，得到内生真菌纯菌株。
实施例2：本发明培养方法
①艾纳香植物叶片组织的准备：采集、保存艾纳香植物健康叶片。
②艾纳香植物叶片组织的表面消毒和无菌检测：将新鲜的艾纳香植物叶片样品用流动清洁水冲洗干净，放入超净工作台内。然后无菌水冲洗2次，用75％的酒精消毒3min；再用无菌水冲洗2次，0.1％的升汞浸泡3min，最后用无菌水漂洗3次。将最后一次漂洗用的无菌水，分别汲取3次，按每次0.5mL平铺在3个PDA培养基上，置于恒温培养箱内，28℃黑暗条件下培养7天，无任何菌株生长。
③艾纳香植物叶片组织内生真菌的分离：在无菌条件下，用剪刀剪去叶柄，再将叶片剪成小片，放入研钵，混入灭菌细沙(尺度为过100目筛同时被200目筛截留)，加入无菌水，使叶片、细沙、无菌水比例为1:3:2；共同研磨，至粘稠状，得到植物组织、灭菌细沙和无菌水混合物样品。用接种针挑取混合物样品至PDA培养基，每只培养皿接种8个，接种后，置于恒温培养箱中28℃黑暗条件下培养10天，进一步纯化，得到内生真菌纯菌株。
Claims (8)
1.一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)艾纳香植物叶片组织的准备：采集、保存艾纳香植物健康叶片；
(2)艾纳香植物叶片组织的表面消毒和无菌检测：将新鲜的艾纳香植物叶片样品用流动清洁水冲洗干净，放入超净工作台内；然后无菌水冲洗2-3次，用75％的酒精消毒2-3min；再用无菌水冲洗2-3次，0.1％的升汞浸泡2-3min，最后用无菌水冲洗3次；将最后一次冲洗用的无菌水，分别汲取3次，按每次0.5mL平铺在3个PDA培养基上，置于恒温培养箱内，28℃黑暗条件下培养7天，无任何菌株生长；
(3)艾纳香植物叶片组织内生真菌的分离：在无菌条件下，剪去叶柄，再将叶片剪成小片，放入研钵，混入灭菌细沙，加入无菌水，共同研磨至粘稠状，得到植物组织、灭菌细沙和无菌水的混合物；用接种针挑取混合物至培养基接种后，置于恒温培养箱中培养3-10天，进一步纯化，得到内生真菌纯菌株；
前述步骤(3)中研磨使用“尺度限制性沙磨”技术：所用叶片大小为0.5×0.5cm2，灭菌细沙颗粒大小为通过100目筛同时200目筛截留的细沙，叶片、细沙和无菌水的比例为1:3:2，混合物采用人力手工研磨；
前述步骤(3)中真菌培养使用“约束性散接培养”技术：挑取植物组织、细沙和水混合物体积0.5×0.5×0.2cm3；接种面积1cm2；混合物在约束面积内均匀铺开。
2.根据权利要求1所述的一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：步骤(1)中叶片的采集是从叶柄与茎连接处剪下，并用保鲜膜封缠剪切面。
3.根据权利要求1所述的艾纳香植物叶片内生真菌的一种分离方法，其特征在于：步骤(1)中叶片的保存是将采集的样品平整、无折皱、无挤压放入自封口袋中，4℃保存。
4.根据权利要求1所述的一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：步骤(1)中健康叶片是指完整叶片，无虫咬、无机械损伤和无菌斑。
5.根据权利要求1所述的一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：步骤(2)中叶片组织的表面消毒为采用75％的酒精消毒2min，0.1％的升汞浸泡2min。
6.根据权利要求1所述的一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：步骤(2)中流动清洁水冲洗是采用水流方向与叶面平行与地面垂直的垂直平行冲洗方式，出水口距离冲洗点高度15cm，冲洗流量为2L/min，冲洗面积为50cm2，冲洗时间为5min。
7.根据权利要求1所述的一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：步骤(3)中真菌培养使用PDA培养基。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：采用艾纳香植物整叶片进行内生真菌培养的分离方法。
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