CN105505782A

CN105505782A - 寄生于蒙古黄榆上粗毛纤孔菌的固体培养基和栽培料最佳配方

Info

Publication number: CN105505782A
Application number: CN201510320101.1A
Authority: CN
Inventors: 包海鹰; 王婷; 图力古尔
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2015-06-11
Filing date: 2015-06-11
Publication date: 2016-04-20

Abstract

本发明公开了寄生于蒙古黄榆上的粗毛纤孔菌的固体培养基及栽培料的最佳配方：固体培养基配方：葡萄糖20g、酵母浸粉2g、MgSO4?7H2O？0.5g，KH2PO4？1g,琼脂20g，蒸馏水1，000mL，用0.2mol/L？Na₂HPO₄?2H₂O和0.1mol/L柠檬酸调整初始pH为6.5，121℃灭菌30min后，放入超净工作台中紫外灭菌30min，到入平板中，冷却后接入粗毛纤孔菌菌种，30℃条件下培养。约12天左右即可长满平板。栽培料配方：将78%的木屑和2%的稻壳，按拌料的比例适量称量，润湿一晚后，次日加入17%的玉米粉，1%的蔗糖，1%的石灰和1%的石膏混匀，使拌料后的含水量60—62%。装袋后121℃灭菌2h后，超净工作台下紫外灭菌30min，冷却后接种，28℃下进行发菌，约28天后，菌丝即可长满菌袋。用以上固体培养基的配方上长出的粗毛纤孔菌菌丝粗壮、旺盛且色素产生状况较好。栽培料的配方可在较短时间内长出原基并可在相对较短时间内培育出粗毛纤孔菌的子实体。

Description

寄生于蒙古黄榆上粗毛纤孔菌的固体培养基和栽培料最佳配方

技术领域

本发明公开了寄生于蒙古黄榆上的粗毛纤孔菌的固体培养基及栽培料的最佳配方。

背景技术

粗毛纤孔菌Inonotus hispidus(Bull.)P.Karst.俗名粗毛黄孔菌,是一种生长在温带的木腐菌，桑黄中的一种,主要生长在活立木上,偶尔生长在倒木上。曾用名粗毛黄褐孔菌Xanthochrous hispidus,隶属于担子菌门Basidiomycota,伞菌纲Agaricomycetes,绣革孔菌目Hymenochaetales,绣革孔菌科Hymenochaetaceae,纤孔菌Inonotus子实体于夏季和秋季出现,晚秋后变黑,主要寄生在水曲柳Fraxinus mandschurica Rupr.、榆树Ulmuspumila L.、桑树Morus alba L.、苹果树Malus pumila Mill.和日本槐Sophora japonicaLinn.等阔叶树,东北地区主要寄生在水曲柳上,西北地区在桑树上常见；部分专家认为粗毛纤孔菌属于桑黄中的一种，而桑黄最早记载于《本草纲目》中。中医认为桑黄性甘，平，味苦，味辛，归肝，膀胱经。本品辛行甘和，入血分以化瘀，瘀血循经而行出血止，有化瘀之功效，用于血崩，血淋，脱肛泻血，带下，闭经等疾病；由于人们对其无节制的采摘，导致粗毛纤孔菌资源越来越匮乏且其野生子实体生长周期慢、腐蚀活木，寄生于蒙古黄榆上的粗毛纤孔菌在驯化栽培方面的研究未见报道，为此本专利首次对该粗毛纤孔菌进行研究，旨在找出其固体培养基和栽培料的最佳工艺，为大量人工栽培粗毛纤孔菌奠定基础。

发明内容

本发明公开了粗毛纤孔菌固体培养基和栽培料的最佳配方；

1材料与方法

1.1材料

粗毛纤孔菌Inonotus hispidus菌株、葡萄糖、酵母浸粉等；

1.2仪器

高温高压灭菌锅；超净工作台；电子计数天平(MARK MW3型),常熟市金羊砝码仪器有限公司；培养皿等；

2实验内容与方法

1.2方法

1.2.1菌种活化：采用PDA加富培养基对粗毛纤孔菌菌种进行活化培养；

加富PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蛋白胨1g,KH₂PO₄0.6g,MgSO₄·7H₂O 0.6g,蒸馏水1，000mL，pH自然；

1.2.2不同温度培养基筛选：以GPY培养基作为基础培养基，灭菌后将直径为0.8cm的菌饼接入至供试培养基，将其分别移入到15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃的6个梯度的生化培养箱中恒温培养，接种1d后开始每天固定时间用划线法测量菌丝直径、观察菌丝长势、菌落形状和色素产生情况，待有菌丝直径长至6cm左右且能清晰的看见菌丝边缘后停止记录；GPY培养基:酵母浸粉20g，葡萄糖20g,蛋白胨10g,MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 1g,琼脂25g，蒸馏水1，000mL；

1.2.3不同初始pH培养基筛选试验：以GPY培养基作为基础培养基，供试培养基灭菌前用0.2mol/L Na₂HPO₄·2H₂O和0.1mol/L柠檬酸，用二者适量混合配置成8个pH梯度即：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5共8个梯度，每个处理重复10次。灭菌后将直径为0.8cm的菌饼接入供试培养基，将其移入生化培养箱内30℃条件下恒温培养，接种1d后开始每天固定时间用划线法测量菌丝直径、观察菌丝长势、菌落形状和色素产生情况，待有菌丝直径长至6cm左右且能清晰的看见菌丝边缘后停止记录；

GPY培养基制作方法同1.2.2

1.2.4不同碳源培养基筛选试验：在无碳培养基的基础培养基上分别加入20g果糖(7.99g/L)、木糖(7.99g/L)、可溶性淀粉(7.99g/L)、葡萄糖(7.26g/L)、麦芽糖(7.99g/L)、蔗糖(8.41g/L)和乳糖(7.99g/L)作为碳源筛选试验的7种不同水平，每个处理重复10次并以无碳培养基作为对照，灭菌后将直径为0.8cm的菌饼接入供试培养基，将其移入生化培养箱内30℃条件下恒温培养，接种1d后开始每天固定时间用划线法测量菌落直径、观察菌丝长势、菌落形状和色素产生情况，待有菌丝直径长至6cm左右且能清晰地看见菌丝边缘后停止记录；

无碳培养基：酵母浸粉2g,KH₂PO₄2g,MgSO₄·7H₂O 1g,琼脂20g、蒸馏水1，000mL、pH自然；

1.2.5不同氮源培养基筛选试验：在无氮培养基的基础培养基上分别加入2g酵母浸粉(0.29g/L)、蛋白胨(0.29g/L)、牛肉膏(0.26g/L)、L-谷氨酸(0.19g/L)、硝酸钾(0.27g/L)、脲(0.93g/L)和硝酸铵(0.69g/L)作为氮源筛选试验的7种不同水平，每个处理重复10次并以无氮培养基作为对照，灭菌后将直径为0.8cm的菌饼接入供试培养基，将其移入生化培养箱内30℃条件下恒温培养，接种1d后开始每天固定时间用划线法测量菌落直径、观察菌丝长势、菌落形状和色素产生情况，待有菌丝直径长至6cm左右且能清晰地看见菌丝边缘后停止记录；

无氮培养基：葡萄糖20g,KH₂PO₄2g,MgSO₄·7H₂O 1g,琼脂20g、蒸馏水1，000mL、pH自然；

1.2.6正交试验：对以上温度、PH、碳源和氮源四个单因素进行筛选，从各因素筛选出3个水平进行四因素三水平的正交试验。在正交基础培养基的基础上按照正交表进行不同培养基的制作，灭菌前用1mol/L HCL和1mol/L NaOH调节相应的pH值，将0.8cm的菌饼接入相应的培养基中，分别移入相应的生化培养箱中按照相应温度恒温培养，接种1d后开始每天固定时间用划线法测量菌丝直径、观察菌丝长势、菌落形状和色素产生情况，待有菌丝直径长至6cm左右且能清晰地看见菌丝边缘后停止记录；

正交试验基础培养基：MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 1g,琼脂20g，蒸馏水1000mL；

1.2.7最佳栽培料的筛选：设计了三种栽培种培养料配方进行试验对比，通过实验结果筛选出三种配方中较好的配方，三种配方如下：

A:木屑76％，稻壳2％，玉米粉4％，麸皮15％，蔗糖1％，石灰1％，石膏1％，含水量60—62％；

B：木屑78％，稻壳2％，玉米粉17％，蔗糖1％，石灰1％，石膏1％，含水量60—62％；

C:木屑77％，麦麸20％，石灰1％，石膏1％，蔗糖1％，含水量60—62％；

实验前一晚，将木屑稻壳和麸皮，比例称量，润湿一晚。次日按上述配方的不同比例加入玉米粉、蔗糖、石灰和石膏。搅拌均匀后装入17cm×33cm规格的聚丙烯袋中，培养料的紧实度要适中，装袋高度约为14.5cm，重量约为0.65kg，将塑料打孔棒插入菌袋中心。每个处理重复20个。装袋完成后，放入高温高压灭菌锅内，121℃条件下灭菌2h。灭菌完成后放入超净工作台中紫外灭菌，冷却后进行接种，接种过程中将塑料打孔棒拨出，接入长满菌丝的以高粱为基质的原种，然后塞入灭过菌的脱脂棉，移入出菇室中26—28℃条件下培养。记录菌丝长势，色素产生情况和菌丝长满菌袋的天数，并根据相应文章查询出木屑、稻壳、玉米粉、麦麸和蔗糖的含碳量和含氮量，对以上A、B和C配方的碳氮比进行对比分析；

3结果与分析

2.1温度试验

在不同培养温度下，粗毛纤孔菌的菌落直径呈现出不同的生长状况(图1)，培养第14天时，以30℃为培养条件的粗毛纤孔菌菌落直径大于同期培养在其他温度下的菌落直径；在15℃—40℃的培养范围内，粗毛纤孔菌的菌丝均能生长，随着温度升高，其菌丝的生长速度加快，但当温度过高时，反而抑制了菌丝的生长，40℃条件下培养的菌丝生长速度最低；差异显著性检测结果表明，30℃和35℃对菌落直径的影响差异的显著性明显小于两者与其他温度处理间的差异显著性；因此，该菌菌丝的适宜生长温度范围为30℃—35℃；

粗毛纤孔菌在不同培养温度下培养至第14天时的菌落直径方差分析见表1，结果表明，粗毛纤孔菌菌落生长速度在不同培养温度下差异较显著，详见图1；

表1温度方差分析表

Table 1 Variance analysis of Inonotus hispidus colony growth underthe conditions of different temperatures.

2.2初始pH试验

在不同初始pH下，粗毛纤孔菌的菌落直径也呈现出不同的生长状况(图2),由图可以看出当pH在5.0—8.0范围内变化时，菌落直径差异较小，长势基本相同。pH为7.0和7.5时的菌落直径与其他pH条件下的菌落直径相比较小；pH为8.5时，菌落直径最大，但菌丝前期生长较慢，且菌落形状略不规则。其后依次为pH5.5、pH5.0、pH6.5、pH6.0和pH6.0；综合各因素，在不同pH条件下，使粗毛纤孔菌菌丝生长旺盛色素产生状况较好的条件为pH5.5、pH5.0和pH6.5；

粗毛纤孔菌在不同初始pH条件下培养至第12时的菌落直径方差分析见表2，实验结果表明，粗毛纤孔菌菌落生长速度在不同初始pH下差异显著，详见图2；

表2初始pH值方差分析表

Table 2 Variance analysis of Inonotus hispidus colony growth underthe conditions of different initial Ph values.

2.3碳源试验

在不同碳源条件下，粗毛纤孔菌的菌落直径呈现出不同的生长状况(图3)，以木糖为碳源的菌落直径大于同期其他碳源的菌落直径，以葡萄糖和果糖为碳源的菌落直径仅次于木糖，蔗糖次之，可溶性淀粉和空白对照组处于中间，而以麦芽糖和乳糖为碳源时，菌丝生长较慢；其中空白对照组菌丝虽比麦芽糖组和乳糖组生长快，但菌丝稀疏，长势较弱且色素产生较少；综合各个因素，在不同碳源条件下，使粗毛纤孔菌菌丝长势较强且色素产生较多的有木糖，葡萄糖和果糖次之；

粗毛纤孔菌在不同碳源下培养第17天时的菌落直径的方差分析表3，结果表明，粗毛纤孔菌菌落生长速度在不同碳源下的差异较显著，详见图3；

表3碳源方差分析表

氮源试验

在不同氮源下，粗毛纤孔菌的菌落直径也呈现出不同的生长状况(图4)，其中以L-谷氨酸为氮源的的菌落直径大于同期其他氮源的菌落直径，但前期生长较慢且菌丝稀疏较弱，色素产生较少；以酵母浸粉、牛肉膏和硝酸铵为氮源的菌落直径次之，其中以硝酸铵为氮源的菌丝稀疏较弱，色素产生较少且菌落形状极不规则；以硝酸钾和蛋白胨为氮源的菌落直径与空白对照组相近，其中以蛋白胨为氮源的菌落菌丝浓密长势较好；以脲为氮源的菌落直径效果最差，且菌丝稀疏，长势较弱，色素产生较少；综合各因素，在不同氮源下使粗毛纤孔菌菌丝生长旺盛色素产生良好的氮源是牛肉膏、蛋白胨和酵母浸粉；

粗毛纤孔菌在不同氮源下培养第14天时的菌落直径方差分析见表4，结果表明，粗毛纤孔菌菌落生长速度在不同氮源下的差异较显著，详见图4；

表4氮源方差分析表

Table 4 Variance analysis of Inonotus hispidus colony growth underthe conditions of different nitrogen sources.

正交试验

以上碳源、氮源、pH和温度四种单因素对粗毛纤孔菌菌丝生长影响的分析结果单一，没有考虑到其交互影响作用，所以，对以上单因素条件得出的结果不能作为最终的试验结论，应进行正交试验；选取碳源、氮源、pH和温度中最优良的3个条件进行4因素3水平的正交试验，试验结果直观分析可见表5；

由表5可见，温度的极差最大，为0.1513，即温度是影响粗毛纤孔菌菌丝生长的最主要因素；其次是氮源，极差为0.1087，碳源和pH分别为0.0232和0.0162；碳源中的X1最大，氮源中的X1最大，pH中的X3最大，温度中的X2最大，所以可得出粗毛纤孔菌的最佳生长条件碳源为木糖、氮源为酵母浸粉、初始pH为6.5和温度为30℃；

由表6可以看出，温度的F值最大为113.1001，氮源其次为53.9368，然后是碳源和pH依次为2.4042和1.2653；所以4种因素的显著性差异大小顺序为温度>氮源>碳源>pH，与直观分析结果一致；

表5菌丝生长的正交试验结果直观分析

Table 5 The result of direct-viewing analysis of mycelial growth.

注：*数据为10次的平均值和标准差；**“+++”表示菌丝长势较强，“++”表示菌丝长势一般，“+”表示菌丝长势较弱。

表6菌丝生长的正交试验结果的方差分析

Table 6 The result of F-test of mycelial growth.

栽培驯化

菌袋移入出菇室之前先用灭过菌的无菌水将戊二醛稀释喷雾进行消毒，防治霉菌等其他杂菌的污染，将菌袋移入用酒精消过毒的培养架上菌丝长满菌袋后菌移入出菇室，避光培养，每天定时通风，以保证氧气的供给，发菌初期温度保持在26-28℃，空气相对湿度65％左右为宜。发菌第3-5天后检查菌袋的污染情况，将污染的菌袋移出出菇室，以防污染其他菌袋；粗毛纤孔菌在三种不同配方的在配料中均能长出菌丝，其中以B配方培养料的菌丝长满菌袋时间较早即发菌完成时间为接种后28天，其次是以A配方为培养料的菌丝长满菌袋时间为30天，以C配方为培养料的菌丝长满菌袋时间最晚为33天；其中以B配方为培养料的菌丝长势较好，色素产生情况较好，以A和C配方为培养料的菌丝长势一般，色素产生较少；催蕾阶段，菌丝长满菌袋8天后对菌袋进行割口并将温度24-26℃，进行低温刺激有利于菇蕾的形成，加大湿度空气的相对湿度保持在90-95％。以B为配方为栽培料的菌袋首先形成原基，34天后，原基膨大呈鹅黄色；

出菇期管理，此阶段要保持较高的空气湿度和较低的CO2浓度，温度保持在26-28℃，温度过低或过高都会影响子实体正常生长和分化，子实体成熟后期应减少喷水量和喷水次数；每天固定时间通风，并保证一定的散色光照射时间；

采收，待菌袋中长出马蹄形状的子实体且子实体不在生长即可采收；

5结论

通过单因素试验和正交试验对粗毛纤孔菌的固体培养基进行了研究，并对栽培料的最佳配方进行了筛选；结果表明最佳固体培养基的配方为以木糖为碳源，以酵母浸粉为氮源，初始pH为6.5时，在30℃条件下恒温培养的条件为粗毛纤孔菌菌丝生长的最佳条件。但是，从栽培方向的角度来分析，由于木糖价格较高，可用葡萄糖将木糖取代，则最佳配方为：葡萄糖20g、酵母浸粉2g、MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO4 1g,琼脂20g，蒸馏水1，000mL，用0.2mol/L Na2HPO4·2H2O和0.1mol/L柠檬酸调整初始pH为6.5，30℃条件下培养。最佳栽培料的配方为：木屑78％，稻壳2％，玉米粉17％，蔗糖1％，石灰1％，石膏1％，含水量60—62％的比例为栽培种培养料可使粗毛纤孔菌菌丝生长旺盛且可较快的培养出子实体。

附图说明

图1是不同温度下培养的粗毛纤孔菌的菌落生长速度图

图2是不同初始pH下培养的粗毛纤孔菌的菌落生长速度图

图3是不同碳源下培养的粗毛纤孔菌的菌落生长速度曲线图

图4是不同氮源下培养的粗毛纤孔菌的菌落生长速度图。

Claims

1.粗毛纤孔菌（Inonotus hispidus）野生子实体具有一定的医疗保健作用，对其固体培养基及栽培料配方的探讨，可为大量的人工栽培奠定基础。

2.根据权利要求上所述的应用，其中粗毛纤孔菌固体培养基及栽培料配方的制作方法包括如下步骤：

一固体培养基的制备：称取葡萄糖20g、酵母浸粉2g、MgSO47H2O 0.5g，KH2PO4 1g,琼脂20g放入1L的三角瓶中并加入1L的蒸馏水，用0.2mol/L Na₂HPO₄2H₂O 和0.1mol/L 柠檬酸用pH计将初始pH调整到6.5，在高温高压灭菌锅中121℃下灭菌30min，灭菌完成后移入超净工作台中，紫外灭菌，备用；

二培养料配方的制备：将78%的木屑和2%的稻壳，按拌料的比例适量称量，润湿一晚后，次日加入17%的玉米粉，1%的蔗糖，1%的石灰和1%的石膏混匀，使拌料后的含水量60—62%。装袋后121℃灭菌2h后，超净工作台下紫外灭菌30min，冷却后，备用。