CN107022510A - 一种植物内生菌的分离方法 - Google Patents

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靳松
徐胜光
余磊
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赵凤
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Abstract

本发明公开了一种植物内生菌的分离方法，包括以下步骤：1）、采集植物材料，无菌水洗涤；2)、表面消毒后用无菌水冲洗；3）、剪成小块后，放入装有无菌去离子水的容器中，密封容器在0‑4℃环境与25～30℃环境中交替放置4～10小时，进行内生菌浸出；4）、研磨成匀浆；5）、梯度稀后涂布，将经纯培养的单菌落移入试管斜面保存。本发明的内生菌分离方法先通过消毒有效避免混入杂菌影响内生菌分离效果；然后通过将植物材料密封容器在0‑4℃环境与25～30℃环境中交替放置4～10小时，进行内生菌浸出，充分释放植物内生菌从而有效避免了人为扩大或丢失植物内生菌的分离获得，为研究植物内生菌的种群组成特征，丰富内生菌资源具有十分重要的作用。

Description

一种植物内生菌的分离方法
技术领域
本发明涉及微生物的分离技术领域，具体为一种植物内生菌的分离方法。
背景技术
植物内生菌是指生活在健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，在其生活过程中宿主植物不表现出外在的病症，植物与其内生菌属于互惠共生的关系。植物为内生菌提供光合产物和矿物质，而内生菌的代谢产物则能刺激植物的生长发育，提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力。由于将植物内生菌作为生防因子具有独特的优势：它们分布于植物的不同组织中，受到植物组织的保护，具有稳定的生态环境，与附生菌相比更易于发挥生防作用，因此，有关植物内生菌的研究正成为国内外环境、生物、化学等领域的焦点。
植物内生菌普遍存在于植物体的各个部位且种类繁多，而人们对这些内生菌的栖息部位和种类多样性仍然知之甚少。因而，为了充分开发利用植物内生菌及其代谢产物资源，首先必须实现植物内生菌的完全、准确的分离。目前常用的分离方法均采用化学消毒剂对植物表面进行消毒处理，分离获取植物细胞内或细胞间的内生菌。这些方法尽管简便易行，减少了污染，却也使得分离获取的内生菌的数量和种类非常有限。这是由于内生菌在植物体内分布的不均匀性，导致分离的结果不能充分地代表整个植物体内生菌的数量和种类。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的分离获取的内生菌的数量和种类非常有限，结果不能充分地代表整个植物体内生菌的数量和种类的缺陷，提供一种植物内生菌的分离方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种植物内生菌的分离方法，包括以下步骤：
1）、采集健康、无病虫害的植物材料，自来水冲洗干净后再用无菌水洗涤；
2)、将采集的材料表面消毒后用无菌水冲洗，晾干表面水分后备用；消毒的方法为将采集的材料置于体积浓度70～75％乙醇消毒0.5～1min，无菌水清洗，再用体积浓度0.1～0.3％升汞浸泡0.5～1min 或者质量浓度4～6％次氯酸钠浸泡5～10min；
3）、将消毒后的植物材料用无菌工具剪成小块后，放入装有无菌去离子水的容器中，密封容器在0-4℃环境与25～30℃环境中交替放置4～10小时，进行内生菌浸出，进一步的，密封容器在0-4℃环境与25～30℃环境中交替放置的方法为先在0-4℃环境中放置20～30min，然后放入25～30℃环境中40～30min，循环4～10次，优选的，密封容器在0-4℃环境与25～30℃环境中交替放置的方法为先在0℃冰浴20min，然后放入25～30℃水浴40min，循环4～8次；
4）、取出植物材料，研磨或加入一定量的石英砂再研磨成匀浆；优选的，研磨时将植物材料的表皮去除后进行碾磨；为了确保内生菌的存活，研磨在冰浴下进行；
5）、研磨后的匀浆梯度稀释10～104 倍，各取200μL稀释液涂布后在25～30℃下平板培养24～48h，每样品重复3～5次，根据菌落表型特征的不同挑取具有代表性的单菌落，进行平板划线培养，将经纯培养的单菌落移入试管斜面保存；平板划线培养时的平板基包括内生细菌培养基、内生真菌培养基和内生放线菌培养基。优选的，内生细菌培养基为牛肉蛋白胨培养基，内生真菌培养基为PDA 培养基，内生放线菌培养基为高氏一号培养基。
本发明的内生菌分离方法先通过消毒有效除去植物材料表面细菌、真菌、放线菌以及其他微生物，从而避免混入杂菌影响内生菌分离效果；然后通过将植物材料密封容器在0-4℃环境与25～30℃环境中交替放置4～10小时，进行内生菌浸出，充分释放植物内生菌从而有效避免了人为扩大或丢失植物内生菌的分离获得，为研究植物内生菌的种群组成特征，丰富内生菌资源具有十分重要的作用。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种植物内生菌的分离方法，包括以下步骤：
1）、采集健康、无病虫害的植物材料，自来水冲洗干净后再用无菌水洗涤；
2)、将采集的材料表面消毒后用无菌水冲洗，晾干表面水分后备用；消毒的方法为将采集的材料置于体积浓度70％乙醇消毒1min，无菌水清洗，再用体积浓度0.1％升汞浸泡1min或者质量浓度6％次氯酸钠浸泡5min；
3）、将消毒后的植物材料用无菌工具剪成小块后，放入装有无菌去离子水的容器中，密封容器在4℃环境与30℃环境中交替放置4～10小时；
4）、取出植物材料，去除表皮后用无菌工具剪成小块后，研磨或加入一定量的石英砂冰浴下研磨成匀浆
5）、研磨后的匀浆梯度稀释10～104倍，各取200μL稀释液涂布后在25～30℃下平板培养24～48h，每样品重复3～5次，根据菌落表型特征的不同挑取具有代表性的单菌落，进行平板划线培养，将经纯培养的单菌落移入试管斜面保存；平板划线培养时的平板基包括内生细菌培养基、内生真菌培养基和内生放线菌培养基。
实施例2
一种植物内生菌的分离方法，包括以下步骤：
1）、采集健康、无病虫害的植物材料，自来水冲洗干净后再用无菌水洗涤；
2)、将采集的材料表面消毒后用无菌水冲洗，晾干表面水分后备用；消毒的方法为将采集的材料置于体积浓度75％乙醇消毒0.5min，无菌水清洗，再用体积浓度0.3％升汞浸泡0.5min 或者质量浓度4％次氯酸钠浸泡10min；
3）、将消毒后的植物材料用无菌工具剪成小块后，放入装有无菌去离子水的容器中，密封容器先在0℃冰浴20min，然后放入25～30℃水浴40min，循环4～8次；
4）、取出植物材料去除表皮后用无菌工具剪成小块后，研磨或加入一定量的石英砂冰浴下研磨成匀浆；
5）、研磨后的匀浆梯度稀释10～104 倍，各取200μL稀释液涂布后在25～30℃下平板培养24～48h，每样品重复3～5次，根据菌落表型特征的不同挑取具有代表性的单菌落，进行平板划线培养，将经纯培养的单菌落移入试管斜面保存；内生细菌培养基为牛肉蛋白胨培养基，内生真菌培养基为PDA 培养基，内生放线菌培养基为高氏一号培养基。
实施例3
一种植物内生菌的分离方法，包括以下步骤：
1）、采集健康、无病虫害的植物材料，自来水冲洗干净后再用无菌水洗涤；
2)、将采集的材料表面消毒后用无菌水冲洗，晾干表面水分后备用；消毒的方法为将采集的材料置于体积浓度72％乙醇消毒1min，无菌水清洗，再用体积浓度0.2％升汞浸泡0.5min 或者质量浓度5％次氯酸钠浸泡6min；
3）、将消毒后的植物材料用无菌工具剪成小块后，放入装有无菌去离子水的容器中，密封容器在2℃环境中放置25min，然后放入28℃环境中35min，循环6次；
4）、取出植物材料去除表皮后用无菌工具剪成小块后，研磨或加入一定量的石英砂冰浴下研磨成匀浆；
5）、研磨后的匀浆梯度稀释10～104 倍，各取200μL稀释液涂布后在25～30℃下平板培养24～48h，每样品重复3～5次，根据菌落表型特征的不同挑取具有代表性的单菌落，进行平板划线培养，将经纯培养的单菌落移入试管斜面保存；内生细菌培养基为牛肉蛋白胨培养基，内生真菌培养基为PDA 培养基，内生放线菌培养基为高氏一号培养基。
采用本锋芒实施例3的分离方法分离橡胶树幼嫩枝条内生菌与常规分离方法进行对比，根据菌落形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿度等特征判断分离出的菌落种类并计数，结果如表1所示：
方法 内生细菌种类数 内生真菌种类数 内生放线菌种类数 内生菌总数
本发明的分离方法 17 12 5 34
常规分离方法 26 21 8 55
由表1可知，本发明先通过消毒有效除去植物材料表面细菌、真菌、放线菌以及其他微生物，从而避免混入杂菌影响内生菌分离效果；然后通过将植物材料密封容器在0-4℃环境与25～30℃环境中交替放置4～10小时，进行内生菌浸出，充分释放植物内生菌，分离的内生菌总数比常规分离方法多61.76％，能够最大限度地避免了人为扩大或丢失植物内生菌的分离获得。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种植物内生菌的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）、采集健康、无病虫害的植物材料，自来水冲洗干净后再用无菌水洗涤；
2)、将采集的材料表面消毒后用无菌水冲洗，晾干表面水分后备用；
3）、将消毒后的植物材料用无菌工具剪成小块后，放入装有无菌去离子水的容器中，密封容器在0-4℃环境与25～30℃环境中交替放置4～10小时，进行内生菌浸出；
4）、取出植物材料研磨或加入一定量的石英砂再研磨成匀浆；
5）、研磨后的匀浆梯度稀释10～104 倍，各取200μL稀释液涂布后在25～30℃下平板培养24～48h，每样品重复3～5次，根据菌落表型特征的不同挑取具有代表性的单菌落，进行平板划线培养，将经纯培养的单菌落移入试管斜面保存。
2.如权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于，所述步骤2）中的消毒的方法为将采集的材料置于体积浓度70～75％乙醇消毒0.5～1min，无菌水清洗，再用体积浓度0.1～0.3％升汞浸泡0.5～1min 或者质量浓度4～6％次氯酸钠浸泡5～10min。
3.如权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于，所述步骤3）中所述密封容器在0-4℃环境与25～30℃环境中交替放置的方法为先在0-4℃环境中放置20～30min，然后放入25～30℃环境中40～30min，循环4～10次。
4.如权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于，所述步骤3）中所述密封容器在0-4℃环境与25～30℃环境中交替放置的方法为先在0℃冰浴20min，然后放入25～30℃水浴40min，循环4～8次。
5.如权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于，所述步骤4）中研磨时将植物材料的表皮去除后进行碾磨。
6.如权利要求5所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于，所述步骤4）中研磨在冰浴下进行。
7.如权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于，所述步骤5）中平板划线培养时的平板基包括内生细菌培养基、内生真菌培养基和内生放线菌培养基。
8.如权利要求7所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于，所述步骤5）中平板划线培养时内生细菌培养基为牛肉蛋白胨培养基，内生真菌培养基为PDA 培养基，内生放线菌培养基为高氏一号培养基。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111349568A (zh) * 2018-12-20 2020-06-30 湖南湘源美东医药科技有限公司 植物内生真菌菌种、菌株及其分离和应用方法
CN112795513A (zh) * 2021-02-03 2021-05-14 南京翠京元生物科技有限公司 一种植物内生菌富集分离方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102498793A (zh) * 2011-10-22 2012-06-20 中国科学院合肥物质科学研究院 一种黄连木种子内生菌去除及快速萌发的方法
CN103283604A (zh) * 2013-06-07 2013-09-11 南京工业大学大丰海洋产业研究院 百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法
CN104250616A (zh) * 2014-09-03 2014-12-31 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种植物内生菌的分离方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102498793A (zh) * 2011-10-22 2012-06-20 中国科学院合肥物质科学研究院 一种黄连木种子内生菌去除及快速萌发的方法
CN103283604A (zh) * 2013-06-07 2013-09-11 南京工业大学大丰海洋产业研究院 百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法
CN104250616A (zh) * 2014-09-03 2014-12-31 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种植物内生菌的分离方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.ALVIN ET AL: "Combined genetic and bioactivity-based prioritization leads to the isolation of an endophyte-derived antimycobacterial compound.", 《JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY》 *
曹丹丹等: "不同培养温度对变异黄芪内生真菌多样性的影响", 《中国兽医杂志》 *
陈泽斌等: "植物内生菌生物防治研究进展及存在的问题", 《昆明学院学报》 *
陈泽斌等: "烟草抗根结线虫内生细菌的筛选及防效研究", 《中国烟草学报》 *
鲁素芸: "《植物病害生物防治学》", 31 January 1993, 北京农业大学出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111349568A (zh) * 2018-12-20 2020-06-30 湖南湘源美东医药科技有限公司 植物内生真菌菌种、菌株及其分离和应用方法
CN112795513A (zh) * 2021-02-03 2021-05-14 南京翠京元生物科技有限公司 一种植物内生菌富集分离方法

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