BR112018075997B1 - Processo de preparação in vitro de um extrato de células de mimosa pudica, extrato de cultura e seu uso, composição dermatológica e cosmética e seu uso e método cosmético não terapêutico - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a uma preparação obtida partindo de uma cultura in vitro de células não diferenciadas de Mimosa pudica bem como ao seu método de preparação; uma composição cosmética ou dermatológica que compreende a dita preparação; e a seus usos para o tratamento de distúrbios inflamatórios da pele, como um agente antioxidante no tratamento de estresse oxidativo causado pela poluição ambiental e como agente antienvelhecimento.

Description

DESCRIÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se à preparação derivada de uma cultura in vitro de células não diferenciadas de Mimosa pudica e ao processo para preparação da mesma; a uma composição cosmética ou dermatológica que compreende a dita preparação; e ao uso do mesmo para o tratamento de distúrbios inflamatórios da pele, como antioxidante incluindo o tratamento de estresse oxidativo causado pela poluição ambiental e como agente antienvelhecimento.

[0002] Mimosa pudica é uma planta medicinal que foi utilizada durante vários séculos na Ásia para tratar inflamação. A Mimosa pudica Linn. (Fabaceae) é conhecida por suas propriedades antidiabéticas (Marles 1995), antidepressivas (Molina 1999), anti-inflamatórias (Patel 2014), antioxidante (Patro 2016) e antibacterianas (Bhakuni 1969). É também utilizada na cicatrização de feridas (Paul et al., 2010. Int J Bio Med Res 1(4):223-227).

[0003] O extrato metanólico de folhas de Mimosa pudica contém moléculas ativas tais como terpenos, flavonoides, glicosídeos, alcaloides, quininas, fenóis, taninos, saponinas e cumarinas (Gandhiraja et al. 2009). As moléculas fenólicas contidas manifestam forte atividade antioxidante (Zhang et al. 2011. Pharmacogn. Mag 4:35-39). Entretanto, uma molécula importante isolada da planta é altamente notável por sua toxicidade: mimosina. Esta é um aminoácido não proteico (ácido beta- N(3-hidróxi-4-piridona)-alfa-amino propiônico). Foi mostrado que induz efeitos adversos em animais, tais como perda de apetite, perda de cabelo, distúrbios reprodutivos (Kulp K.S. 1996. Toxicology and applied pharmacology. 139:356-364). Também foi mostrado que inibe a germinação de sementes e a síntese de DNA em células em cultura (Williams RD et al., 2007. Allelopathy J. 19(2):423-430; Stuenzi et al., 1979). Parece que a mimosina é sintetizada pela planta com a finalidade de se defender dos ruminantes que se alimentam da mesma: causa problemas digestivos nos animais. A presença de mimosina em extratos de Mimosa pudica é um fator limitante para a valorização desta planta medicinal. Uma abordagem consistiria em descobrir meios de purificação para eliminá-la, mas esta abordagem complica os processos e requer um controle maior e, por consequência, custos de produção mais elevados.

[0004] A literatura é abundante para a preparação de extratos com solventes polares e não polares. O documento KR 10-1064848 descreve extratos a partir da planta através da utilização de solventes orgânicos tais como etanol e acetato de etila, para o tratamento de doenças autoimunes.

[0005] No contexto da presente invenção, a Requerente demonstrou uma nova valorização da Mimosa pudica através de uma rota alternativa: a cultura in vitro de células não diferenciadas totipotentes. De fato, foi observado de forma surpreendente que a cultura destas células em biorreator permite a obtenção de uma preparação na qual a mimosina foi significativamente eliminada; a dita preparação apresentando propriedades muito interessantes para o tratamento de distúrbios inflamatórios da pele, de estresse oxidativo e do envelhecimento da pele. Estas propriedades eram mais particularmente surpreendentes quando uma etapa de bioconversão era realizada durante o processo, esta etapa produzindo novos metabólitos que potencializam mais particularmente a atividade antioxidante. De forma inesperada, a Requerente constatou que estes metabólitos fazem parte dos N-fenilpropenoil-L aminoácidos (NPAs). Os NPAs como tais são conhecidos e altamente pesquisados por sua atividade farmacologicamente interessante (Hensel et al. Planta Med. 2007; 73:142-150; Zeng et al. J. Agric. Food Chem. 2011; 59:5342-5350). Até agora, não era sabido que a planta Mimosa pudica contém antioxidantes tais como os NPAs.

[0006] Em dermatoses inflamatórias, nas lesões da pele de pacientes com dermatite atópica no nível da epiderme, se observa uma superexpressão da citocina TSLP (Linfopoietina Estromal Tímica), que desempenha uma função crucial na patogênese de doenças alérgicas mediadas por uma resposta celular do tipo Th2 (Takai et al. 2012. Allergology Int. 61:3-17). A TSLP é descrita como responsável pelo prurido frequentemente presente na dermatite atópica e na psoríase. Os presentes inventores demonstraram pela primeira vez que um extrato de cultura de células vegetais (CCV) de Mimosa pudica obtido através do processo de acordo com a invenção apresenta atividades antioxidantes e anti-inflamatórias e exibem em particular uma inibição muito forte da TSLP no modelo in vitro de dermatite atópica. Os presentes inventores também demonstraram que na ausência de mimosina nos extratos dos presentes inventores, um extrato de CCV de Mimosa pudica de acordo com a invenção conserva a atividade farmacológica anti-inflamatória.

[0007] O processo de obtenção da preparação, o objetivo da presente invenção, consiste na desdiferenciação celular partindo do material vegetal derivado de Mimosa pudica, então na cultura de células suspensas no estado não diferenciado com a finalidade de se obter rapidamente uma biomassa fina, abundante, homogênea e estéril desta planta. A cultura de célula torna as vias de biossíntese desta planta mais versáteis no nível celular.

[0008] A presente invenção refere-se, portanto, a uma preparação derivada de uma cultura in vitro de células não diferenciadas de Mimosa pudica, uma composição cosmética ou dermatológica que compreende a dita preparação e a seu uso na cosmetologia e/ou dermatologia e mais preferencialmente para o tratamento de distúrbios inflamatórios da pele, como agente antioxidante incluindo o tratamento de estresse oxidativo causado pela poluição ambiental (tabaco, ar poluído em ambientes internos e externos por agentes químicos ou outros agentes alergênicos) e como agente antienvelhecimento.

[0009] Assim, a presente invenção refere-se a um processo de preparação in vitro de um extrato de células de Mimosa pudica que possui um teor de mimosina menor que 5 ng/g de matéria seca, que compreende as etapas a seguir:

[0010] - a. Fornecimento de material vegetal estéril de Mimosa pudica,

[0011] - b. Desdiferenciação de células do material vegetal,

[0012] - c. Cultura em suspensão das células não diferenciadas em um meio líquido para manutenção das mesmas no estado não diferenciado,

[0013] - d. Propagação da cultura de uma biomassa de células não diferenciadas no meio de cultura,

[0014] - e. interromper a propagação e obter um extrato de células que possui um teor de mimosina menor que 5 ng/g de matéria seca.

[0015] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o material vegetal de Mimosa pudica é selecionado do grupo que consiste de folha, caule, pecíolo, raiz, semente, flor e broto.

[0016] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que a etapa b) de desdiferenciação é realizada sobre um meio sólido que contém um ou mais fatores de crescimento.

[0017] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o um ou mais fatores de crescimento incluem um hormônio selecionado do grupo que consiste de auxinas, citocinas, giberelinas e misturas das mesmas.

[0018] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que a etapa b) de desdiferenciação é repetida de forma a se obter calos de células desdiferenciadas.

[0019] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que a etapa c) é realizada em um meio líquido que contém um ou mais fatores de crescimento.

[0020] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o um ou mais fatores de crescimento são os mesmos que aquele ou aqueles do meio de desdiferenciação.

[0021] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que a etapa d) de propagação de cultura é realizada através de subculturas ou diluições sucessivas no meio de cultura líquido até que seja obtida uma densidade celular constante.

[0022] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que compreende as etapas adicionais a seguir:

[0023] - f. separação do líquido/sólido,

[0024] - g. recuperação de um extrato de células que consiste de biomassa separada do meio de cultura que possui um teor de mimosina menor que 5 ng/g de matéria seca.

[0025] Em outra modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que compreende as etapas adicionais a seguir:

[0026] - f. separação do líquido/sólido,

[0027] - g. recuperação do extrato de células que consiste da fase líquida do meio de cultura que possui um teor de mimosina menor que 5 ng/g de matéria seca.

[0028] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa adicional de trituração do extrato e recuperação de um material celular triturado que possui um teor de mimosina menor que 5 ng/g de matéria seca.

[0029] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o material triturado resultante é submetido a uma separação do líquido/sólido seguida pela recuperação da fase líquida na forma do extrato de células que possui um teor de mimosina menor que 5 ng/g de matéria seca.

[0030] Em outra modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o material triturado resultante é submetido a uma separação do líquido/sólido seguida pela recuperação da fase sólida dos restos celulares na forma do extrato de células que possui um teor de mimosina menor que 5 ng/g de matéria seca.

[0031] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o meio de cultura da etapa c) e/ou da etapa d) contém um substrato de fenil-amônia-liase.

[0032] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o substrato de fenil-amônia- liase é selecionado do grupo que consiste de fenilalanina, em particular L-fenilalanina, ácido cinâmico, ácido aspártico, ácido glutâmico e misturas dos mesmos.

[0033] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o extrato resultante contém pelo menos um N-fenilpropenoil aminoácido.

[0034] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o N-fenilpropenoil aminoácido é selecionado do grupo que consiste de:

[0035] P1: 1-O-(4-cumaroil)-β-D-glicose

[0036] C15H18O8

[0037] P2: Ácido N-p-cumaroilaspártico ou ácido aspártico; forma (S), N-(4-Hidroxicinamoil)

[0038] C13H13NO6

[0039] P3: Ácido N-cis-(p-Cumaroil)glutâmico ou ácido glutâmico; forma (S), N-(4-Hidróxi-Z-cinamoil)

[0040] C14H15NO6

[0041] P5: 4-hidroxicinamida

[0042] C9H9NO2

[0043] P6: ácido glutâmico; forma (S), N-cinamoil

[0044] C14H14NO5

e misturas dos mesmos.

[0045] É também um objetivo da presente invenção fornecer um extrato de cultura in vitro de células de Mimosa pudica que pode ser obtido através de um processo de acordo com a presente invenção e que possui um teor de mimosina menor que 5 ng/g de matéria seca.

[0046] A invenção refere-se ainda a um extrato de cultura in vitro de células de Mimosa pudica, caracterizado pelo fato de que seu teor de mimosina é menor que 5 ng/g de matéria seca.

[0047] Em uma modalidade particular, o extrato de cultura in vitro de células de Mimosa pudica de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que contém pelo menos um N-fenilpropenoil aminoácido.

[0048] Em uma modalidade particular, o extrato de acordo com a invenção também é caracterizado pelo fato de que o pelo menos um N- fenilpropenoil aminoácido é selecionado do grupo que consiste de:

[0049] P1: 1-O-(4-cumaroil)-β-D-glicose

[0050] C15H18O8

[0051] P2: Ácido N-p-Cumaroilaspártico ou ácido aspártico; forma (S), N-(4-Hidroxicinamoil)

[0052] C13H13NO6

[0053] P3: Ácido N-cis-(p-Cumaroil)glutâmico ou ácido glutâmico; forma (S), N-(4-Hidróxi-Z-cinamoil)

[0054] C14H15NO6

[0055] P5: 4-hidroxicinamida

[0056] C9H9NO2

[0057] P6: ácido glutâmico; forma (S), N-cinamoil

[0058] C14H14NO5

e misturas dos mesmos.

[0059] De acordo com uma modalidade particular, o extrato de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o teor total do extrato em pelo menos um N-fenilpropenoil aminoácido é compreendido entre 1 e 50 μg/g de biomassa seca e mais preferencialmente entre 10 e 40 μg/g de biomassa seca.

[0060] De acordo com uma modalidade particular, o extrato de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que as células são células não diferenciadas.

[0061] Outro objetivo da invenção refere-se a um extrato que é descrito aqui para uso no tratamento de distúrbios inflamatórios da pele.

[0062] Outro objetivo da invenção refere-se a um extrato que é descrito aqui para uso como inibidor da Linfopoietina Estromal Tímica.

[0063] Em uma modalidade particular, os distúrbios inflamatórios da pele são selecionados de dermatite atópica, prurido e psoríase.

[0064] Uma composição para uso como inibidor da Linfopoietina Estromal Tímica que compreende um extrato de acordo com a invenção também é um objetivo da invenção.

[0065] Uma composição dermatológica para o tratamento de um distúrbio inflamatório da pele selecionado de dermatite atópica, prurido e psoríase, que compreende um extrato de acordo com a invenção em uma quantidade eficiente e pelo menos um excipiente dermatológico também é um objetivo da presente invenção.

[0066] A presente invenção refere-se ainda ao uso de um extrato de acordo com a invenção e como descrito aqui para o tratamento cosmético de envelhecimento da pele e de distúrbios da pele associados ao estresse oxidativo da pele, incluindo estresse oxidativo causado pela poluição ambiental.

[0067] A presente invenção refere-se ainda a uma composição cosmética que compreende um extrato de acordo com a invenção combinado com um excipiente cosmeticamente aceitável.

[0068] A invenção refere-se ainda a uma composição dermatológica que compreende um extrato de acordo com a invenção como descrito, combinado com um excipiente dermatologicamente aceitável.

[0069] Finalmente, a presente invenção refere-se ainda ao uso de uma composição de acordo com a invenção para o tratamento cosmético do envelhecimento da pele e de distúrbios da pele associados ao estresse oxidativo da pele, tal como o estresse oxidativo causado pela poluição ambiental.

Definições

[0070] A expressão "desdiferenciação" refere-se ao retorno das células para um estado meristemático, isto é, para o estado de células não diferenciadas, isto é, células que perderam suas características morfológicas e são fisiologicamente diferentes das células do tecido original dos quais faziam parte.

[0071] Em uma modalidade da invenção, o extrato possui um teor de mimosina menor que 5 ng/g de matéria seca, mais particularmente menor que 4 ng/g de matéria seca, ainda mais particularmente menor que 3 ng/g de matéria seca, ainda mais particularmente menor que 2 ng/g de matéria seca ou até mesmo mais particularmente menor que 1 ng/g de matéria seca.

[0072] É, portanto, particularmente notável e surpreendente que a cultura de acordo com a invenção de células de Mimosa pudica no estado não diferenciado permite a obtenção de um extrato praticamente desprovido de mimosina e este é todo o interesse da presente invenção devido à toxicidade deste composto.

[0073] No contexto da presente invenção, o termo "extrato" refere-se igualmente ao meio de cultura, uma vez que a propagação da cultura foi interrompida, principalmente composto de células de Mimosa pudica não diferenciadas imersas no meio de cultura líquido. Tal extrato contém entre 100 e 500 g de matéria seca por litro, particularmente entre 150 e 350 g/L. O material sendo principalmente composto da biomassa de células não diferenciadas.

[0074] O extrato de acordo com a invenção refere-se ainda à fração sólida do dito meio de cultura, isto é, a biomassa consistindo de células de Mimosa pudica não diferenciadas separadas do meio de cultura.

[0075] O extrato de acordo com a invenção refere-se ainda à fração líquida do dito meio de cultura, isto é, o meio de cultura livre de células de Mimosa pudica não diferenciadas.

[0076] Estas frações sólida e líquida podem ser facilmente obtidas através de uma técnica de separação do líquido/sólido bem conhecida pelo perito na técnica, que pode ser selecionada de centrifugação, decantação, filtração, por exemplo.

[0077] O extrato de acordo com a invenção também pode consistir de células de Mimosa pudica não diferenciadas trituradas. Tal material triturado pode ser obtido diretamente através da trituração do meio de cultura após interromper a propagação. Tal material triturado, portanto, contém os restos celulares de membrana e parede celulares, os conteúdos intracelulares, bem como o meio de cultura e os compostos e as moléculas contidos.

[0078] Tal material triturado que constitui o extrato de acordo com uma modalidade particular pode ser obtido através da trituração da fração sólida do meio de cultura, que consiste das células de Mimosa pudica não diferenciadas, que são obtidas anteriormente, bem como dos compostos e das moléculas contidos.

[0079] Um extrato de acordo com a invenção também pode consistir da fração sólida do material triturado que é definida anteriormente. Tal extrato compreende os fragmentos de parede e membrana celulares bem como certos compostos e moléculas contidos.

[0080] Finalmente, um extrato de acordo com a invenção pode ser representado pela fração líquida do material triturado após a ressuspensão e a trituração da fração sólida do meio de cultura que contém as células de Mimosa pudica não diferenciadas.

[0081] A trituração pode ser realizada através de quaisquer meios conhecidos pelos peritos na técnica, utilizando um misturador do tipo Utra-Turrax, por exemplo, ou através da agitação com esferas de vidro, opcionalmente auxiliada por ultrassom, por exemplo.

[0082] Isto mostra assim que o extrato de acordo com a invenção pode ser apresentado em várias formas.

[0083] Preferencialmente, o extrato de acordo com a invenção contém células de Mimosa pudica não diferenciadas inteiras ou células de Mimosa pudica não diferenciadas trituradas. Este extrato é caracterizado por seu teor de mimosina menor que 5, preferencialmente menor que 4, preferencialmente menor que 3, mais particularmente menor que 2, ainda mais particularmente menor que 1 ng/g de matéria seca.

[0084] No contexto de um extrato de acordo com a invenção que consiste da fração líquida desprovida da fração sólida (células inteiras ou fragmentos de células), a quantidade de mimosina é menor que 5, preferencialmente menor que 4, preferencialmente menor que 3, mais particularmente menor que 2, ainda mais particularmente menor que 1 ng/mL de extrato.

[0085] De maneira mais geral, culturas in vitro de tecidos vegetais em suspensão podem ser utilizadas para produzir compostos orgânicos ativos derivados diretamente do metabolismo primário ou secundário das células.

[0086] As células vegetais em suspensão são mantidas totipotentes em um estado não diferenciado similar àquele das células tronco para cultura de células de animais. Estas células vegetais são, portanto, teoricamente capazes de produzir todos os metabólitos observados na planta inteira. A desdiferenciação causa uma interrupção das vias biossintéticas de natureza genética ou epigenética de forma que os perfis químicos diferem quantitativamente e qualitativamente entre a planta inteira e as linhagens de células resultantes. Assim, teoricamente, intermediários de reação não observados na planta inteira podem aparecer na suspensão de células e vice-versa. Isto fornece um novo recurso e permite acesso à biodiversidade fitoquímica latente.

[0087] Um dos objetivos da presente invenção refere-se à preparação derivada de uma cultura in vitro de células de Mimosa pudica não diferenciadas.

[0088] Por células vegetais "não diferenciadas" ou "desdiferenciadas" entende-se qualquer célula vegetal que não possui qualquer característica de uma especialização particular, isto é, em um estado fisiológico similar ao dos tecidos meristemáticos da planta no estado natural. Estas células são capazes de viver por si mesmas e sem a dependência de outras células.

[0089] A desdiferenciação inicial de células de Mimosa pudica é obtida partindo de material vegetal vivo coletado da planta ou de broto jovem, seja folha, pecíolos, caule, raiz, semente, flor ou seus órgãos ou broto, mais particularmente de sementes ou folhas.

[0090] O processo de cultura de células desdiferenciadas é obtido in vitro através de qualquer método conhecido pelo perito na técnica, por exemplo, com referência a Murashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-496 / Plant Culture Media, Vol-1 Formulations and Uses E. F. George, D. J. M. Puttock e H. J. George (1987) Exegetics Ltd. Edington, Westbury, Wilts, BA134QG England.

[0091] Um extrato de acordo com a presente invenção pode ser obtido através da realização das etapas sucessivas a seguir:

[0092] a) desdiferenciação das células,

[0093] b) preparação de uma suspensão celular com um meio de cultura mantendo as células em um estado fisiológico não diferenciado,

[0094] c) propagação da cultura e produção de biomassa com um meio de cultura

[0095] d) em uma modalidade particular, enriquecimento do compartimento intracelular da cultura com metabólitos de interesse através de bioconversão

[0096] e) obtenção do extrato.

[0097] A preparação pode ser realizada em um frasco Erlenmeyer se o objetivo for produzir quantidades pequenas de biomassa ou em um biorreator para quantidades maiores. Por exemplo, a quantidade média coletada em um frasco Erlenmeyer com 500 mL de suspensão celular é 175 g de biomassa seca (ou 350 g de biomassa por L de suspensão celular), enquanto que a média coletada em um biorreator de 10 L é 3000 g de biomassa seca (300 g/L de biomassa).

[0098] Dependendo da espécie cultivada e sua sensibilidade ao estresse da cultura, tipos diferentes de biorreatores podem ser utilizados para melhorar o crescimento do tecido e a produção de metabólitos secundários. Há três modos principais para cultura de células vegetais em um biorreator:

[0099] 1. cultura descontínua ou em batelada,

[00100] 2. cultura de recarga/coleta ou em batelada alimentada e

[00101] 3. cultura contínua.

Etapa de esterilização do material vegetal:

[00102] Explantes de Mimosa pudica e mais particularmente sementes, são coletados e descontaminados com soluções de etanol a 70% então soluções de hipoclorito de sódio ou cálcio ou soluções de cloreto de mercúrio à temperatura ambiente durante vários minutos. Os tecidos são lavados com água destilada esterilizada então lavados pelo menos uma vez com água destilada esterilizada no final da descontaminação.

Etapa de desdiferenciação das células

[00103] Se forem utilizadas sementes, estas são descontaminadas e germinadas com um meio de nutrientes com ágar Murashige & Skoog, suplementado com sacarose e fatores de crescimento. Os últimos condicionarão o maquinário celular dos explantes de maneira a estimular a divisão celular e produzir grumos ou calos de células desdiferenciadas (calogênese). Os calos obtidos serão transferidos para meio com nutrientes para desdiferenciação fresco a cada 3 a 4 semanas. De fato, certos componentes deste meio com ágar podem ser metabolizados pelos calos ou degradados através da ação do ar.

[00104] Um perito na técnica também pode utilizar tecidos diferenciados tais como explantes de folhas, por exemplo, para obtenção de células não diferenciadas.

[00105] Em geral, para se obter uma desdiferenciação rápida e uma multiplicação celular intensa na forma de calos friáveis (calogênese) que promoverão a transferência para o meio líquido, uma composição hormonal com base nos fatores de crescimento tais como auxinas (picloram ou ácido 4-amino-3,5,6-tricloro-2-piridinacarboxílico) e citocininas (cinetina) foi testada de forma bem sucedida. As sementes esterilizadas podem ser colocadas em contato com o meio com ágar composto de um meio de 30 g/L de sacarose, 8 g/L de ágar, suplementado com 1,5 mg/L de cinetina e 2 mg/L de ácido 4-amino- 3,5,6-tricloro-2-piridinacarboxílico (picloram) e ajustado até pH 6 antes da autoclavação durante 20 min a 121°C (1 bar). As placas de Petri contendas sementes são incubadas na escuridão a 28°C. Os primeiros calos aparecem após alguns dias, em particular 2 semanas. Os calos resultantes são transferidos para meio fresco aproximadamente a cada 3 - 4 semanas através da divisão dos calos com um bisturi de forma a manter um tamanho de aproximadamente 2 a 3 cm. Estas transferências continuam durante várias semanas ou até mesmo vários meses, por exemplo, 6 a 8 meses, de maneira a se obter calos friáveis. Etapa de preparação de uma suspensão celular em um meio de cultura

[00106] A desdiferenciação das células através de transferências sucessivas dos calos sobre meio com ágar leva à formação de calos friáveis. Esta redução da coesão entre as células é uma consequência da desdiferenciação que pode ocorrer entre dois e seis meses dependendo da planta. Este estado é favorável para transferir para o meio líquido porque garante a desintegração dos calos na suspensão celular enquanto minimiza estresses mecânicos induzidos. Assim, uma coleção de calos friáveis é introduzida (10-20% em volume) no meio de nutrientes líquido preparado utilizando a mesma formulação que a do meio de desdiferenciação com ágar, mas sem o agente de gelificação.

[00107] Os calos friáveis são assim desintegrados no meio líquido através da ação de uma mesa de agitação durante vários dias e a suspensão celular resultante tem as partes de calos não desintegrados eliminadas, formando assim uma suspensão celular homogênea. Esta suspensão é cultivada de forma a se obter uma população celular suficientemente densa. Neste estágio, a suspensão é (subcultivada ou) diluída em meio com nutrientes fresco e cultivada da mesma maneira.

[00108] A suspensão celular inicial pode ser preparada através da colocação de aproximadamente 20 a 40 g de calos friáveis em um frasco Erlenmeyer de 500 mL contendo 200 mL de meio. Os calos friáveis são desintegrados no meio líquido através da ação de uma mesa de agitação durante 2 a 3 dias a 115 rpm na escuridão a 29°C. A seguir, a suspensão celular é coletada com uma pipeta, deixando aglomerados de calos residuais não desintegrados. A suspensão celular forma assim uma suspensão homogênea de microaglomerados de células. Esta suspensão é cultivada de forma a se obter uma população celular "suficientemente" densa. A suspensão celular resultante é cultivada durante 14 dias e então propaganda por diluição de 1/5 em meio fresco durante o mesmo período de tempo. A composição do meio de cultura (nutrientes, fatores de crescimento etc.) foi ajustada para maximizar a produtividade da biomassa. O resultado é o meio de propagação da biomassa SENSMS (ver a Tabela 1) otimizado para a suspensão celular líquida. Este meio é uma versão modificada do meio Murashige & Skoog para calogênese. Este meio é ajustado até pH 6 através da adição de KOH seguida pela autoclavação durante 20 min a 121°C (p = 1 bar) ou esterilização por filtração a 0,2μm. Tabela 1: Meio SENSMS, que é uma versão modificada do meio Murashige & Skoog (MS) utilizado para cultura em suspensão de células sensíveis em um frasco Erlenmeyer ou um biorreator sob condições ótimas.

Propagação da cultura e produção de biomassa com um meio de cultura

[00109] Após várias dessas subculturas, a suspensão celular é estabilizada quando a densidade celular obtida ao longo do perído é constante. São então possíveis ajustes na composição do meio de cultura (nutrientes, fatores de crescimento etc.) com a finalidade de maximizar a produtividade da biomassa. Este meio otimizado é utilizado como meios de produção de biomassa com a finalidade de extrair os princípios ativos.

[00110] A cultura de células sob condições "ótimas" estabelecidas dessa maneira é estabilizada e mantida em um frasco Erlenmeyer (propagação da cultura) com uma diluição de 1/5 da suspensão celular a cada 14 dias. Isto é equivalente a uma cultura de células inoculada com aproximadamente 60 g/L de biomassa fresca que produz uma suspensão celular de aproximadamente 350 g/L após 14 dias de cultura; ou inoculada em um biorreator quando necessário.

[00111] A biomassa fresca representa 100 a 500 g por litro de suspensão e mais preferencialmente entre 200 e 350 g por litro de suspensão.

Etapa opcional: Enriquecimento do compartimento intracelular da cultura em metabólitos de interesse através de bioconversão

[00112] É algumas vezes essencial fornecer células com "precursores" cuja estrutura é suficientemente próxima à do produto final com esperança de que estes serão incorporados, modificados ou transformados utilizando o maquinário enzimático presente na célula.

[00113] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o meio de cultura da etapa c) e/ou da etapa d) contém um substrato de fenil-amônia-liase.

[00114] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o substrato de fenil-amônia- liase é selecionado do grupo que consiste de fenilalanina, em particular L-fenilalanina, ácido cinâmico, ácido aspártico, ácido glutâmico e misturas dos mesmos.

[00115] Em uma modalidade particular, o processo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o extrato resultante contém pelo menos um N-fenilpropenoil aminoácido.

[00116] Este processo de modificação de um precursor pela célula é chamado de bioconversão. A adição de precursores ao meio de cultura pode ser uma abordagem interessante para aumentar a produção de metabólitos secundários de interesse. Este conceito se baseia no princípio de que qualquer composto que é um intermediário de reação na via de biossíntese do metabólito de interesse pode provavelmente aumentar o rendimento do produto final.

[00117] Assim, com base na estrutura de NPAs (ver a Figura abaixo), certas moléculas (aminoácidos) parecem ser precursores destes intermediários de reação. Por exemplo, o aminoácido L-fenilalanina é um precursor útil para modular de forma positiva a atividade de uma enzima Fenil-Amônia-Liase (PAL). Similarmente, o ácido cinâmico pode estar na origem deste mesmo fenômeno. Várias combinações também podem ser consideradas, particularmente com ácido aspártico ou ácido glutâmico. Os presentes inventores realizaram muitos experimentos utilizando estes vários precursores (individualmente ou em combinação) e, de forma surpreendente, com L-fenilalanina os presentes inventores obtiveram NPAs úteis que nunca foram descritos em células de Mimosa pudica tais como:

[00118] P1: 1-O-(4-cumaroil)-β-D-glicose

[00119] C15H18O8

[00120] P2: Ácido N-p-cumaroilaspártico ou ácido aspártico; forma (S), N-(4-Hidroxicinamoil)

[00121] C13H13NO6

[00122] P3: Ácido N-cis-(p-cumaroil)glutâmico ou ácido glutâmico; forma (S), N-(4-Hidróxi-Z-cinamoil)

[00123] C14H15NO6

[00124] P5: 4-hidroxicinamida

[00125] C9H9NO2

[00126] P6: ácido glutâmico; forma (S), N-cinamoil

[00127] C14H14NO5

e misturas dos mesmos.

Obtenção do extrato

[00128] Após interromper a propagação, a suspensão celular resultante pode ser filtrada ou centrifugada para separá-la do meio de cultura e se obter tanto meio extracelular (ou sobrenadante de cultura) quanto a biomassa coletada. A biomassa pode então ser tratadas de maneiras diferentes dependendo do uso. Este é seca por liofilização ou ressuspensa, por exemplo, a 30% em 68,2% de glicerina com 0,8% de carragenana e 1% de ácido cítrico. A extração do solvente também pode ser realizada na suspensão celular primeiramente realizando a dispersão das células com ultrassom ou prensa francesa, por exemplo.

Formulação

[00129] Outro objetivo da invenção refere-se a uma composição cosmética ou dermatológica que compreende um extrato de cultura in vitro de células de Mimosa pudica que pode ser obtido através do processo de acordo com a invenção e um ou mais excipientes cosmeticamente e/ou dermatologicamente aceitáveis, preferencialmente pretendidos para aplicação tópica.

[00130] Os excipientes cosmeticamente e/ou dermatologicamente aceitáveis podem ser qualquer excipiente dentre aqueles conhecidos pelo perito na técnica. A composição de acordo com a invenção particularmente será uma composição tópica em particular na forma de creme, loção, gel, unguento, emulsão, microemulsão, spray etc.

[00131] A composição cosmética ou dermatológica de acordo com a invenção pode em particular conter aditivos e auxiliares de formulação, tais como emulsificantes, espessantes, agentes gelificantes, fixadores de água, agentes de espalhamento, estabilizantes, corantes, fragrâncias e conservantes.

[00132] Outro objetivo de acordo com a invenção é o uso de um extrato de acordo com a invenção no tratamento de distúrbios inflamatórios da pele, como agente antioxidante incluindo o tratamento de estresse oxidativo causado pela poluição ambiental e como agente antienvelhecimento.

[00133] "Distúrbio inflamatório da pele" significa dermatite atópica, prurido e coceira causada por prurido (inibição de TSLP), eczema e psoríase.

[00134] Preferencialmente, os ditos distúrbios inflamatórios dermatológicos consistem de dermatite atópica, prurido, eczema ou psoríase. De acordo com outra modalidade, a invenção de objetivo do presente pedido de patente refere-se a uma composição que compreende pelo menos, como princípio ativo, um extrato de acordo com a invenção.

[00135] A invenção, portanto, refere-se preferencialmente a uma composição cosmética ou dermatológica. A composição de acordo com a invenção é pretendida para o tratamento de distúrbios inflamatórios dermatológicos.

[00136] Preferencialmente, os ditos distúrbios inflamatórios dermatológicos consistem de dermatite atópica, prurido, coceira causada por prurido, eczema ou psoríase.

[00137] A composição de acordo com a invenção pode ser preparada na forma de uma emulsão de água em óleo (A/O) ou óleo em água (O/A), uma emulsão múltipla tal como, por exemplo, uma emulsão de água em óleo em água (A/O/A) ou uma emulsão de óleo em água em óleo (O/A/O), uma microemulsão ou outra na forma de uma hidrodispersão ou uma lipodispersão, um gel ou um aerossol. Os excipientes compatíveis dermatologicamente ou cosmeticamente podem ser qualquer excipiente dentre aqueles conhecidos pelo perito na técnica com uma visão de se obter uma composição para aplicação tópica na forma de leite, creme, bálsamo, óleo, loção, gel, gel espumante, unguento, spray etc.

[00138] Em adição às composições dermatológicas e cosméticas, a invenção refere-se ainda a composições farmacêuticas para uso como um produto medicinal.

[00139] A invenção refere-se assim a uma composição farmacêutica que compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Na presente descrição, um veículo farmaceuticamente aceitável é definido como um composto ou uma combinação de compostos contida em uma composição farmacêutica que não causa reações adversas e que, por exemplo, facilita a administração do(s) composto(s) ativo(s), aumenta seu prazo de validade e/ou sua eficácia no corpo, aumenta sua solubilidade em solução ou aprimora seu armazenamento. Estes veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos e serão adaptados pelo perito na técnica de acordo com a natureza e o modo de administração.

EXEMPLO: Cultura de células vegetais em um biorreator WAVE (5 L)

[00140] Materiais e métodos: O reator WAVE (Sartorius) com um volume útil de 5 L contendo 4 L de meio MS SENS (ver a tabela anterior para a composição) foi inoculado com 1 L de suspensão de cultura de células de M. pudica (densidade celular entre 300 e 400 g/L em peso fresco (FW)) Parâmetros:

[00141] • Temperatura: 27°C

[00142] • Volume de ar: 0,5 L/min (Ipm)

[00143] • Pressão: 5 mPa a 10 mPa

[00144] • Ângulo de agitação: 7°.

[00145] • pO2 mantido em 75% através do aumento de rpm entre D0 (19 rpm) e D9 (27 rpm)

[00146] • pO2 mantido em 75% através do enriquecimento do ar com O2 entre D9 (5% O2) e D15 (20% O2) a 25 rpm

[00147] Através do acompanhamento da cinética de crescimento, é observado um aumento na biomassa avaliado em peso fresco (FW) ou matéria seca (DW), correlacionado com o consumo de açúcar (decréscimo na curva) até o 13o dia de cultura, D13, quando o meio de bioconversão é adicionado.

Bioconversão e coleta

[00148] Após 13 dias (D13) de cultura em batelada de uma cultura de 4 L, a concentração celular está entre 300 e 350 g/L (FW), equivalente a 12 a 14 g/L (DW). Quando esta concentração celular é atingida, a bioconversão é realizada através da injeção dos precursores por esterilização por filtração: os presentes inventores selecionaram os vários aminoácidos (ácido aspártico, ácido cinâmico, ácido glutâmico ou L-fenilalanina) e sob as condições de cultura dos presentes inventores, a L-fenilalanina forneceu os melhores resultados em termos de rendimento de bioconversão de NPA. Aqui abaixo é mostrado um exemplo das concentrações dos seguintes precursores:

Meio de bioconversã ío que favorece os ácidos hid roxicinâmicos incluindo seus derivados, N-fenilpropenoil aminoácidos (NPAs)

[00149] Diluir os compostos em H2O e adicionar a mistura no biorreator através de esterilização por filtração. Após 48 h, isto é, entre D15 e D16, coletar a biomassa através de filtração direta utilizando uma "bolsa de nylon de 20 μm", por exemplo. A biomassa é lavada uma vez com um volume de água desmineralizada esterilizada equivalente ao volume da biomassa coletada. A concentração celular avaliada no D13 tem que ser equivalente (+/-10%) à do D15. Ao longo de toda a cultura, a redução no volume da suspensão é principalmente causada pelas amostras coletadas.

[00150] Um volume da cultura é coletado nos D13, D14, D15 e D16, então extraído com um solvente e os vários extratos são dissolvidos ali antes de serem analisados por HPLC acoplada à espectometria de massa. A figura mostra, em relação ao D13 (o dia em que o precursor L-fenilalanina foi adicionado), o surgimento gradual dos novos picos D14, D15 até a intensidade máxima ser atingida no D16.

[00151] Os picos P1, P2, P3, P4, P5 e P6 foram isolados no D16, analisados por espectrometria de massa e RMN para determinar a estrutura das moléculas. Não foi possível determinar a estrura do pico P4 que aparece em uma quantidade muito pequena. Pela primeira vez e de forma surpreendente, os presentes inventores descobriram que o precursor L-fenilalanina era o melhor aminoácido para bioconversão.

[00152] Os produtos de NPA P1, P2, P3, P5 e P6 foram identificados por espectrometria de massa e RMN.

[00153] Lista de nomes de NPA:

[00154] P1: 1-O-(4-cumaroil)-β-D-glicose

[00155] C15H18O8

[00156] P2: Ácido N-p-cumaroilaspártico ou ácido aspártico; forma (S), N-(4-Hidroxicinamoil)

[00157] C13H13NO6

[00158] P3: Ácido N-cis-(p-cumaroil)glutâmico ou

[00159] Ácido glutâmico; forma (S), N-(4-Hidróxi-Z-cinamoil)

[00160] C14H15NO6

[00161] P5: 4-hidroxicinamida

[00162] C9H9NO2

[00163] P6:

[00164] Ácido glutâmico; forma (S), N-cinamoil

[00165] C14H14NO5

EXEMPLO 2: DOSAGENS DE MIMOSINA NAS CÉLULAS VEGETAIS VERSUS FOLHAS DE MIMOSA PUDICA

[00166] O objetivo é desenvolver as condições analíticas para identificação e quantificação de mimosina nos extratos. A biomassa derivada da cultura em suspensão de células de M. pudica (com bioconversão) foi extraída com ETOH80 ou ETOH60. As folhas secas de M. pudica foram secas, trituradas e extraídas com os mesmos solventes. A L-Mimosina da Sigma é utilizada como referência para identificação e quantificação. As amostras foram analisadas por HPLC/espectometria de massa.

Materiais e métodos: Condições Analíticas

[00167] Espectrômetro de massa ABSciex TripleTOF 4600

[00168] Método (ES+): TOF (100ms) / MRM (50ms)

[00169] Coluna: Acquity HSS C18, 1,8μm, 2,1x100mm, sinterizada 0,5μm

[00170] Eluentes: A (H2O-0,1% de HCO2H) / B (CH3CN-0,1% de HCO2H)

[00171] Vazão: 500 μL/min

[00172] Injeções: 10 μL Gradiente:

[00173] Os ensaios quantitativos estabeleceram que o menor limite de quantificação (LLOQ) atingido na solução de controle é 5 ng/mL. Este LLOQ e o método de preparação das amostras hidroetanólicas dos presentes inventores confirmam a ausência de mimosina nas amostras de cultura de células dos presentes inventores no limite de detecção (1 ng de mimosina por g de biomassa):

[00174] • Extratos EtOH80 e EtOH60 de células (20% p/p) <1 ng/g de células frescas

[00175] • Extrato EtOH60 de células liofilizadas (5% p/p) <1 ng/g de células liofilizadas

[00176] • Extrato EtOH60 de plantas = 2160 ng/g de planta seca.

[00177] • Extrato EtOH80 de plantas = 780 ng/g de planta seca

[00178] As análises foram realizadas da mesma maneira que para as CCVs sem bioconversão (isto é, sem adição de precursores de NPA) e mostraram que o teor de mimosina também é < 1ng/g de células frescas ou liofilizadas.

[00179] Em conclusão, nas culturas de células vegetais de M. pudica dos presentes inventores, de forma surpreendente, não foi detectado qualquer elemento indesejável tal como a mimosina.

Exemplo 2 - Atividades anti-inflamatórias: comparação de extrato da planta vs. extrato da CCV

[00180] Neste exemplo, foi comparada a atividade anti-inflamatória de 2 extratos de Mimosa pudica (E11 e E13). O extrato E11 é proveniente da extração com acetato de etila das folhas de Mimosa pudica secas e trituradas e o extrato E13 é proveniente da extração com o mesmo solvente dos materiais triturados derivados da cultura de células vegetais de Mimosa pudica sem bioconversão em um frasco Erlenmeyer. Os 2 extratos foram pesados após a evaporação do solvente até a secura. Estes foram coletados em DMSO. Para avaliar e comparar a atividade anti-inflamatória dos 2 extratos nas mesmas concentrações, os presentes inventores possuem um teste farmacológico in vitro que consiste na estimulação de macrófagos de camundongos, células RAW264.7, que expressam sobre sua superfície o receptor TLR4 pelo LPS bacteriano de acordo com (Kang et al. 2002. J Pharmacol Exp Ther. 302:138-144). Vários parâmetros foram estudados e comparados com um anti-inflamatório de referência, dexametasona:

[00181] • a produção de nitritos através da técnica de Griess. O nível de nitrito reflete o nível de síntese de NO induzida pela nitrito óxido sintase induzível (iNOS).

[00182] • a secreção de citocina: interleucina-6 por ELISA

[00183] • a produção de TNF-alfa através do ensaio multiplex

CULTURA DE CÉLULAS

[00184] As células RAW264.7 são macrófagos de camundongos em linhagem. Estas células são aderentes e cultivadas em uma placa de 12 poços a 100000 células/cm2 (contador Millipore Scepter) em meio DMEM suplementado com 10% de SFB, 2 mM de L. glutamina e 50 μg/mL de gentamicina.

[00185] A uma confluências de aproximadamente 70%, as células são tratadas com extratos de Mimosa pudica E11(planta) ou E13(PCC) nas mesmas concentrações (em peso seco) ou com o anti-inflamatório de referência 1 μM de dexametasona (Biovison 1042-1) 1 h antes da ativação por 0,2 μg/mL de LPS [E. coli 055:B5]. As células são incubadas a 37°C sob 5% de CO2. Após 24 h, os sobrenadantes celulares são recuperados em gelo, centrifugados durante 5 min a 3000 rpm a 4°C, aliquotados e então armazenados a -80°C. Os testes com as células foram repetidos 3 vezes, incluindo duas vezes em duplicata. Os valores médios dos resultados são apresentados nos gráficos.

[00186] A viabilidade celular é monitorada por um teste metabólico com MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazólio) utilizando o SIGMA CGD1 Kit (kit baseado na atividade de uma enzima, succinato desidrogenase mitocondrial). Este teste foi realizado anteriormente para determinar as doses dos extratos que seriam testadas neste modelo.

DOSAGEM DE NITRITOS

[00187] O nível de síntese de NO é avaliado em sobrenadantes celulares frescos ou congelados (-80°C), sem afetar o ensaio. O princípio do ensaio se baseia na reação de Griess (diazotização) que produz um composto azo cor de rosa com absorbância em 540 nm.

DOSAGEM DE IL6

[00188] A IL-6 é dosada nos sobrenadantes celulares diluídos até 1/200por ELISA colorimétrico, de acordo com o protocolo do fornecedor (R&D Systems, kit M6000B).

DOSAGEM DE TNF ALFA

[00189] A dosagem simultânea de TNF-alfa nos sobrenadantes celulares foi realizada utilizando a tecnologia Luminex xMAP (MultiAnalyte Profiling) que se baseia nos princípios de citometria de fluxo e ELISA em uma microplaca de 96 poços. As microesferas utilizadas como substrato incorporam dois fluorocromos em uma proporção precisa, que confere aos mesmos um código de cor de identificação (fluorescências diferentes). O sistema óptico dos citômetro (Bio-Plex 200) consiste de dois lasers: um laser vermelho (X = 635 nm) excita em cada microesfera a mistura de corantes que a define e assim identifica a citocina que será dosada. O segundo laser, verde, (X = 532 nm) excita o fluorocromo repórter ligado ao anticorpo de detecção específico com a finalidade de quantificar a citocina. O sistema é controlado por um computador equipado com software de aquisição e análise de dados (Bio-Plex Manager version 4.1).

[00190] Após o descongelamento, os sobrenadantes foram testados diluídos até 1/10 e 1/40 em meio de cultura, utilizando um Milliplex Kit (MILLIPORE, item number MCYTOMAG-70K-04). O último inclui esferas específicas, anticorpos de detecção e padrões para dosagem de citocinas.

RESULTADOS

[00191] As concentrações são expressas na forma de médias. As porcentagens de inibição, quando citadas para os extratos, são relativas ao controle de 0,2% de DMSO. O DMSO é utilizado para dissolver a amostra seca antecipadamente, antes da diluição no tampão aquoso para os testes das células.

Legendas das Figuras:

[00192] FIGURE 1: DOSAGEM DE NITRITOS

[00193] FIGURE 2: DOSAGEM DE IL6

[00194] FIGURE 3: DOSAGEM DE TNF-alfa

[00195] As várias amostras são listadas no eixo das abscissas (da esquerda para direita):

[00196] • O: controle negativo - cultura de células RAW246.7 ativadas por 0,2 μg/mL de LPS.

[00197] • DEXA: controle positivo - incubação de células com 1 μM de dexametasona (Biovison 1042-1) 1 h antes de serem ativadas por 0,2 μg/mL de LPS.

[00198] • DMSO: incubação com o controle de solvente utilizado para solubilizar (E11 e E12) 1 h antes de serem ativados por 0,2 μg/mL de LPS.

[00199] • E11: incubação com extrato derivado de folhas de M. pudica (50 μg/mL) 1 h antes de ser ativado por 0,2 μg/mL de LPS.

[00200] • E13: com extrato derivado de células vegetais (50 μg/mL) 1 h antes de ser ativado por 0,2 μg/mL de LPS.

DOSAGEM DE NITRITOS

[00201] A produção de NO é exclusivamente induzível e pode ser significativamente inibida por dexametasona (%i = 35). 0,2% de DMSO não possui impacto sobre a dosagem. O extrato da planta E11 inibe fracamente (%i = 16%) a produção de nitritos enquanto que o extrato E13 inibe a produção de nitritos de uma maneira equivalente e próxima da inibição obtida com o anti-inflamatório de referência (%i = 32%).

DOSAGEM DE IL-6 POR ELISA

[00202] As células ativadas (O) com LPS secretam IL6. A dexametasona (DEXA) inibe a secreção de IL-6 (%i = 38%). Os extratos inibem a secreção de IL-6 para E11 (%i = 24%) e para E13 (%i = 31%)

DOSAGEM de TNF-alfa POR LUMINEX

[00203] As células RAW264.7 secretam TNF-alfa no estado basal (0,23 ng/mL em média). Esta produção é ativada por 0,2 μg/mL de LPS até 10 ng/mL de TNF-alfa. Esta ativação pode ser fracamente inibida por dexametasona (%i = 16%). O extrato de CCV E13 reduz a produção de TNF-alfa (%i = 40%). De maneira oposta, o extrato da planta E11 aumenta a produção de TNF-alfa e parece potencializar a atividade de LPS (+112%).

[00204] Em conclusão, os resultados mostram que os 2 extratos E11 e E13 na mesma concentração inibem fortemente a inflamação, refletida neste modelo por: inibição de nitritos NO, inibição da citocina IL6 pró-inflamatória como o controle DEXA. De forma surpreendente, sob estas condições experimentais, o extrato de CCV E13, melhor que DEXA, inibe TNF-alfa enquanto que o extrato da planta E11 potencializa o mesmo.

Exemplo 3: atividade antioxidante - teste da ORAC

[00205] A atividade antioxidante foi avaliada utilizando um teste de capacidade de absorbância do radical oxigênio (ORAC) (Dévalos A. et al.; Polish journal of food and nutrition sciences; 2003; 12/53:133-136). O valor da ORAC é utilizado para avaliar a capacidade antioxidante de um extrato. AAPH (dicloridrato de 2,2-azobis-2-metil-propanimidamida) é a fonte de radicais livres de peroxil. Neste teste este é utilizado para imitar a cinética de degradação da fluoresceína pelos radicais livres. Isto se traduz por uma redução da fluorescência ao longo do tempo e da concentração do extrato ou da referência testada (aqui Trolox). Trolox (um análogo da vitamina E) é conhecido como um antioxidante forte. A adição de Trolox (soluções padrões) ou do extrato protege a fluoresceína da degradação. Isto permite avaliar uma atividade antioxidante medida contra soluções padrões de Trolox.

[00206] • • Extratos de CCV de Mimosa pudica com uma etapa de bioconversão (NPAs). Batelada WO2. Amostras coletadas no D13, dia da bioconversão, no D14 às 10:00 h, no D14 às 16:00 h, D15, 16 e D17.

[00207] • • Diluição dos extratos amostrados em água.

Teste de ORAC

[00208] Soluções utilizadas: todas as soluções são preparadas em tampão fosfato a 75 mM, pH 7,6. 1,17 μM de fluoresceína (utilização de uma solução estoque a 117 mM, conservação 1 semana a 4°C). 125 mM de AAPH que será preparado de forma extemporânea. 1 mM de Trolox (conservação -20°C)

[00209] Preparação de soluções padrões de Trolox:

[00210] Colocar os seguintes em uma placa de 96 poços negra: 20 μL de antioxidante (soluções padrões de Trolox ou extrato que será testado (meio de cultura com células trituradas)) + 160 μL de 1,17 μM de fluoresceína. Incubar a placa coberta com filme 15 min a 37°C. Adicionar 20 μL de 125 mM de AAPH / poço. Incubar imediatamente a 37°C em um espectrofluorômetro (SpectraMax) e tirar uma leitura a cada minuto durante 90 min em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 nm. Cada teste é realizado em triplicata. Calcular as áreas sob a curva (AUCs) para cada um dos testes (soluções padrões de Trolox ou amostras). Determinar as AUCs líquidas = AUC do ponto da solução padrão ou amostra - AUC do branco. Representar graficamente a curva de calibração: concentração de Trolox (μM) como uma função de AUC líquida.

[00211] A equação linear é utilizada para determinar um equivalente de Trolox (μM) para cada uma das amostras analisadas. Eq de Trolox em μM = a x (Auc líquida) 2 + b x (AUC líquida) (a e b que são determinados pela equação linear).

[00212] O valor da ORAC corresponde a μmoles de Trolox / 100 g de extrato Valor da ORAC (TEAC) = eq de Trolox em μM X 20 X (100 000 / [do extrato testado] X 20)

[00213] A FIGURA 4 mostra a atividade antioxidante do extrato que contém 75 mg de matéria seca por mL, diluído até 1/200; antes e depois da etapa de bioconversão.

[00214] Resultados: no eixo das abscissas, um extrato de CCVWO2 coletado após X dias de cultura (tempo) D13, D14 às 10:00 h, D14 às 16:00 h e a cada 24 h após D15, D16, D17 e a atividade da última amostra, o controle do branco de 40% de ETOH individualmente (sem atividade antioxidante). É observado que no D14, após 13 dias de cultura e 1 dia após a bioconversão (adição de AA), a TEAC (μM eq de TROLOX) quintuplicou para estabilização até D16-D17. Em conclusão, a bioconversão permitiu potencializar a atividade antioxidante em virtude da presença de NPAs.

EXEMPLO 4: Farmacologia - Atividade sobre o modelo de dermatite atópica induzida (AD) in vitro

[00215] Avaliação multiparamétrica da atividade anti-inflamatória de Mimosa pudica em um modelo in vitro que exibe um fenótipo de dermatite atópica. O modelo farmacológico foi descrito por Castex-Rizzi et al. (Br J Dermatol. 2014. 170 Suppl 1:12-8)

4.1 . Extratos e compostos

[00216] Os extratos de CCV coletados partindo de meio de cultura de Mimosa pudica triturada, seca, padronizada W01D15 (com bioconversão) foram dissolvidos/diluídos em solução em 40% de EtOH nas concentrações iniciais de 75 mg/mL. Os compostos foram solubilizados de forma extemporânea para os testes de viabilidade bem como na dose apropriada para medir a ação farmacológica sobre o modelo de dermatite atópica induzida.

4.2 Tipo de célula

[00217] Queratinócitos epidérmicos humanos normais (NHEKs) da Lonza. As células são amplificadas sob condições de cultura padronizadas.

4.3 Indução de um fenótipo de dermatite atópica

[00218] As células NHEK são inoculadas e cultivadas em meio de cultura Keratinocyte-SFM. O meio de cultura é então substituído por meio contendo os compostos e os extratos que serão testados ou solvente utilizado como controle (EtOH40% em concentrações equivalentes àquelas utilizadas durante o tratamento com os compostos). Após uma "pré-incubação" de 1 h, a mistura indutora de inflamação (Poly (I:C), IL4, IL13) é adicionada e as células são cultivadas durante 24 h.

[00219] Um controle sem indutor e sem composto também é realizado em paralelo, permitindo que os presentes inventores validem o modelo induzido (NHEK vs NHEK + indutores).

[00220] As células NHEK também são tratadas com um produto de referência, 0,29 mM de dexametasona e utilizada como controle de eficácia.

[00221] O RNA é extraído das células após 24 horas de incubação com a mistura indutora.

4.5 Análise da expressão diferencial por RT-qPCR 4.5.1. Extração do RNA total e síntese de cDNA

[00222] A extração foi realizada utilizando RNABle (Eurobio) e o RNeasy Mini Kit da QIAGEN. O RNA total extraído é analisados em um espectrofotômetro (NanoDrop, ND1000, Thermo Scientific) e suas qualidades analisadas no gel de agarose.

4.5.2. A técnica de PCR quantitativa • Princípio

[00223] A PCR em tempo real é um método preciso, sensível e rápido que permite a quantificação relativa da taxa de expressão de um gene alvo em relação àquela de um gene de referência expresso de forma ubíqua. Esta técnica permite quantificar o RNA mensageiro. Esta operação é realizada após transcrição inversa dos RNAs no DNA complementar através da extensão de dois iniciadores localizados em cada lado do alvo que será amplificado utilizando uma DNA polimerase. A incorporação de um fluoróforo (SYBR Green) durante a etapa de hibridização da amplificação exponencial permite a quantificação e o monitoramento em tempo real da quantidade de produto da amplificação recém-formado. Os valores quantitativos são obtidos partindo do número limiar dos ciclos (Ct: para limiar do Ciclo) no qual o sinal aumenta, associado com o crescimento exponencial do produto da PCR, começa a ser detectado utilizando um programa de análise Biosystems PE de acordo com manual do fabricante. Assim, quanto maior a quantidade de cDNA do gene alvo no tempo zero, menor o número de Ct (número de ciclos para atingir o limiar).

[00224] Afim de padronizar as análises de RT-PCR quantitativa, é necessário quantificar no mesmo experimento pelo menos um controle endógeno chamado de o "gene de referência". Este "gene de referência" tem que ter uma expressão constitutiva independente da condição tratada ou não tratada das células. A expressão relativa dos genes alvos selecionados é calculada através do método ΔΔCt com o auxílio do software RQ (Relative Quantification) fornecido pelo fabricante (Applied Biosystems). Os valores de expressão de cada gene induzido por certo composto também são normalizados de forma que o valor das células NHEK de controle (células não tratadas e células tratadas com DMSO em % idêntica àquela utilizada como veículo para o composto) seja igual a 1. Portanto, o valor de RQ obtido para cada composto para certo gene representa a expressão relativa deste gene após o tratamento em relação às células de controle cuja expressão é 1.

• Escolha dos iniciadores

[00225] Os iniciadores foram escolhidos com o auxílio de programas de computador incluindo Oligo 4 (National Biosciences, Plymouth, MN). Os critérios de seleção consideram o tamanho do fragmento que será amplificado (entre 80 e 120 nucleotides), o tamanho dos iniciadores (entre 21 e 25 nucleotídeos), a temperatura de hibridização dos iniciadores (aproximadamente 65°C) e a posição dos iniciadores; de fato, os iniciadores são projetados de forma que um dos 2 iniciadores se transponha sobre um íntron e um éxon ou que os 2 iniciadores fiquem em dois éxons diferentes se o íntron que separa os mesmos for maior que 2 kbp. A escolha da posição bastante específica dos iniciadores evita a amplificação do DNA genômico no caso de contaminação da amostra mesmo nenhuma contaminação tiver sido observada nas curvas de dissociação (ABI, 7900HT). Todas estas preucações se originam do fato de que a menor contaminação pelo DNA genômico pode ter um impacto muito significativo sobre os resultados obtidos por uma tecnologia tão sensível quanto a RT-PCR quantitativa. Outro critério de seleção importante é garantir que o par de iniciadores selecionado não forma um duplex que interferiria de forma não específica com o produto da PCR específico obtido e assim distorceria o resultado (inerente na técnica SYBR Green utilizada). Finalmente, os iniciadores são escolhidos de forma que não contenham regiões consenso e/ou polimorfismos. A especificidade total das sequências de nucleotídeos escolhidas como iniciadores do gene alvo é testada através da preparação de uma colagem (blast de nucleotídeo- nucleotídeo) ao longo do genoma humano inteiro (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990).

• Curva de amplificação padrão

[00226] A eficiência dos iniciadores foi testada por diluições em série 5 vezes (4 pontos) preparadas em duplicadas sobre o RNA extraído das células NHEK. Somente os pares de iniciadores como uma eficiência próxima de 100% (inclinação da reta igual a 3,32) são mantidos. Uma amplificação de controle se molde (NTC) também é realizada para garantir que nenhum duplex é formado que distorceria os resultados da PCR quantitativa obtidos através do método SYBR Green. A curva de dissociação obtida no equipamento 7900HT é utilizada para garantir que o produto da amplificação obtido é único. Uma verificação regular da curva de amplificação padrão é realizada afim de prevenir qualquer redução na eficiência dos iniciadores.

• Amplificação

[00227] As amplificações são realizadas em um equipamento ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems) utilizando o método SYBR Green (SYBR Green PCR Core Reagents Kit, Applied Biosystems). A amplificação consiste de uma etapa de desnaturação (10 min a 95°C) então da repetição de 40 ciclos de hibridização (15 s a 95°C) e extensão (1 min a 65°C) que garantem uma duplicação exponencial de cada filamento.

• Genes quantificados

[00228] Os genes característicos de um fenótipo de DA que foram quantificados são listados na coluna à esquerda na Tabela 2. Os valores de resposta são normalizados. Da esquerda para direita na tabela, a coluna DA indica o nível de indução de cada gene (na ausência de agente ativo). A coluna ETOH40 corresponde aos valores gerados pelo solvente individualmente sem agente ativo com a finalidade de detectar eventualmente interferências de respostas causadas pelo solvente. As 2 colunas seguintes, W01, contêm a amostra que será testada em duas concentrações, 1,5 mg/mL e 0,75 mg/mL, respectivamente, após a indução. A última coluna mostra os valores gerados pelo controle positivo, 0,28 mM de dexametasona. Resultados TABELA 2

[00229] Os resultados apresentados nas tabelas mostram o poder de inibição dos genes pró-inflamatórios e inflamatórios (interleucinas e quimiocinas) e também a indução de peptídeos antimicrobianos (que são deficientes na dermatite atópica). Os peptídeos antimicrobianos que são fortemente induzidos são: DEFB103, RNASE7 e notavelmente psoriasina (S100A7) por W01 de uma maneira dependente da dose. As interleucinas inibidas são: IFNB1, IL1A e IL1B. Os receptores IL4R e TLR3 são suprimidos, o último se correlaciona bem com a inibição quase completa da quimiocina TSLP. Estes 2 fatores são superexpressos em pacientes com DA e mais particularmente no caso em que aparece prurido (Miyagaki et al. 2015. J Dermatol Science 78:89-94). Esta é a primeira vez que os presentes inventores demonstraram tal inibição anti-TSLP forte pelo extrato de CCV de Mimosa pudica neste modelo de DA in vitro. As quimiocinas CCL11, CCL13, CCL20, CCL27, CCL5, CX3CL1, IL15 e notavelmente IL8 foram fortemente inibidas pelo extrato W01 independente da dose. Em resumo, este experimento mostra que o extrato de CCV de Mimosa pudica inibe a maioria dos fatores pró-inflamatórios e inflamatórios bem como, se não melhor que, o controle de dexametasona, em particular o fator TSLP que causa prurido em pacientes com DA.

Claims (23)

1. Processo de preparação in vitro de um extrato de células de Mimosa pudica que possui um teor de mimosina menor que 5 ng/g de matéria seca, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas a seguir: - (a) fornecer material vegetal estéril de Mimosa pudica, - (b) desdiferenciar as células do material vegetal, - (c) cultivar em suspensão as células não diferenciadas em um meio líquido para manutenção das mesmas no estado não diferenciado, - (d) propagar a cultura de uma biomassa de células não diferenciadas no meio de cultura, - (e) interromper a propagação e obtenção de um extrato de células que possui um teor de mimosina menor que 5 ng/g de matéria seca.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material vegetal de Mimosa pudica é selecionado do grupo que consiste de folha, caule, pecíolo, raiz, semente, flor e broto.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada sobre um meio sólido que contém um ou mais fatores de crescimento.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é repetida de forma a se obter calos de células desdiferenciadas.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) é realizada em um meio líquido que contém um ou mais fatores de crescimento.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapa (d) é realizada por subculturas ou diluições sucessivas no meio de cultura líquido até que seja obtida uma densidade celular constante.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda as etapas a seguir: - (f) separar o líquido/sólido, - (g) recuperar um extrato de células que consiste de biomassa separada do meio de cultura que possui um teor de mimosina menor que 5 ng/g de matéria seca.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de triturar o extrato e recuperação de um material celular triturado que possui um teor de mimosina menor que 5 ng/g de matéria seca.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura da etapa (c) e/ou da etapa (d) contém um substrato de fenil-amônia- liase.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o extrato resultante contém pelo menos um N-fenilpropenoil aminoácido.

11. Extrato de cultura in vitro de células de Mimosa pudica que pode ser obtido através de um processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que possui um teor de mimosina menor que 5 ng/g de matéria seca.

12. Extrato de cultura, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que contém pelo menos um N-fenilpropenoil aminoácido.

13. Extrato de cultura, acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que as células são células não diferenciadas.

14. Extrato de cultura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de distúrbios inflamatórios da pele.

15. Composição dermatológica, caracterizada pelo fato de que compreende um extrato de cultura, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, e pelo menos um excipiente dermatológico selecionado do grupo consistindo em emulsificantes, espessantes, gelificantes, fixadores de água, agentes de espalhamento, estabilizantes, corantes, fragrâncias e conservantes; sendo que é para o tratamento de um distúrbio inflamatório da pele selecionado de dermatite atópica, prurido e coceira causada por prurido, eczema e psoríase.

16. Uso de um extrato de cultura, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento cosmético de envelhecimento da pele e de distúrbios da pele associados ao estresse oxidativo da pele, incluindo estresse oxidativo causado pela poluição ambiental.

17. Composição cosmética, caracterizada pelo fato de que compreende um extrato de cultura, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, combinado com um excipiente cosmeticamente aceitável selecionado do grupo consistindo em emulsificantes, espessantes, gelificantes, fixadores de água, agentes de espalhamento, estabilizantes, corantes, fragrâncias e conservantes.

18. Composição dermatológica, caracterizada pelo fato de que compreende um extrato de cultura, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, combinado com um excipiente dermatologicamente aceitável selecionado do grupo consistindo em emulsificantes, espessantes, gelificantes, fixadores de água, agentes de espalhamento, estabilizantes, corantes, fragrâncias e conservantes.

19. Uso de uma composição, como definida na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento cosmético de envelhecimento da pele e de distúrbios da pele associados ao estresse oxidativo da pele, tal como estresse oxidativo causado pela poluição ambiental.

20. Uso de um extrato de cultua, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição dermatológica para o tratamento de um distúrbio inflamatório de pele.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o distúrbio inflamatório de pele é selecionados de dermatite atópica, prurido e coceira causada por prurido, eczema e psoríase.

22. Uso de um extrato de cultura, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição cosmética para o tratamento cosmético de envelhecimento da pele e de distúrbios da pele associados ao estresse oxidativo da pele, tal como estresse oxidativo causado pela poluição ambiental.

23. Método cosmético não terapêutico para o tratamento do envelhecimento da pele ou de distúrbios associados ao estresse oxidativo da pele, como o estresse oxidativo devido à poluição ambiental, caracterizado pelo fato de que compreende a administração do extrato de cultura, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, a uma pessoa que necessita do mesmo.

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