CN103210791B - 利用柿木屑栽培金顶侧耳的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到一种利用林业废弃物柿木屑为主料栽培培养金顶侧耳的方法，包括适宜分解柿木屑的金顶侧耳菌株选育过程，属于农林残余物利用及食药用真菌的栽培技术领域。本发明通过如下步骤实现：A、筛选具有柿木屑分解优势的金顶侧耳菌株;B、菌种扩繁；C、金顶侧耳菌栽培。本发明由于在金顶侧耳紫外诱变育种初筛步骤中用柿木屑粉末作为唯一碳源能够诱导筛选出更有效利用柿木屑的菌株，从而提高分解菌株选育效率；在液体菌种制备过程中，柿木屑作为特定底物，因诱导作用产生相应的酶，又会缩短菌株在柿木屑为主料的培养基上的适应时间，提高其发菌速度，进而提供了一种通过选育适宜利用柿木屑的金顶侧耳菌株进行高效利用农林废弃物柿木屑的技术方案。

Description

利用柿木屑栽培金顶侧耳的方法

技术领域

本发明涉及到一种利用林业废弃物柿木屑为主料栽培培养金顶侧耳的方法，包括适宜分解柿木屑的金顶侧耳菌株选育过程，属于农林残余物利用及食药用真菌的栽培技术领域。

背景技术

柿子树约有二百多个品种，在中国分布广泛，南北皆有种植。柿子营养价值高，是人们喜爱的果品，往往做成干果远销东南亚地区，因此，柿子树作为一种高经济附加果树在某些地区农业经济结构调整方面发挥着重要的作用。而柿子树因为花果量大，营养消耗多，容易出现座果的“大小年”现象，合理修剪柿树枝就成为柿子树管理的关键环节。在循环经济意识薄弱的农村地区，修剪下来的柿木枝条往往随意堆置或焚烧，造成了严重的资源浪费和环境污染，柿树树叶同样存在着随意堆置和简易焚烧处理的资源浪费问题。经现代科技分析发现，柿树树叶中含有相当可观的蛋白质、氨基酸、多种维生素、黄酮类物质和有机酸类物质。这些物质除可以为食用菌生长提供营养元素外，其中维生素可以用于促进食用菌菌丝生长；黄酮类物质在如今生态农业生产中常被制成生态农药用于驱虫，因此它可以在食用菌菇虫防治方面发挥一定的作用；有机酸类物质能够降低培养料整体酸碱度，对于适于生长在偏酸性环境中的食用菌具有明显的生长促进作用。

食用菌产业近年来在农村经济改革中发挥着举足轻重的作用，合理利用农村废弃果树枝条栽培食用菌从而获得更高的经济效益，已经成为农民广泛接受的事实。金顶侧耳目前主要是利用棉籽壳堆置发酵，装袋灭菌后进行熟料栽培，金顶侧耳是著名的食药用真菌，是典型的高蛋白低脂肪的健康食材，并且其所含脂肪酸多为不饱和脂肪酸，能够降低血脂，适合肥胖和心脑血管患者食用。此外它还还有多种氨基酸、B族维生素、维生素C、烟酸、泛酸和多种矿质元素，这些人体健康都有极大的促进作用。而在医用方面，根据我国一些医学文献记载，金顶侧耳可用于治疗痢疾、肌肉萎缩等病；根据现代中药药理学的研究，它在抗肿瘤、增强机体免疫力以及清除自由基、抗衰老方面都有显著地功效。金顶侧耳是东北地区久负盛名的珍稀食用菌，有着广阔的消费市场，因此它完全可以作为一种带动农民致富的食用菌菌种开发利用。同时结合河北省柿树种植面积广、废弃柿木枝条丰富的情况，利用柿木屑实现金顶侧耳的高效生产无疑具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的利用柿木修剪后的废弃枝条和树叶配以其他辅料制成金顶侧耳高效栽培料使之进一步产生经济效益，并在对环境无污染的前提下实现农林废弃物的生物转化利用。

本发明利用利用柿木屑栽培金顶侧耳的方法，包括如下步骤：

A、筛选具有柿木屑分解优势的金顶侧耳株：

A-1、金顶侧耳种紫外诱变：

A-2、诱变株的初筛：以78%致死率的时间作为照射剂量诱变金顶侧耳原生质体，待原生质体在柿木屑分解优势菌株再生平皿已再生出菌落后，取优先再生出来、菌落直径最大、生长最旺盛的菌落进入复筛阶段；

初筛培养基：柿木屑粉40g/L、麸皮10g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L、pH值6.0、琼脂20g/L，麸皮煮沸30min，过滤去渣取浸提液，柿木屑粉碎过80目筛得粉状，直接加入培养基，常规灭菌；

A-3、诱变株的复筛：将初筛选出来的菌株每株接10支PDA斜面培养基至菌丝长满斜面，计算菌丝生长速率，从中选出长速快、长势好的菌株进入精筛；

A-4、诱变株的精筛：将复筛出来的菌株每株接入10支装有栽培料培养基的试管上进行培养，栽培料培养基：柿木屑60%、啤酒糟20%、柿树叶10%、麸皮8%、生石灰2%，加入水或水溶液，料水比为1:1.4进行拌料，装入试管中，121℃下高压灭菌150min，取长速快、长势好的菌株；

B、菌种扩繁

B-1、液体培养

取栽培时所用相同的啤酒糟3%，加入去皮马铃薯12%、麸皮1%共煮沸30min，过滤去渣即得培养基浸煮液，再加入KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L、pH值6.0、琼脂3g/L，柿木屑添加量为10%，粉碎过80目筛后直接加入培养基中，即得发酵培养液，培养液分装完毕后，瓶口包扎四层棉布，棉布外加盖两层报纸，进行高压灭菌，121℃、0.1-0.15MPa灭菌30min；

将灭过菌的液体培养基中放入接种箱中，表面紫外或甲醛熏蒸灭菌后进行接种，每瓶接精筛保存的PDA斜面菌种1cm²大小菌块四块，静置24h后放入转速为160r/min、温度为25℃恒温摇床培养96h，生物量达到25g/100mL以上，镜检合格后使用。

B-2、麦粒菌种扩种：培养基为麦粒79%、柿木屑20%、生石灰1%。将麦粒用自来水浸泡10h后，煮沸至麦粒掰开无白芯为止，滤去水分，摊开晾干，加入柿木屑、生石灰搅拌均匀，pH值自然，用500mL的细口瓶或双层聚丙烯塑料袋装至瓶/袋肩，0.10-0.15MPa灭菌2.5h；避光培养至满瓶/袋后7-15天即可在金顶侧耳栽培过程中应用；

C、金顶侧耳栽培：取步骤A-4的栽培料培养基，装入17cm×32cm×0.05cm聚乙烯塑料袋，每袋装干料300g，121°C高压灭菌150min，冷却后，按照5-10%的接种量接入；

20℃避光培养至满袋后，敞开袋口进行生殖生长管理阶段，此阶段保持温度15-20℃，空气湿度85-95%。

所述利用柿木屑栽培金顶侧耳的方法，步骤A-1所述金顶侧耳种紫外诱变包括：

1）菌丝体制备：培养基配方为去皮马铃薯20%、麸皮2%、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L、pH值6.0、琼脂0.3%。培养条件为160r/min、温度为25℃恒温摇床培养7天，

2）原生质体制备：

2-1）将已培养好的菌丝置于离心管中6000r/min离心10min，去上清液，用浓度为109g/L甘露醇渗透压稳定剂洗三次，按每300mg湿菌丝加1mL酶解液酶解，酶解温度为30℃，酶解时间为150min；

酶解液是含有6g/L纤维素酶和6g/L蜗牛酶的混合酶的109g/L甘露醇溶液；

2-2）稀释：用浓度为109g/L甘露醇溶液稀释原生质体悬浮液至浓度为10⁵个/mL；

3）紫外诱变：紫外灯15W，照射距离30cm，照射剂量30s。

所述利用柿木屑栽培金顶侧耳的方法，步骤A-2、A-4、B-1（非栽培用）所述柿木屑是柿木枝条粉碎，过80目筛得到的木屑粉；步骤B-2、C等栽培用途下所述柿木屑，是柿木枝条粉碎成木屑样粉片。

（即本发明中所涉及柿木屑包括两种物理状态，除栽培用柿木屑为常规木屑样粉片，其余均为柿木屑粉）。

所述利用柿木屑栽培金顶侧耳的方法，步骤A-4所述加入培养料的水溶液为柿树树叶浸提液，浸提方法是将自然风干的柿树树叶浸泡10h后，加热煮沸30min，料水配比为6g/100mL(w/v)，冷却过滤后装入试管中，121℃下高压灭菌150min备用。

本发明的技术进步效果在于：

1、由于在金顶侧耳紫外诱变育种初筛步骤中用柿木屑粉末作为唯一碳源能够诱导筛选出更有效利用柿木屑的菌株，从而提高分解菌株选育效率；

2、在液体菌种制备过程中，柿木屑作为特定底物，因诱导作用产生相应的酶，又会缩短菌株在柿木屑为主料的培养基上的适应时间，提高其发菌速度，进而提供了一种通过选育适宜利用柿木屑的金顶侧耳株进行高效利用农林废弃物柿木屑的技术方案。

3、选择啤酒糟作为辅助营养成分，一是啤酒糟中B族微生物促进金顶侧耳丝生长。二是啤酒糟在空气中放置一定时间后，由于醋酸菌等微生物的氧化作用(酒糟发酵)，将残存的乙醇等氧化形成醋酸、乳酸、酪酸等多种游离酸，将其混入其他培养料中会降低整体的pH值，金顶侧耳喜欢偏酸性环境，菌丝体生长的最适pH值在5-6.5，因此适量添加啤酒糟能够有效促进金顶侧耳的生长。

具体实施方式

本发明技术方案的所用金顶侧耳种引自上海农科院食用菌研究所。

金顶侧耳（Pleurotus citrinopileatus Sing.）隶属于担子菌门（Basidiomycota）、伞菌纲(Agaricomycetes)、伞菌目(Agaricales)、口蘑科(Trichiolomataceae)、侧耳属（Pleurotus），是著名的食药兼用菌。

下面结合实施例详细说明本发明的技术方案内容和应用效果：

A、筛选具有柿木屑分解优势的金顶侧耳株：

A-1、金顶侧耳种紫外诱变：

1）菌丝体制备：培养基配方为去皮马铃薯20%、麸皮2%、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L、pH值6.0、琼脂0.3%。培养条件为160r/min、温度为25℃恒温摇床培养7天，

2）原生质体制备：

2-1）将已培养好的菌丝置于离心管中6000r/min离心10min，去上清液，用浓度为109g/L甘露醇渗透压稳定剂洗三次，按每300mg湿菌丝加1mL酶解液酶解，酶解温度为30℃，酶解时间为150min；

酶解液是含有6g/L纤维素酶和6g/L蜗牛酶的混合酶的109g/L甘露醇溶液；

2-2）稀释：用浓度为109g/L甘露醇溶液稀释原生质体悬浮液至浓度为10⁵个/mL；

3）紫外诱变：紫外灯15W，照射距离30cm，照射剂量30s。

A-2、诱变株的初筛：以78%致死率的时间作为照射剂量诱变金顶侧耳原生质体，待原生质体在柿木屑分解优势菌株再生平皿已再生出菌落后，取优先再生出来、菌落直径最大、生长最旺盛的菌落进入复筛阶段；

初筛培养基：柿木屑粉40g/L、麸皮10g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L、pH值6.0、琼脂20g/L，麸皮煮沸30min，过滤去渣取浸提液，柿木屑粉碎过80目筛得粉状，直接加入培养基，常规灭菌；

A-3、诱变株的复筛：将初筛选出来的菌株每株接10个PDA斜面培养基至菌丝长满斜面，计算菌丝生长速率，从中选出长速快、长势好的菌株进入精筛；

A-4、诱变株的精筛：将复筛出来的菌株每株接入10支栽培料培养基试管上进行培养，栽培料培养基：柿木屑60%、啤酒糟20%、柿树叶10%、麸皮8%、生石灰2%，加入水或水溶液，料水比为1:1.4进行拌料，装入试管中，121℃下高压灭菌150min，取长速快、长势好的菌株；

上述柿木屑是柿木枝条粉碎，过80目筛得到的粉状木屑。

上述加入培养料的水溶液为柿树树叶浸提液，浸提方法是将自然风干的柿树树叶浸泡10h后，加热煮沸30min，料水配比为6g/100mL(w/v)，冷却过滤后装入试管中，121℃下高压灭菌150min备用。

B、菌种扩繁

B-1、液体培养

取栽培时所用相同的啤酒糟3%，加入去皮马铃薯12%、麸皮1%共煮沸30min，过滤去渣即得培养基浸煮液，再加入KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L、pH值6.0、琼脂3g/L，柿木屑添加量为10%，粉碎过80目筛后直接加入培养基中，即得发酵培养液，培养液分装完毕后，瓶口包扎四层棉布，棉布外加盖两层报纸，进行高压灭菌，121℃、0.1-0.15MPa灭菌30min；

将灭过菌的液体培养基中放入接种箱中，表面紫外或甲醛熏蒸灭菌后进行接种，每瓶接精筛保存的PDA斜面菌种1cm²大小菌块四块，静置24h后放入转速为160r/min、温度为25°C恒温摇床培养96h，生物量达到25g/100mL以上，镜检合格后使用。

B-2、麦粒菌种扩种：培养基为麦粒79%、柿木屑20%、生石灰1%。将麦粒用自来水浸泡10h后，煮沸至麦粒掰开无白芯为止，滤去水分，摊开晾干，加入柿木屑、生石灰搅拌均匀，pH值自然，用500mL的细口瓶或双层聚丙烯塑料袋装至瓶/袋肩，0.10-0.15MPa灭菌2.5h；避光培养至满瓶/袋后7-15天即可在金顶侧耳栽培过程中应用；

C、金顶侧耳栽培：取步骤A-4的栽培料培养基，装入17cm×32cm×0.05cm聚乙烯塑料袋，每袋装干料300g，121°C高压灭菌150min，冷却后，按照5-10%的接种量接入；

20℃避光培养至满袋后，敞开袋口进行生殖生长管理阶段，此阶段保持温度15-20℃，空气湿度85-95%。金顶侧耳属低温型菌种，营养生长阶段温度不宜过高，超过28℃注意通风散热；菌丝长满菌袋后，维持5天左右，敞开袋口进行生殖生长管理阶段，此阶段保持温度在15-20℃，空气湿度85%-95%，此阶段需要给予一定的散射光刺激。另外，还要保持出菇环境通风良好，使CO₂浓度不宜过高，否则容易出现菇柄较长的畸形菇。采收前1天停止喷水。采收时，用刀片切下菇的基部，可保留较小菇。

采收后，清理料面剔除老化菌丝和残留菌柄。将料面整干，防止积水，停水五天后，进行补水。两周后会形成第二批原基，一般可采收三潮菇。

关于本发明的有关对比研究说明：

1、金顶侧耳原生质体制备所需菌丝体深层培养培养基配方优化研究

为便于菌丝体与酶液充分接触，原生质体制备所需菌丝体要求直径小，因此设计在液体培养基配方中加入琼脂作为增稠剂，其他成分包括：去皮马铃薯20%、麸皮2%、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L、pH值6.0，P0为琼脂添加量为0%的空白对照组，设置琼脂添加量梯度为0.1%，最大添加量为0.6%。

表1菌丝体制备培养基配方

零级、一级液体菌种培养基配方均为P0，二级菌种每个配方设置3个平行，均使用500ml锥形瓶，每瓶装液量为200ml。由零级接入一级菌种培养基、由一级接入二级菌种培养基过程中接种量为20%。液体培养基121°C高压灭菌30min，160r/min恒温摇床中培养7天，记录每瓶培养基中菌球数量（以得出菌球密度）和菌球直径。确定琼脂添加量为0.3%为最佳添加量。

2、金顶侧耳原生质体紫外诱变育种相关研究

2.1、原生质体的分离与精制

将已培养好的菌丝置于离心管中6000r/min离心10min，去上清液，用浓度为109g/L的甘露醇渗透压稳定剂洗三次。每300mg湿菌丝加1mL混合酶液，混合酶液是6g/L纤维素酶+6g/L蜗牛酶，同样用浓度为109g/L甘露醇渗透压稳定剂配制。

将上述反应液用四层灭过菌的擦镜纸过滤，6000r/min离心10min，去上清得纯化的原生质体。将原生质体用甘露醇渗透压稳定剂稀释成浓度为10⁵个/mL的原生质体悬液，以血球计数板计数。

2.2、原生质体紫外诱变处理

取浓度为10⁵个/mL的原生质体悬液5mL置于直径为90mm无菌平板中，打开皿盖，用紫外灯功率15W，照射距离30cm照射，时间设置分别为0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s，如表2。取不同照射剂量的处理液0.1mL涂再生培养基平板，25℃避光培养7d，待长出菌落，进行活菌技术并计算原生质体紫外诱变的致死率。

表2金顶侧耳原生质体紫外照射致死率

由于原生质体在80%以上致死率条件下，发生正突变的几率更大，因此考虑设定紫外诱变时间为30s或40s，考虑到曝光时间越长，再生平皿污染率越高，因此确定紫外诱变时间为30s。

2.3、初筛培养基中柿木屑添加量对比试验

在紫外诱变菌株初筛过程中，以柿树木屑作为唯一碳源筛选出能够有效利用柿木屑的再生菌株，筛选目的明确，从而有效降低后续筛选工作的工作量、缩短筛选周期。因此固定初筛培养基中其它成分，设计柿木屑添加量以梯度变化。培养基配方及配制方法为：麸皮10g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L、pH值6.0、琼脂20g/L，麸皮煮沸30min，过滤去渣得浸提液，柿木屑粉碎过80目筛得粉状，直接加入培养基，常规灭菌。将取浓度为10⁵个/mL的原生质体悬液0.1mL置于直径为90mm无菌初筛培养基平板中，记录再生菌株数，从而确定柿木屑最佳添加量。

表3初筛培养基中柿木屑添加量对比试验

经过对比可见，柿木屑添加量达到40g/L时，再生菌落数达到最大，当添加量继续增加时，再生菌落数没有明显增加，因此确定柿木屑最佳添加量为40g/L。

2.4目标菌株的筛选

（1）金顶侧耳诱变株的初筛：以78%致死率的时间作为照射剂量诱变金顶侧耳原生质体，待原生质体在柿木屑分解优势菌株再生平皿已再生出菌落后，取优先再生出来、菌落直径最大、生长最旺盛的菌落准备进入复筛阶段，初筛筛选出共10株菌株。

（2）金顶侧耳诱变株的复筛：将初筛选出来的菌株（编号均以Ju开始）每株接10个PDA斜面培养基至菌丝长满斜面，计算菌丝生长速率，从中选出长速快、长势好的菌株进入精筛。菌丝长速、长势结果见表4。

表4十株初筛菌株在PDA斜面培养基上的长速、长势

注：列出长速均为平均值±标准误；+++表示生长致密，++表示生长较致密，+表示生长一般。

（3）金顶侧耳诱变株的精筛：将初筛出来的4株菌株每株接入3个栽培料上进行试管培养，栽培料培养基配方为：柿木屑60%、啤酒糟20%、柿树树叶10%、麸皮8%、生石灰2%，料水比为1:1.4进行拌料。加入培养料的水溶液为柿树树叶浸提液，浸提方法是将自然风干的柿树树叶浸泡10h后，加热煮沸30min，料水配比为6g/100mL(w/v)，冷却过滤后备用。装入试管中，121℃下高压灭菌150min。取长速快、长势好的菌株共2株。菌丝的长速、长势结果见表5。

表5四株复筛菌株在柿木屑为主料的栽培料上试管培养过程中的长速、长势

注：列出长速均为平均值±标准误；+++表示生长致密，++表示生长较致密，+表示生长一般。

根据复筛和精筛长速对比试验，确定Ju01、Ju08进入拮抗试验，并确定这两株再生变异株进行相关生长周期和生物转化率试验。

2.5、拮抗试验

将诱变菌株Ju01、Ju08与原菌株成对接入PDA培养基平板中，25℃培养7d观察拮抗现象。两株筛选菌株与原始菌株均具有明显的拮抗线存在，因此可知两株菌均与原始菌株不同。

3、金顶侧耳营养生长阶段栽培配方的优化研究

设计以柿木屑、啤酒糟、柿树树叶的不同组合为主料的栽培培养基，配方见表6。啤酒糟的使用不仅能增加碳源、氮源含量，还能降低培养基pH值，麸皮作为氮源使用，生石灰作为调节培养基pH值使用。P8为纯柿木屑对照组，P9为纯杂木屑对照组，P10为纯棉籽皮对照组。

表6以棉籽皮或柿木屑为主料的培养料配方（干料，%）

准确称取各种成分，将其混合拌匀，用柿树树叶热水浸提液代替水混入培养料，料液比为1:1.4，把已配置好的培养料接入试管和出菇袋，每个配方重复5次，121℃高压灭菌150min。然后取长势良好的PDA斜面菌种，分别接种于上述已灭菌的试管培养基中。

试管每隔2天观察一次菌株的长速和长势情况，用游标卡尺（精确度0.02mm）测定菌株的长速，并记录实验数据，以考察其营养生长情况。菌丝长速长势结果见表7、8。

表7以柿木屑、棉籽皮为主料的试管营养试验中Ju01菌株菌丝的长速、长势

注：列出长速均为平均值±标准误；+++表示生长致密，++表示生长较致密，+表示生长一般。

表8以柿木屑、棉籽皮为主料的试管营养试验中Ju08菌株菌丝的长速、长势

注：列出长速均为平均值±标准误；+++表示生长致密，++表示生长较致密，+表示生长一般。

诱变菌株在各种比例的培养基上均能生长，在啤酒糟添加量过高时，其生长势较一般，菌丝白但不够致密；当啤酒糟添加量减少或在纯杂木屑培养基上时，其长势较好，菌丝洁白、较致密；其它培养基配方条件下，菌丝均洁白致密。通过对比表的结果，可以看出配方P6的菌丝生长最快，比纯棉籽皮P10组、纯杂木屑P9组以及纯柿木屑P8组长速都快。

4、金顶侧耳生殖生长阶段栽培配方的优化研究

出菇试验中，取表长速较快的7个配方，按每个培养基配方称取主辅料，各自混合均匀，料水比1:1.4进行拌料，装入17cm×32cm×0.05cm聚乙烯塑料袋，每袋装干料约300g，接种量为“液体菌种+麦粒+柿木屑”制种的颗粒菌种一接种勺。以纯杂木屑P9的栽培料袋作为对照（CK1），以纯棉籽皮P10的栽培料袋作为对照（CK2），观察并记录各个配方的生长情况并计算生物转化率。

表9不同培养基中的Ju01平均产量和平均生物效率

表10不同培养基中的Ju08平均产量和平均生物效率

从表中可以看出，当以柿木屑为主要碳源达到60%，啤酒糟添加量达到20%时，Ju01、Ju08两株金顶侧耳菌株的生物转化率分别达到了88%和85%，比纯木屑的生物转化率86%和84%高，尽管未达到栽培料主料纯棉籽皮的生物转化率89%和86%，但具有可比性。

确定了适宜配方为柿木屑60%、啤酒糟20%、柿树树叶10%、麸皮8%、生石灰2%，料水比为1:1.4进行拌料。说明柿木屑可以完全代替棉籽皮栽培金顶侧耳，也就是说，柿木屑作为一种可循环利用的生物资源，可以用于珍稀菌类金顶侧耳的产业化开发。

5、不同主要栽培料栽培金顶侧耳营养生长情况对比研究

根据1中筛选出的最优栽培配方，确定啤酒糟、柿树树叶、麸皮、生石灰及柿树树叶热水浸提液的用量，对比分别以柿木屑、杂木屑、棉籽皮为主要栽培料，金顶侧耳菌株的生长情况。

表11分别以柿木屑与杂木屑为主料进行栽培对比试验配方（干料，%）

准确称取各种成分，将其混合拌匀，把已配置好的培养料接入试管，每个配方重复5次，121°C高压灭菌150min。然后取长势良好的PDA斜面菌种，分别接种于上述已灭菌的试管中。试管每隔2天观察一次菌株的长速和长势情况，用游标卡尺（精确度0.02mm）测定菌株的长速，并记录实验数据，以考察其营养生长情况。菌丝长速长势结果见表12、13。

表12分别以柿木屑和杂木屑为主料进行栽培对比试验中Ju01菌株菌丝的长速、长势

注：列出长速均为平均值±标准误；+++表示生长致密，++表示生长较致密，+表示生长一般。

表13分别以柿木屑和杂木屑为主料进行栽培对比试验中Ju08菌株菌丝的长速、长势

注：列出长速均为平均值±标准误；+++表示生长致密，++表示生长较致密，+表示生长一般。

通过对比表的结果，可以看出柿木屑Ps0组的菌丝生长比杂木屑Ps1组、棉籽皮Ps2组长速快，三者菌丝均洁白致密。

6、不同主要栽培料栽培金顶侧耳生殖生长情况对比研究

基于4.7.5中三种培养基配方进行出菇试验，每个培养基配方称取主辅料，各自混合均匀，料水比1:1.4进行拌料，装入17cm×32cm×0.05cm聚乙烯塑料袋，每袋装干料约300g，接种量为“液体菌种+麦粒+柿木屑”制种的颗粒菌种一接种勺。观察并记录各个配方的生长情况并计算生物转化率。

表14不同培养基中的Ju01平均产量和平均生物效率

表15不同培养基中的Ju08平均产量和平均生物效率

通过对比，Ju01和Ju08两株再生菌株在柿木屑为主料的Ps0组的平均转化率高于杂木屑为主料的Ps1组，虽然低于棉籽皮为主料的Ps2组，但具有可比性。由此可以得出结论，柿木屑能够代替杂木屑用于栽培金顶侧耳。确定了生物转化率较高的细胞工程优良菌株Ju01和长速较快的细胞工程优良菌株Ju08，针对以个体菇农或合作社、采用自然气候季节批式栽培为主要形式的生产，产量为主要考量因素，因此，推荐生物转化率较高的Ju01菌株；而针对大规模人工气候下的工业生产，金顶侧耳菌丝长速能够有效缩短生产周期，因此，推荐长速更快、生物转化率能够达到85%左右的Ju08菌株。同时确定了优化培养基配方为柿木屑60%、啤酒糟20%、柿树树叶10%、麸皮8%、生石灰2%。

7、柿树树叶浸提液添加量对比试验

柿树树叶中含有相当可观的蛋白质、氨基酸、多种维生素、黄酮类物质和有机酸类物质。这些物质除可以为食用菌生长提供营养元素外，其中维生素可以用于促进食用菌菌丝生长；黄酮类物质在食用菌菇虫防治方面可以发挥一定的作用；有机酸类物质对于金顶侧耳这种适于生长在偏酸性环境中的食用菌具有明显的生长促进作用。因此设定培养料配方为3、4、5中筛选的最优培养基配方，即柿木屑60%、啤酒糟20%、柿树树叶10%、麸皮8%、生石灰2%，柿树树叶热水浸提液中柿树树叶用量设置梯度，树叶自然风干后浸泡10h进行煮沸，煮沸时间设定为30min，冷却过滤后备用。

每个培养基配方称取主辅料，各自混合均匀，料水比1:1.4进行拌料，分别装入试管和出菇袋中，每个配方重复5次，121℃高压灭菌150min。然后取长势良好的PDA斜面菌种或“液体菌种+麦粒+柿木屑”制种的颗粒菌种，分别接种于上述已灭菌的试管和出菇袋中。试管每隔2天观察一次菌株的长速和长势情况，用游标卡尺（精确度0.02mm）测定菌株的长速，并记录实验数据，以考察其营养生长情况。出菇袋观察并记录各个配方的生长情况并计算生物转化率。

表16不同浸提液的Ju01的长速、平均产量和平均生物效率

表17不同浸提液的Ju08的长速、平均产量和平均生物效率

Ju01和Ju08的长速、平均产量和生物转化率数据表明，柿树树叶与水的添加比例为6g/100mL时，其相关数据均达到最大值，同时，柿树树叶用量达到最小使用量。因此确定柿树树叶最适添加量为6g/100mL。

Claims (4)

1.一种利用柿木屑栽培金顶侧耳的方法，其特征包括如下步骤：

A、筛选具有柿木屑分解优势的金顶侧耳株：

A-1、金顶侧耳种紫外诱变：

A-2、诱变株的初筛：以78％致死率的时间作为照射剂量诱变金顶侧耳原生质体，待原生质体在柿木屑分解优势菌株再生平皿已再生出菌落后，取优先再生出来、菌落直径最大、生长最旺盛的菌落进入复筛阶段；

初筛培养基：柿木屑粉40g/L、麸皮10g/L、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O 1g/L、pH值6.0、琼脂20g/L，麸皮煮沸30min，过滤去渣取浸提液，柿木屑粉碎过80目筛得粉状，直接加入培养基，常规灭菌；

A-3、诱变株的复筛：将初筛选出来的菌株每株接10支PDA斜面培养基至菌丝长满斜面，计算菌丝生长速率，从中选出长速快、长势好的菌株进入精筛；

A-4、诱变株的精筛：将复筛出来的菌株每株接入10支栽培料培养基试管上进行培养，栽培料培养基：柿木屑60％、啤酒糟20％、柿树叶10％、麸皮8％、生石灰2％，加入水或水溶液，料水比为1:1.4进行拌料，121℃下高压灭菌150min；取长速快、长势好的菌株；

B、菌种扩繁

B-1、液体培养

取栽培时所用相同的啤酒糟3％，加入去皮马铃薯12％、麸皮1％共煮沸30min，过滤去渣即得培养基浸煮液，再加入KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O 1g/L、pH值6.0、琼脂3g/L，柿木屑添加量为10％，粉碎过80目筛后直接加入培养基中，即得发酵培养液，培养液分装完毕后，瓶口包扎四层棉布，棉布外加盖两层报纸，进行高压灭菌，121℃、0.1-0.15MPa灭菌30min；

将灭过菌的液体培养基中放入接种箱中，表面紫外或甲醛熏蒸灭菌后进行接种，每瓶接精筛保存的PDA斜面菌种1cm²大小菌块四块，静置24h后放入转速为160r/min、温度为25℃恒温摇床培养96h，生物量达到25g/100mL以上，镜检合格后使用；

B-2、麦粒菌种扩种：培养基为麦粒79％、柿木屑20％、生石灰1％，将麦粒用自来水浸泡10h后，煮沸至麦粒掰开无白芯为止，滤去水分，摊开晾干，加入柿木屑、生石灰搅拌均匀，pH值自然，用500mL的细口瓶或双层聚丙烯塑料袋装至瓶/袋肩，0.10-0.15MPa灭菌2.5h；避光培养至满瓶/袋后7-15天即可在金顶侧耳栽培过程中应用；

C、金顶侧耳栽培：取步骤A-4的栽培料培养基，装入17cm×32cm×0.05cm聚乙烯塑料袋，每袋装干料300g，121℃高压灭菌150min，冷却后，按照5-10％的接种量接入；

20℃避光培养至满袋后，敞开袋口进行生殖生长管理阶段，此阶段保持温度15-20℃，空气湿度85-95％。

2.根据权利要求1所述利用柿木屑栽培金顶侧耳的方法，其特征步骤A-1所述金顶侧耳种紫外诱变包括：

1)菌丝体制备：培养基配方为去皮马铃薯20％、麸皮2％、KH₂PO₄1g/L、MgSO₄·7H₂O 1g/L、pH值6.0、琼脂0.3％，培养条件为160r/min、温度为25℃恒温摇床培养7天，

2)原生质体制备：

2-1)将已培养好的菌丝置于离心管中6000r/min离心10min，去上清液，用浓度为109g/L甘露醇渗透压稳定剂洗三次，按每300mg湿菌丝加1mL酶解液酶解，酶解温度为30℃，酶解时间为150min；

酶解液是含有6g/L纤维素酶和6g/L蜗牛酶的混合酶的109g/L甘露醇溶液；

2-2)稀释：用浓度为109g/L甘露醇溶液稀释原生质体悬浮液至浓度为10⁵个/mL；

3)紫外诱变：紫外灯15W，照射距离30cm，照射剂量30s。

3.根据权利要求1所述利用柿木屑栽培金顶侧耳的方法，其特征在于步骤A-2、A-4、B-1所述柿木屑是柿木枝条粉碎，过80目筛得到的木屑粉；步骤B-2、C栽培用途下所述柿木屑，是柿木枝条粉碎成木屑样粉片。

4.根据权利要求1所述利用柿木屑栽培金顶侧耳的方法，其特征在于步骤A-4所述加入培养料的水溶液为柿树树叶浸提液，浸提方法是将自然风干的柿树树叶浸泡10h后，加热煮沸30min，料水配比为6g/100mL(w/v)，冷却过滤后装入试管中，121℃下高压灭菌150min备用。