CN102972218A

CN102972218A - 烟草病毒病快速摩擦接种方法

Info

Publication number: CN102972218A
Application number: CN2012104662454A
Authority: CN
Inventors: 钱玉梅; 申莉莉; 王凤龙; 杨金广; 战怀旭
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-11-16
Filing date: 2012-11-16
Publication date: 2013-03-20

Abstract

本发明公开了一种烟草病毒病快速摩擦接种方法，包括育苗，制备病毒液和接种步骤，其中在烟草苗的真叶上均匀喷洒石英砂，然后采用消毒衣刷沾取病毒液轻轻摩擦烟苗叶片，以造成表皮细胞微伤而不死亡为宜。本发明涉及的摩擦接种方法，采用衣刷蘸取一次病毒汁液，来回摩擦3次，每次可刷接60cm长，试验取材容易，操作简单、省时省力、准确可行，接种成功率100％。

Description

烟草病毒病快速摩擦接种方法

技术领域

本发明属于烟草病毒接种技术领域，具体涉及一种烟草病毒病快速摩擦接种方法。

背景技术

烟草作为一种模式植物，广泛应用于生物技术研究领域，完成烟草全基因组测序将更利于烟草作为模式植物的生物技术研究。随着烟草基因组计划重大专项的启动，“烟草突变体库创制、筛选与分析”研究项目通过化学和生物方法创制并收获了15万份烟草突变二代种子，并全面开展了烟草突变体库抗TMV、CMV和PVY快速、高通量接种筛选鉴定。面对庞大的试验群体，筛选方法应具备快速、简易和准确的特点。

目前，烟草病毒病的接种方法已有常规汁液摩擦接种法、喷枪接种法、传毒介体接种法。在烟草病毒病抗病性鉴定中，多采用常规汁液摩擦接种，该方法具有接种均匀、准确的优点，但需逐株摩擦接种，速度太慢；喷枪接种速度快，但在操作中只有熟练掌握好喷枪使用技术，才能做到接种均匀；传毒介体接种仅适宜于烟蚜等传毒介体传播的病毒，且需要饲养无毒传毒介体、再经获毒、持毒和传毒等多个阶段，费时费力。另外，以上传统方法均不适宜于大群体样本的接种鉴定。

综上所述，如果能从简单易行的角度出发，筛选出适宜于突变体库的高通量接种方法，进而为烟草品种病毒病温室苗期接种鉴定提供一种准确、可行的接种方法，这显得尤为重要。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种烟草病毒病快速摩擦接种方法，该方法采用衣刷快速摩擦接种，易操作、发病率高，适宜于汁液摩擦传播的病毒的大批量材料快速接种鉴定。

本发明的目的是这样实现的：

一种烟草病毒病快速摩擦接种方法，包括育苗，制备病毒液和接种步骤，其中在烟草苗的真叶上均匀喷洒石英砂，然后采用消毒衣刷沾取病毒液轻轻摩擦烟苗叶片，以造成表皮细胞微伤而不死亡为宜。

所述育苗步骤优选为：先在30cm×20cm的塑料盘内播种育苗，待烟苗长至2-3片真叶时，假植到30孔的育苗盘内，整齐摆放于育苗畦内，待烟苗长至5-6片真叶时，均匀喷撒600目石英砂。

所述制备病毒液的步骤优选为：取病叶，加入0.1M、pH7.0的磷酸缓冲液，在灭菌研钵中或研磨机中研磨，纱布过滤，用所述磷酸缓冲液定容，得到病毒液。

所述接种步骤为：取衣刷消毒，沾取病毒汁液轻轻摩擦烟苗叶片，以造成表皮细胞微伤而不死亡为宜，每蘸取一次病毒汁液，来回摩擦2-4次，每次刷接50-70cm长，接种后喷洒清水冲洗残留液。

所述衣刷包括刷头主体和刷柄，刷头主体的一面上设置刷毛；刷头主体长15cm，宽4cm；刷柄长14cm，宽2.5cm；刷毛长5cm，分四列合计4cm宽。

本发明涉及的摩擦接种方法，采用衣刷蘸取一次病毒汁液，来回摩擦3次，每次可刷接60cm长，试验取材容易，操作简单、省时省力、准确可行，接种成功率100％。该方法适用于烟草普通花叶病(TMV)、烟草黄瓜花叶病(CMV)、烟草马铃薯Y病毒病(PVY))等通过机械汁液传染的烟草病毒病，可用于烟草突变体库、种质资源、新品种等大批量材料的苗期接种鉴定。

附图说明

图为接种用塑料衣刷；

1-刷头主体；2-刷柄；3-刷毛。

具体实施方式

具体地说，本发明实施例采用的接种方法，包括如下步骤：

1.育苗：先在30cm×20cm的塑料盘内播种育苗，待烟苗长至2-3片真叶时，假植到30孔的育苗盘内，整齐摆放于育苗畦内。待烟苗长至5-6片真叶时待用，接种前均匀喷撒600目石英砂。

2.制备接种体：接种体选用当地优势株系或根据试验需要选取，接种到系统寄主上繁殖保存。为了防止保存期病毒的致病性退化，在使用前15d，转接到系统寄主上复壮1次，备用。取新鲜病叶，加入0.1M、pH7.0的磷酸缓冲液，在灭菌研钵中研磨，纱布过滤，磷酸缓冲液定容（病叶与磷酸缓冲液的质量体积比为1g:40mL），得到接种液，现配现用。当接种液需要量较大时，可使用每个病毒专用的组织粉碎研磨机制备接种液。

3.塑料衣刷消毒：取塑料衣刷，肥皂水浸泡30min消毒，清水洗净。塑料衣刷如图1所示，包括刷头主体1和刷柄2，刷头主体1的一面上设置刷毛3，刷头主体长15cm，宽4cm；刷柄长14cm，宽2.5cm；刷毛长5cm，分四列合计4cm宽。

4.快速摩擦接种：肥皂水洗手后，取塑料衣刷，手握刷柄用刷毛沾取病毒汁液轻轻摩擦烟苗叶片，以造成表皮细胞微伤而不死亡为宜。每蘸取一次病毒汁液，来回摩擦3次，每次刷接60cm长。接种后喷洒清水冲洗残留液。

5.调查方法：接种后15d，调查发病情况。病害严重度分级参考烟草病虫害调查及分级标准（GB／T23222－2008）。

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1衣刷摩擦接种与常规摩擦接种发病率比较

1.1试验材料

接种品种为三生-NN和NC89，先在30cm×20cm的塑料盘内播种育苗，待烟苗长至2-3片真叶时，假植到30孔的育苗盘内，整齐摆放于育苗畦内。待烟苗长至5-6片真叶时待用，试验前均匀喷撒600目石英砂。

1.2试验方法

衣刷摩擦接种：肥皂水洗手后，用预先消毒的塑料衣刷沾取病毒汁液轻轻摩擦烟苗叶片，以造成表皮细胞微伤而不死亡为宜。每蘸取一次病毒汁液，来回摩擦3次，每次刷接60cm长。

常规摩擦接种：肥皂水洗手后，左手托叶片，右手拿灭菌脱脂棉团蘸取病毒汁液，轻轻摩擦烟苗上部2片叶，以造成表皮细胞微伤而不死亡为宜。每蘸取一次病毒汁液，来回摩擦3次，每株摩擦接种上部两片叶。

上述每处理30株，3次重复，烟苗接种后，喷洒清水冲洗残留液，在25-28℃条件下培养，3d后调查TMV在三生NN烟上的枯斑症状，15d后调查CMV在系统寄主三生NN烟和PVY在系统寄主NC89上的发病率。

1.3试验结果

将衣刷快速摩擦接种的发病率，与常规摩擦接种发病率进行比较，结果发现：两种方法均能成功的接种TMV、CMV和PVY，发病率均为100％。较常规逐株摩擦接种，衣刷快速摩擦接种简单易行、快速准确，更适于大批量材料的接种筛选试验。

表1不同接种方法发病率（％）

接种方法	常规摩擦接种	衣刷摩擦接种
			TMV	100	100
CMV	100	100
			PVY	100	100

实施例2衣刷摩擦接种与常规摩擦接种时间比较

2.1试验材料

用于TMV、CMV和PVY抗性鉴定的突变体种质1600份。

2.2试验方法

育苗方法同实施例1，每份假植30株，三种病毒均将其中800份采用常规逐株摩擦接种，另800份采用快速摩擦接种，统计接种时间。

2.3试验结果

试验结果显示，同样的800份材料，24000株烟苗，4个人采用常规逐株摩擦接种用1017分钟，而一个人采用塑料衣刷快速摩擦接种用103分钟，节省了40倍用工。且采用塑料衣刷快速摩擦接种操作简单、快速，接种成功率100％。

表2不同接种方法所用时间（分钟）

接种方法	常规摩擦接种(4人)	衣刷摩擦接种(1人)
			TMV	1000	90
CMV	1100	110
			PVY	950	110
平均	1017	103

Claims

1.一种烟草病毒病快速摩擦接种方法，包括育苗，制备病毒液和接种步骤，其特征在于：在烟草苗的真叶上均匀喷洒石英砂，然后采用消毒衣刷沾取病毒液轻轻摩擦烟苗叶片，以造成表皮细胞微伤而不死亡为宜。

2.根据权利要求1所述的烟草病毒病快速摩擦接种方法，其特征在于所述育苗步骤为：先在30cm×20cm的塑料盘内播种育苗，待烟苗长至2-3片真叶时，假植到30孔的育苗盘内，整齐摆放于育苗畦内，待烟苗长至5-6片真叶时，均匀喷撒600目石英砂。

3.根据权利要求1所述的烟草病毒病快速摩擦接种方法，其特征在于所述制备病毒液的步骤为：取病叶，加入0.1M、pH7.0的磷酸缓冲液，在灭菌研钵中或研磨机中研磨，纱布过滤，用所述磷酸缓冲液定容，得到病毒液。

4.根据权利要求1所述的烟草病毒病快速摩擦接种方法，其特征在于所述接种步骤为：取衣刷消毒，沾取病毒汁液轻轻摩擦烟苗叶片，以造成表皮细胞微伤而不死亡为宜，每蘸取一次病毒汁液，来回摩擦2-4次，每次刷接50-70cm长，接种后喷洒清水冲洗残留液。

5.根据权利要求1所述的烟草病毒病快速摩擦接种方法，其特征在于：所述衣刷包括刷头主体和刷柄，刷头主体的一面上设置刷毛；刷头主体长15cm，宽4cm；刷柄长14cm，宽2.5cm；刷毛长5cm，分四列合计4cm宽。