CN106613136A - 一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，属于植物保护技术领域。该方法包括本氏烟育苗、抗性鉴定烟苗准备、接种缓冲液的配制、本氏烟烟苗接种和抗病性鉴定五大步骤。本发明的原理是在进行烟草抗病性鉴定前，将田间采集的番茄斑萎病毒毒源在本氏烟上活化，采集本氏烟上的发病组织作为毒源进行抗病性鉴定。本发明可显著提高番茄斑萎病毒接种效率，实现大规模数量的烟草品种抗病性鉴定，有效提高抗病性鉴定效率，特别适合从数量庞大的种质资源中筛选抗病靶标品种；并且减少了不同操作人员间的人为误差，烟苗抗病性鉴定结果能够准确反映烟苗在田间的抗病能力。
Description
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法。
背景技术
番茄斑萎病毒（Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV）已对烟叶生产构成了巨大的威胁。在局部地区可造成60％以上的严重损失，并有扩大和加重的趋势。现有的主栽烤烟品种均能被番茄斑萎病毒侵染，成为番茄斑萎病毒流行、爆发的潜在威胁。由于其传播介体——蓟马具有发育周期短、个体小易隐蔽、对杀虫剂极易产生抗药性等的特点，所以现有的防治措施难以取得理想的控制效果，因而，选育抗TSWV的烤烟品种是最经济、最有效的手段。
由于传毒蓟马个体小，饲养蓟马、分离无毒和带毒蓟马需要较高的专业技术等限制，人工摩擦接种番茄斑萎病毒是抗病品种鉴定最常用的接种方法。然而具体操作下来，发现从田间采集的番茄斑萎病毒病叶直接接种烟草效率仅为60-70%，难以满足烟草抗性鉴定的需要。推测原因为番茄斑萎病毒在作物上会产生坏死表型，坏死区域的细胞中病毒浓度较低，因此降低了病毒接种的起始浓度，造成了接种效率不能满足抗性鉴定的需求。为加快抗病品种的鉴定和选育，急需发明一种改进的高效的人工接种方式。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，利用本发明所述的方法，能显著提高病毒接种的起始浓度，进而提高番茄斑萎病毒的接种效率，对于单株植物，能够准确反映其对番茄斑萎病毒抗病性，同时，可鉴定各品种烟苗对番茄斑萎病毒的抗感性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，包括如下步骤：
步骤（1），本氏烟育苗：将本氏烟种子播于带烟草漂浮育苗基质的漂浮育苗盘中育苗30-40天，剔除弱苗，挑选出长势整齐一致的幼苗，并保证漂浮盘中每孔有一株生长健壮的本氏烟幼苗；
步骤（2），抗病性待检烟苗育苗：在本氏烟播种15天后，将拟进行抗病性鉴定的烟草种子播于带烟草漂浮育苗基质的漂浮育苗盘中育苗30-40天，剔除弱苗，挑选出长势整齐一致的幼苗，并保证漂浮盘中每孔有一株生长健壮的抗病性待检烟苗；
步骤（3），接种缓冲液的配制：配制0.1M pH7.0的磷酸缓冲液，121℃灭菌20分钟；在接种前半个小时内，每100 mL磷酸缓冲液加入0.2 g亚硫酸钠，10 uL beta-巯基乙醇，配成TSWV接种缓冲液，放置冰上，备用；
步骤（4），本氏烟烟苗接种：将田间获得经过TSWV试纸条检测的TSWV毒源接种于步骤（1）获得的本氏烟幼苗，具体步骤如下：
取TSWV毒源1-2g，放于研钵中，加入5-10mL步骤（3）获得的TSWV接种缓冲液和2-3g200-400目金刚砂，充分研磨至混合均匀，得到TSWV毒源汁液；
接种前洗净双手或者戴一次性乳胶手套操作；
接种时，首先将粒径为200-400目金刚砂按照每片叶0.1-0.2g的用量均匀的撒至本氏烟幼苗的叶表面，之后取TSWV毒源汁液，用一只手托住待接种本氏烟幼苗叶片，另一只手从待接种本氏烟幼苗叶片的叶基到叶尖的方向轻轻地、均匀地涂擦TSWV毒源汁液；TSWV毒源汁液的用量为每片叶50-100ul；
涂擦后用清水冲洗接种过的叶片，接着将植株于温度22-25℃、湿度为60-80%条件下暗培养一天，之后将植株移至温度22-25℃、光周期是昼/夜为14h/10h、湿度为60-80%条件下继续培养；
15天后，采集本氏烟苗上表现番茄斑萎病毒症状的叶片和/或茎干作为本氏烟TSWV毒源直接进行步骤（5）操作或保存于-80℃冰箱备用；
步骤（5），抗病性鉴定：取步骤（4）获得的本氏烟TSWV毒源1-2g放于研钵中，加入5-10mL步骤（3）获得的TSWV接种缓冲液和2-3g 200-400目金刚砂，充分研磨至混合均匀，得到本氏烟TSWV毒源汁液；
接种前洗净双手或者戴一次性乳胶手套操作；
接种时，首先将粒径为200-400目金刚砂按照每片叶0.1-0.2g的用量均匀的撒至步骤（2）得到的抗病性待检烟苗的叶表面，之后取本氏烟TSWV毒源汁液，用一只手托住待接种抗病性待检烟苗叶片，另一只手从待接种抗病性待检烟苗叶片的叶基到叶尖的方向轻轻地、均匀地涂擦本氏烟TSWV毒源汁液；本氏烟TSWV毒源汁液的用量为每片叶50-100 ul
涂擦后用清水冲洗接种过的叶片，接着将植株于温度22-25℃、湿度为60-80%条件下暗培养一天，之后将植株移至温度22-25℃、光周期是昼/夜为14h/10h、湿度为60-80%条件下继续培养；
每7天调查一次抗病性待检烟苗的病害，并计算烟苗番茄斑萎病毒的发病率a，共调查3-4次，分抗、感性植株，以最高一次发病率调查结果作为该品种烟苗的病情进行统计；发病率a=（该品种感病植株数量/该品种总植株数量）×100%。
进一步，优选的是，步骤（4）中，接种于步骤（1）获得的本氏烟幼苗所采用的TSWV毒源为带TSWV病毒的烟草叶片。
进一步，优选的是，步骤（4）中，TSWV毒源接种于步骤（1）获得的本氏烟幼苗时，选择长成且还未衰老的叶片进行接种；
步骤（5）中，本氏烟TSWV毒源汁液接种于步骤（2）获得的抗病性待检烟苗时，选择长成且还未衰老的叶片进行接种。
进一步，优选的是，步骤（4）和步骤（5）涂擦后，均采用普通喷壶喷水冲洗接种过的叶片1-2次。用水冲洗的目的一是冲去金刚砂，而是保持叶片湿润，防止叶片因为有伤口而导致的水分流失，从而萎蔫。
进一步，优选的是，将粒径为200-400目金刚砂均匀的撒至本氏烟幼苗或抗病性待检烟苗的叶表面时，采用喷粉器喷撒。
进一步，优选的是，步骤（4）和步骤（5）中接种取毒源汁液时，采用手指、棉球或者一次性的棉签蘸取。
进一步，优选的是，步骤（4）采集本氏烟苗上表现番茄斑萎病毒症状的叶片和茎干作为本氏烟TSWV毒源，本氏烟TSWV毒源的症状为叶片皱缩，轻微黄化褪绿，茎干弯曲。
进一步，优选的是，步骤（5）中病害调查采用的方法为血清学检测或分子生物学检测；
血清学检测时，采集抗病性待检烟苗植株的叶片利用番茄斑萎病毒试纸条或者番茄斑萎病毒抗体进行ELISA检测，呈阳性则表示为感病植株，反之则为抗病植株；
分子生物学检测时，提取植株总RNA，利用番茄斑萎病毒特异性引物进行RT-PCR检测，呈阳性则表示为感病植株，反之则为抗病植株。
进一步，优选的是，步骤（5）中病害调查采用的方法还包括症状观察；
症状观察时，感病植株症状包括：系统叶出现坏死斑、皱缩、黄化，植株矮小，发病后期整株坏死。即可采用症状观察和血清学检测，或者症状观察和分子生物学检测。
进一步，优选的是，发病率a=0为免疫品种，发病率0＜a≤25%为抗病品种，发病率25%＜a≤100%为感病品种。
本发明的原理是在进行烟草抗病性鉴定前，将田间采集的番茄斑萎病毒毒源在本氏烟上活化，采集本氏烟上的发病组织作为毒源进行抗病性鉴定。本发明可显著提高番茄斑萎病毒接种效率，实现大规模数量的烟草品种抗病性鉴定，有效提高抗病性鉴定效率，特别适合从数量庞大的种质资源中筛选抗病靶标品种；并且减少了不同操作人员间的人为误差，烟苗抗病性鉴定结果能够准确反映烟苗在田间的抗病能力。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
1、本发明中利用本氏烟接种番茄斑萎病毒后出现叶片皱缩，轻微黄化褪绿，茎干弯曲，不产生坏死表型，相对于番茄斑萎病毒在其他作物上易发生叶片坏死，单位叶片中的病毒浓度大大提高，这使得病毒接种的起始浓度显著提高，进而使得番茄斑萎病毒的接种效率明显提高，提高了抗病性鉴定结果的准确性；
2、本发明中利用本氏烟接种番茄斑萎病毒，接种后番茄斑萎病毒不产生坏死表型，相对于番茄斑萎病毒在其他作物上易发生整株坏死的表型，该发明易于番茄斑萎病毒的活体长期保存，使得抗病性鉴定更加便利；
3、本发明中利用的本氏烟TSWV毒源，接种效率为100%，发病时间短且均一，在接种后7-15天全部发病，相对于其他作物作为中间材料扩繁病毒，接种效率提高了30%以上，用时更短，效率更高，鉴定结果能够准确反映烟苗田间的抗病性；
4、本发明利用的本氏烟若感染烟草上其他常见病毒，如TMV、CMV，会产生坏死表型，可以进行病毒复合侵染的筛选，这大大提高番茄斑萎病毒接种的纯度和准确性，鉴定结果能够更加准确反映烟苗对番茄斑萎病毒抗病性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明烟草漂浮育苗基质的厂家及型号无特别要求，只要符合烟草行业标准YC/T310-2009（烟草漂浮育苗基质））即可。
本发明步骤（1）、步骤（2）中的育苗方法采用现有技术即可。
步骤（4）、步骤（5）植株的培养基质为烟草漂浮育苗基质。
本发明血清学检测和分子生物学检测依据文献（Huang etal., 2016 , PlantDisease, 100:1957）进行。
实施例1
一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，包括如下步骤：
步骤（1），本氏烟育苗：将本氏烟种子播于带烟草漂浮育苗基质的漂浮育苗盘中育苗30-35天，剔除弱苗，挑选出长势整齐一致的幼苗，并保证漂浮盘中每孔有一株生长健壮的本氏烟幼苗；
步骤（2），抗病性待检烟苗育苗：在本氏烟播种15天后，将拟进行抗病性鉴定的烟草种子播于带烟草漂浮育苗基质的漂浮育苗盘中育苗30-35天，剔除弱苗，挑选出长势整齐一致的幼苗，并保证漂浮盘中每孔有一株生长健壮的抗病性待检烟苗；
步骤（3），接种缓冲液的配制：配制0.1M pH7.0的磷酸缓冲液，121℃灭菌20分钟；在接种前半个小时内，每100 mL磷酸缓冲液加入0.2 g亚硫酸钠，10 uL beta-巯基乙醇，配成TSWV接种缓冲液，放置冰上，备用；
步骤（4），本氏烟烟苗接种：将田间获得经过TSWV试纸条检测的TSWV毒源接种于步骤（1）获得的本氏烟幼苗；所述的TSWV毒源带TSWV病毒的烟草叶片；
具体步骤如下：
取TSWV毒源1g，放于研钵中，加入5mL步骤（3）获得的TSWV接种缓冲液和2g 200-300目金刚砂，充分研磨至混合均匀，得到TSWV毒源汁液；
接种前洗净双手；
选择长成且还未衰老的叶片进行接种，接种时，首先将粒径为200-300目金刚砂按照每片叶0.1g的用量均匀的采用喷粉器喷撒至本氏烟幼苗的叶表面，之后采用手指蘸取取TSWV毒源汁液，用一只手托住待接种本氏烟幼苗叶片，另一只手从待接种本氏烟幼苗叶片的叶基到叶尖的方向轻轻地、均匀地涂擦TSWV毒源汁液；TSWV毒源汁液的用量为每片叶50ul；
涂擦后用清水冲洗接种过的叶片1次，接着将植株于温度22-25℃、湿度为60-80%条件下暗培养一天，之后将植株移至温度22-25℃、光周期是昼/夜为14h/10h、湿度为60-80%条件下继续培养；
15天后，采集本氏烟苗上表现番茄斑萎病毒症状的叶片和/或茎干作为本氏烟TSWV毒源直接进行步骤（5）操作或保存于-80℃冰箱备用；
表现番茄斑萎病毒症状为叶片皱缩，轻微黄化褪绿，茎干弯曲。
步骤（5），抗病性鉴定：取步骤（4）获得的本氏烟TSWV毒源1g放于研钵中，加入5mL步骤（3）获得的TSWV接种缓冲液和2g 200-300目金刚砂，充分研磨至混合均匀，得到本氏烟TSWV毒源汁液；
接种前洗净双手；
选择长成且还未衰老的叶片进行接种，接种时，首先将粒径为200-300目金刚砂按照每片叶0.1g的用量均匀的采用喷粉器喷撒至步骤（2）得到的抗病性待检烟苗的叶表面，之后采用手指蘸取本氏烟TSWV毒源汁液，用一只手托住待接种抗病性待检烟苗叶片，另一只手从待接种抗病性待检烟苗叶片的叶基到叶尖的方向轻轻地、均匀地涂擦本氏烟TSWV毒源汁液；本氏烟TSWV毒源汁液的用量为每片叶50 ul
涂擦后用清水冲洗接种过的叶片1次，接着将植株于温度22-25℃、湿度为60-80%条件下暗培养一天，之后将植株移至温度22-25℃、光周期是昼/夜为14h/10h、湿度为60-80%条件下继续培养；
每7天调查一次抗病性待检烟苗的病害，并计算烟苗番茄斑萎病毒的发病率a，共调查3次，分抗、感性植株，以最高一次发病率调查结果作为该品种烟苗的病情进行统计；发病率a=（该品种感病植株数量/该品种总植株数量）×100%。发病率a=0为免疫品种，发病率0＜a≤25%为抗病品种，发病率25%＜a≤100%为感病品种。
步骤（5）中病害调查采用的方法为血清学检测和症状观察；
血清学检测时，采集抗病性待检烟苗植株的叶片利用番茄斑萎病毒试纸条或者番茄斑萎病毒抗体进行ELISA检测，呈阳性则表示为感病植株，反之则为抗病植株；
症状观察时，感病植株症状包括：系统叶出现坏死斑、皱缩、黄化，植株矮小，发病后期整株坏死。
实施例2
一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，包括如下步骤：
步骤（1），本氏烟育苗：将本氏烟种子播于带烟草漂浮育苗基质的漂浮育苗盘中育苗35-40天，剔除弱苗，挑选出长势整齐一致的幼苗，并保证漂浮盘中每孔有一株生长健壮的本氏烟幼苗；
步骤（2），抗病性待检烟苗育苗：在本氏烟播种15天后，将拟进行抗病性鉴定的烟草种子播于带烟草漂浮育苗基质的漂浮育苗盘中育苗35-40天，剔除弱苗，挑选出长势整齐一致的幼苗，并保证漂浮盘中每孔有一株生长健壮的抗病性待检烟苗；
步骤（3），接种缓冲液的配制：配制0.1M pH7.0的磷酸缓冲液，121℃灭菌20分钟；在接种前半个小时内，每100 mL磷酸缓冲液加入0.2 g亚硫酸钠，10 uL beta-巯基乙醇，配成TSWV接种缓冲液，放置冰上，备用；
步骤（4），本氏烟烟苗接种：将田间获得经过TSWV试纸条检测的TSWV毒源接种于步骤（1）获得的本氏烟幼苗；所述的TSWV毒源带TSWV病毒的烟草叶片；
具体步骤如下：
取TSWV毒源2g，放于研钵中，加入10mL步骤（3）获得的TSWV接种缓冲液和3g 300-400目金刚砂，充分研磨至混合均匀，得到TSWV毒源汁液；
接种前戴一次性乳胶手套操作；
选择长成且还未衰老的叶片进行接种，接种时，首先将粒径为200-400目金刚砂按照每片叶0.2g的用量均匀的采用喷粉器喷撒至本氏烟幼苗的叶表面，之后采用一次性的棉签蘸取取TSWV毒源汁液，用一只手托住待接种本氏烟幼苗叶片，另一只手从待接种本氏烟幼苗叶片的叶基到叶尖的方向轻轻地、均匀地涂擦TSWV毒源汁液；TSWV毒源汁液的用量为每片叶100ul；
涂擦后用清水冲洗接种过的叶片2次，接着将植株于温度22-25℃、湿度为60-80%条件下暗培养一天，之后将植株移至温度22-25℃、光周期是昼/夜为14h/10h、湿度为60-80%条件下继续培养；
15天后，采集本氏烟苗上表现番茄斑萎病毒症状的叶片和/或茎干作为本氏烟TSWV毒源直接进行步骤（5）操作或保存于-80℃冰箱备用；
表现番茄斑萎病毒症状为叶片皱缩，轻微黄化褪绿，茎干弯曲。
步骤（5），抗病性鉴定：取步骤（4）获得的本氏烟TSWV毒源2g放于研钵中，加入10mL步骤（3）获得的TSWV接种缓冲液和3g 300-400目金刚砂，充分研磨至混合均匀，得到本氏烟TSWV毒源汁液；
接种前戴一次性乳胶手套；
选择长成且还未衰老的叶片进行接种，接种时，首先将粒径为300-400目金刚砂按照每片叶0.2g的用量均匀的采用喷粉器喷撒至步骤（2）得到的抗病性待检烟苗的叶表面，之后采用一次性的棉签蘸取本氏烟TSWV毒源汁液，用一只手托住待接种抗病性待检烟苗叶片，另一只手从待接种抗病性待检烟苗叶片的叶基到叶尖的方向轻轻地、均匀地涂擦本氏烟TSWV毒源汁液；本氏烟TSWV毒源汁液的用量为每片叶100 ul
涂擦后用清水冲洗接种过的叶片2次，接着将植株于温度22-25℃、湿度为60-80%条件下暗培养一天，之后将植株移至温度22-25℃、光周期是昼/夜为14h/10h、湿度为60-80%条件下继续培养；
每7天调查一次抗病性待检烟苗的病害，并计算烟苗番茄斑萎病毒的发病率a，共调查4次，分抗、感性植株，以最高一次发病率调查结果作为该品种烟苗的病情进行统计；发病率a=（该品种感病植株数量/该品种总植株数量）×100%。发病率a=0为免疫品种，发病率0＜a≤25%为抗病品种，发病率25%＜a≤100%为感病品种。
步骤（5）中病害调查采用的方法为分子生物学检测和症状观察；
分子生物学检测时，提取植株总RNA，利用番茄斑萎病毒特异性引物进行RT-PCR检测，呈阳性则表示为感病植株，反之则为抗病植株。
症状观察时，感病植株症状包括：系统叶出现坏死斑、皱缩、黄化，植株矮小，发病后期整株坏死。
实施例3
一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，包括如下步骤：
步骤（1），本氏烟育苗：将本氏烟种子播于带烟草漂浮育苗基质的漂浮育苗盘中育苗32-38天，剔除弱苗，挑选出长势整齐一致的幼苗，并保证漂浮盘中每孔有一株生长健壮的本氏烟幼苗；
步骤（2），抗病性待检烟苗育苗：在本氏烟播种15天后，将拟进行抗病性鉴定的烟草种子播于带烟草漂浮育苗基质的漂浮育苗盘中育苗32-38天，剔除弱苗，挑选出长势整齐一致的幼苗，并保证漂浮盘中每孔有一株生长健壮的抗病性待检烟苗；
步骤（3），接种缓冲液的配制：配制0.1M pH7.0的磷酸缓冲液，121℃灭菌20分钟；在接种前半个小时内，每100 mL磷酸缓冲液加入0.2 g亚硫酸钠，10 uL beta-巯基乙醇，配成TSWV接种缓冲液，放置冰上，备用；
步骤（4），本氏烟烟苗接种：将田间获得经过TSWV试纸条检测的TSWV毒源接种于步骤（1）获得的本氏烟幼苗；所述的TSWV毒源带TSWV病毒的烟草叶片；
具体步骤如下：
取TSWV毒源1.2g，放于研钵中，加入8mL步骤（3）获得的TSWV接种缓冲液和2.5g 200-400目金刚砂，充分研磨至混合均匀，得到TSWV毒源汁液；
接种前戴一次性乳胶手套操作；
选择长成且还未衰老的叶片进行接种，接种时，首先将粒径为200-400目金刚砂按照每片叶0.13g的用量均匀的采用喷粉器喷撒至本氏烟幼苗的叶表面，之后采用棉球蘸取取TSWV毒源汁液，用一只手托住待接种本氏烟幼苗叶片，另一只手从待接种本氏烟幼苗叶片的叶基到叶尖的方向轻轻地、均匀地涂擦TSWV毒源汁液；TSWV毒源汁液的用量为每片叶65ul；
涂擦后用清水冲洗接种过的叶片2次，接着将植株于温度22-25℃、湿度为60-80%条件下暗培养一天，之后将植株移至温度22-25℃、光周期是昼/夜为14h/10h、湿度为60-80%条件下继续培养；
15天后，采集本氏烟苗上表现番茄斑萎病毒症状的叶片和/或茎干作为本氏烟TSWV毒源直接进行步骤（5）操作或保存于-80℃冰箱备用；
表现番茄斑萎病毒症状为叶片皱缩，轻微黄化褪绿，茎干弯曲。
步骤（5），抗病性鉴定：取步骤（4）获得的本氏烟TSWV毒源1.7g放于研钵中，加入6mL步骤（3）获得的TSWV接种缓冲液和2.6g 200-400目金刚砂，充分研磨至混合均匀，得到本氏烟TSWV毒源汁液；
接种前戴一次性乳胶手套；
选择长成且还未衰老的叶片进行接种，接种时，首先将粒径为200-400目金刚砂按照每片叶0.16g的用量均匀的采用喷粉器喷撒至步骤（2）得到的抗病性待检烟苗的叶表面，之后采用一次性的棉签蘸取本氏烟TSWV毒源汁液，用一只手托住待接种抗病性待检烟苗叶片，另一只手从待接种抗病性待检烟苗叶片的叶基到叶尖的方向轻轻地、均匀地涂擦本氏烟TSWV毒源汁液；本氏烟TSWV毒源汁液的用量为每片叶75 ul
涂擦后用清水冲洗接种过的叶片1次，接着将植株于温度22-25℃、湿度为60-80%条件下暗培养一天，之后将植株移至温度22-25℃、光周期是昼/夜为14h/10h、湿度为60-80%条件下继续培养；
每7天调查一次抗病性待检烟苗的病害，并计算烟苗番茄斑萎病毒的发病率a，共调查3次，分抗、感性植株，以最高一次发病率调查结果作为该品种烟苗的病情进行统计；发病率a=（该品种感病植株数量/该品种总植株数量）×100%。发病率a=0为免疫品种，发病率0＜a≤25%为抗病品种，发病率25%＜a≤100%为感病品种。
步骤（5）中病害调查采用的方法为分子生物学检测和症状观察；
分子生物学检测时，提取植株总RNA，利用番茄斑萎病毒特异性引物进行RT-PCR检测，呈阳性则表示为感病植株，反之则为抗病植株。
症状观察时，感病植株症状包括：系统叶出现坏死斑、皱缩、黄化，植株矮小，发病后期整株坏死。
应用实例1
采用与实施例3相同的方法，拟进行抗病性鉴定的烟草种子为红花大金元、烤烟品种K326、花烟草（Nicotiana alata）和花烟草与烤烟杂交后代Polalta。
同时采用常规方法作为对比，即以田间采集新鲜毒源直接接种。
试验结果见表1。
表1 烤烟品种红花大金元、烤烟品种K326、花烟草（Nicotiana alata）和花烟草与烤烟杂交后代Polalta的抗病性鉴定结果
用本发明的本氏烟TSWV毒源后接种红花大金元、K326、N. alata和Polalta各30株，发病株分别为30株，30株，0株和0株，发病率分别为100%，100%，0%和0%，其中N. alata和Polalta对TSWV免疫，发病率为0%；红花大金元、K326发病率均为100%，为感病品种；
而用田间采集新鲜毒源接种红花大金元、K326、N. alata和Polalta各30株，发病株分别为23株，21株，0株和0株，发病率分别为77%，70%，0%和0%。
应用实例2
采用与实施例1相同的方法，拟进行抗病性鉴定的烟草种子为红花大金元、烤烟品种K326、花烟草（Nicotiana alata）和花烟草与烤烟杂交后代Polalta。
同时采用常规方法作为对比，即以田间采集新鲜毒源直接接种。
试验结果见表2。
表2烤烟品种红花大金元、烤烟品种K326、花烟草（Nicotiana alata）和花烟草与烤烟杂交后代Polalta的抗病性鉴定结果
用本发明的-80℃保存后本氏烟TSWV毒源后接种红花大金元、K326、N. alata和Polalta各30株，发病株分别为30株，30株，0株和0株，发病率分别为100%，100%，0%和0%，其中N. alata和Polalta对TSWV免疫，发病率为0%；红花大金元、K326发病率均为100%，为感病品种；
而用田间采集新鲜毒源接种红花大金元、K326、N. alata和Polalta各30株，发病株分别为20株，20株，0株和0株，发病率分别为67%，67%，0%和0%。
应用例1和应用例2，可以看出本发明的准确率较高，而常规方法对不发病的植株无法完全确定其抗感性，因此，本方法极大增强了对于单株筛选的确定性，且利于后续的研发生产工作。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），本氏烟育苗：将本氏烟种子播于带烟草漂浮育苗基质的漂浮育苗盘中育苗30-40天，剔除弱苗，挑选出长势整齐一致的幼苗，并保证漂浮盘中每孔有一株生长健壮的本氏烟幼苗；
步骤（2），抗病性待检烟苗育苗：在本氏烟播种15天后，将拟进行抗病性鉴定的烟草种子播于带烟草漂浮育苗基质的漂浮育苗盘中育苗30-40天，剔除弱苗，挑选出长势整齐一致的幼苗，并保证漂浮盘中每孔有一株生长健壮的抗病性待检烟苗；
步骤（3），接种缓冲液的配制：配制0.1M pH7.0的磷酸缓冲液，121℃灭菌20分钟；在接种前半个小时内，每100 mL磷酸缓冲液加入0.2 g亚硫酸钠，10 uL beta-巯基乙醇，配成TSWV接种缓冲液，放置冰上，备用；
步骤（4），本氏烟烟苗接种：将田间获得经过TSWV试纸条检测的TSWV毒源接种于步骤（1）获得的本氏烟幼苗，具体步骤如下：
取TSWV毒源1-2g，放于研钵中，加入5-10mL步骤（3）获得的TSWV接种缓冲液和2-3g200-400目金刚砂，充分研磨至混合均匀，得到TSWV毒源汁液；
接种前洗净双手或者戴一次性乳胶手套操作；
接种时，首先将粒径为200-400目金刚砂按照每片叶0.1-0.2g的用量均匀的撒至本氏烟幼苗的叶表面，之后取TSWV毒源汁液，用一只手托住待接种本氏烟幼苗叶片，另一只手从待接种本氏烟幼苗叶片的叶基到叶尖的方向轻轻地、均匀地涂擦TSWV毒源汁液；TSWV毒源汁液的用量为每片叶50-100ul；
涂擦后用清水冲洗接种过的叶片，接着将植株于温度22-25℃、湿度为60-80%条件下暗培养一天，之后将植株移至温度22-25℃、光周期是昼/夜为14h/10h、湿度为60-80%条件下继续培养；
15天后，采集本氏烟苗上表现番茄斑萎病毒症状的叶片和/或茎干作为本氏烟TSWV毒源直接进行步骤（5）操作或保存于-80℃冰箱备用；
步骤（5），抗病性鉴定：取步骤（4）获得的本氏烟TSWV毒源1-2g放于研钵中，加入5-10mL步骤（3）获得的TSWV接种缓冲液和2-3g 200-400目金刚砂，充分研磨至混合均匀，得到本氏烟TSWV毒源汁液；
接种前洗净双手或者戴一次性乳胶手套操作；
接种时，首先将粒径为200-400目金刚砂按照每片叶0.1-0.2g的用量均匀的撒至步骤（2）得到的抗病性待检烟苗的叶表面，之后取本氏烟TSWV毒源汁液，用一只手托住待接种抗病性待检烟苗叶片，另一只手从待接种抗病性待检烟苗叶片的叶基到叶尖的方向轻轻地、均匀地涂擦本氏烟TSWV毒源汁液；本氏烟TSWV毒源汁液的用量为每片叶50-100 ul；
涂擦后用清水冲洗接种过的叶片，接着将植株于温度22-25℃、湿度为60-80%条件下暗培养一天，之后将植株移至温度22-25℃、光周期是昼/夜为14h/10h、湿度为60-80%条件下继续培养；
每7天调查一次抗病性待检烟苗的病害，并计算烟苗番茄斑萎病毒的发病率a，共调查3-4次，分抗、感性植株，以最高一次发病率调查结果作为该品种烟苗的病情进行统计；发病率a=（该品种感病植株数量/该品种总植株数量）×100%。
2.根据权利要求1所述的抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中，接种于步骤（1）获得的本氏烟幼苗所采用的TSWV毒源为带TSWV病毒的烟草叶片。
3.根据权利要求1所述的抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，其特征在于，步骤（4）中，TSWV毒源接种于步骤（1）获得的本氏烟幼苗时，选择长成且还未衰老的叶片进行接种；
步骤（5）中，本氏烟TSWV毒源汁液接种于步骤（2）获得的抗病性待检烟苗时，选择长成且还未衰老的叶片进行接种。
4.根据权利要求1所述的抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，其特征在于，步骤（4）和步骤（5）涂擦后，均采用普通喷壶喷水冲洗接种过的叶片1-2次。
5.根据权利要求1所述的抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，其特征在于，将粒径为200-400目金刚砂均匀的撒至本氏烟幼苗或抗病性待检烟苗的叶表面时，采用喷粉器喷撒。
6.根据权利要求1所述的抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，其特征在于，步骤（4）和步骤（5）中接种取毒源汁液时，采用手指、棉球或者一次性的棉签蘸取。
7.根据权利要求1所述的抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，其特征在于，步骤（4）采集本氏烟苗上表现番茄斑萎病毒症状的叶片和茎干作为本氏烟TSWV毒源，本氏烟TSWV毒源的症状为叶片皱缩，轻微黄化褪绿，茎干弯曲。
8.根据权利要求1所述的抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，其特征在于，步骤（5）中病害调查采用的方法为血清学检测或分子生物学检测；
血清学检测时，采集抗病性待检烟苗植株的叶片利用番茄斑萎病毒试纸条或者番茄斑萎病毒抗体进行ELISA检测，呈阳性则表示为感病植株，反之则为抗病植株；
分子生物学检测时，提取植株总RNA，利用番茄斑萎病毒特异性引物进行RT-PCR检测，呈阳性则表示为感病植株，反之则为抗病植株。
9.根据权利要求8所述的抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，其特征在于，步骤（5）中病害调查采用的方法还包括症状观察；
症状观察时，感病植株症状包括：系统叶出现坏死斑、皱缩、黄化，植株矮小，发病后期整株坏死。
10.根据权利要求1所述的抗番茄斑萎病毒烟草植株的筛选方法，其特征在于，发病率a=0为免疫品种，发病率0＜a≤25%为抗病品种，发病率25%＜a≤100%为感病品种。
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