KR102507491B1 - 미모사 푸디카 미분화 세포 추출물 및 피부과 및 화장료에 있어서 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미모사 푸디카 미분화 세포의 시험관 내 배양액으로부터 유래하는 제제뿐만 아니라, 이의 제조 방법; 이 제제를 포함하는 화장품 조성물 또는 피부과 조성물; 그리고 염증성 피부 병태를 치료하기 위한, 예컨대 환경 오염으로 인한 산화 스트레스를 치료하기 위한 항산화제, 그리고 노화 방지제로서의 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 미모사 푸디카(Mimosa pudica) 미분화 세포의 시험관 내 배양액으로부터 유래하는 제제와, 이를 제조하기 위한 방법; 이 제제를 포함하는 화장품 조성물 또는 피부과 조성물; 그리고 염증성 피부 장애를 치료하기 위한, 예컨대 환경 오염으로 인한 산화 스트레스를 치료하기 위한 항산화제, 그리고 노화 방지제로서의 이의 용도에 관한 것이다.
미모사 푸디카는 수 세기 동안 아시아에서 염증을 치료하는데 사용되어 온 약용 식물이다. 미모사 푸디카 린.(Mimosa pudica Linn.)(콩과)의 항당뇨병 특성(Marles 1995), 항우울 특성(Molina 1999), 소염 특성(Patel 2014), 항산화 특성(Patro 2016) 및 항균 특성(Bhakuni 1969)은 공지되어 있다. 이는 또한 상처 치유에도 사용되고 있다(Paul et al., 2010. Int J Bio Med Res 1(4):223-227).
미모사 푸디카 잎의 메탄올 추출물은 활성 분자, 예컨대 테르펜, 플라보노이드, 글리코시드, 알칼로이드, 퀴닌, 페놀, 탄닌, 사포닌 및 쿠마린을 함유한다(Gandhiraja et al. 2009). 함유된 페놀 분자는 강력한 항산화 활성을 발휘한다(Zhang et al. 2011. Pharmacogn. Mag 4:35-39). 그러나, 이 식물로부터 분리되는 주요 분자(미모신) 자체는 독성을 가지는 것으로 매우 유명하다. 이는 비단백성 아미노산(베타-N(3-하이드록시-4-피리돈)-알파-아미노 프로피온산)이다. 이는, 동물에 있어서 부작용, 예컨대 식욕 상실, 탈모, 생식 장애를 유도하는 것으로 확인되었다(Kulp K.S. 1996. Toxicology and applied pharmacology. 139:356-364). 또한 이는 배양된 세포에서의 DNA 합성 및 종자 발아를 억제하는 것으로도 확인되었다(Williams RD et al., 2007. Allelopathy J. 19(2):423-430; Stuenzi et al., 1979). 미모신은 식물이, 반추동물에 의해 뜯어 먹히는 것으로부터 자신을 보호하기 위해 스스로가 합성하는 것으로 생각되는데; 이 미모신은 동물의 소화 기능에 문제를 일으킨다. 미모사 푸디카 추출물 중에 미모신이 존재하는 것은, 이 약용 식물의 더 높은 가치 부여에 있어 제한적인 요소가 된다. 한 가지 접근법은 미모신을 제거하기 위한 정제 수단을 찾는 것으로 이루어질 것이지만, 이러한 접근법은 공정을 복잡하게 만들고, 더욱 엄격한 모니터링을 필요로 하므로, 생산 비용이 더 들어가게 된다.
극성 용매와 무극성 용매로 추출물을 제조하는 것에 관한 문헌은 많이 있다. 특허문헌 KR 10-1064848은, 유기 용매, 예컨대 에탄올과 아세트산에틸을 사용하여 식물로부터 제조된 것으로서, 자가면역질환 치료용 추출물을 기술하고 있다.
본 출원인은 본 발명의 내용 중에 대안적 경로(즉 미분화 전능성 세포의 시험관 내 배양)를 통한 미모사 푸디카의 새로운 가치 부여 방법을 보여주었다. 실제로 놀랍게도 이러한 세포의 생물반응기 배양이 미모신이 유의미하게 제거된 것으로서, 염증성 피부 장애, 산화 스트레스 및 피부 노화 치료에 매우 매력적인 특성을 가지는 제제를 수득할 수 있게 해 준다는 것이 주목되었다. 이러한 특성은, 생물전환 단계가 공정중에 수행될 때, 무엇보다도 특히 항산화 활성을 증진시키는 신규 대사물질이 생성된다는 점에서 특히 더 놀라운 것이었다. 예상 외로, 본 출원인은, 이 대사물질이 N-페닐프로페노일-L-아미노산(NPA)의 일부분임을 알아냈다. NPA 자체의 유리한 약리 활성에 대해 알려진 이후로는 그 수요가 매우 늘어났다(Hensel et al. Planta Med. 2007; 73:142-150; Zeng et al. J. Agric. Food Chem. 2011; 59:5342-5350). 미모사 푸디카 식물이 NPA와 같은 항산화제를 함유한다는 사실은 지금까지 알려진 바 없었다.
염증성 피부병, 아토피 피부염 환자의 피부 병변(표피)에는 시토카인 TSLP(흉선기질림포포이에틴; thymic stromal lymphopoietin)이 과발현되는데, 이 TSLP는 Th2형 세포 반응에 의해 매개되는 알레르기성 질환의 발병에 중요한 역할을 한다(Takai et al. 2012. Allergology Int. 61:3-17). TSLP는 아토피 피부염과 건선에서 종종 일어나는 소양증에 관여하는 것으로 기술되어 있다. 본 발명자들은, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 미모사 푸디카의 식물 세포 배양(PCC) 추출물이 항산화 활성과 소염 활성을 가지고, 특히 아토피 피부염 시험관 내 모델에 있어서 TSLP의 매우 강력한 억제를 보인다는 것을 처음으로 입증하였다. 본 발명자들은 또한 본 발명의 추출물 중에 미모신이 존재하지 않을 때, 본 발명에 따른 미모사 푸디카의 PCC 추출물이 소염 약리 활성을 보유한다는 것도 입증하였다.
본 발명의 목적인 제제를 수득하기 위한 방법은, 미모사 푸디카에서 유래하는 식물 재료를 대상으로 세포 탈분화를 진행한 다음, 현탁된 세포를 미분화 상태로 배양하여, 이 식물의 양질이면서, 풍부하고, 균질하며, 멸균된 바이오매스를 신속하게 수득하는 단계로 이루어져 있다. 세포 배양은, 이 식물의 생합성 경로들을 세포 수준에서 더 융통성있게 만들어준다.
그러므로 본 발명은 미모사 푸디카 미분화 세포의 시험관 내 배양액으로부터 얻어진 제제, 이 제제를 포함하는 화장품 조성물 또는 피부과 조성물, 그리고 화장품학 및/또는 피부과학에 있어서 이의 용도, 더욱 우선적으로는 염증성 피부 장애 치료, 예컨대 환경 오염(담배 연기, 화학 제제 또는 알레르기원에 의한 실내 및 실외 공기 오염)으로 말미암은 산화 스트레스의 치료에 있어서 이의 항산화제로서의 용도, 그리고 노화 방지제로서의 용도에 관한 것이다.
그러므로 본 발명은 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 미모사 푸디카 세포 추출물의 시험관 내 제조를 위한 방법으로서, 하기 단계들, 즉
a. 미모사 푸디카의 멸균 식물 재료를 제공하는 단계;
b. 식물 재료로부터 유래한 세포를 탈분화하는 단계;
c. 탈분화된 세포를 미분화 상태로 유지시키기 위해 미분화 세포를 액체 배지 중에 현탁 배양하는 단계;
d. 미분화 세포 바이오매스를 배양 배지 중에서 번식 배양하는 단계;
e. 번식을 중단시키고, 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 세포 추출물을 수득하는 단계
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 미모사 푸디카 식물 재료가 잎, 줄기, 잎자루, 뿌리, 종자, 꽃 및 싹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 탈분화 단계인 단계 b)가 하나 이상의 성장 인자를 함유하는 고체 배지상에서 수행되는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 하나 이상의 성장 인자가 옥신, 시토카인, 지베렐린 및 이것들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 호르몬을 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 탈분화된 세포 캘러스(callus)를 수득하기 위해 탈분화 단계인 단계 b)가 반복되는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 단계 c)가 하나 이상의 성장 인자를 함유하는 액체 배지 중에서 수행되는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 하나 이상의 성장 인자가 탈분화 배지 중의 성장 인자와 동일한 것 또는 동일한 것들인 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 일정한 세포 밀도가 얻어질 때까지 번식 배양 단계인 단계 d)가 연속적인 계대배양 또는 희석에 의해 액체 배양 배지 중에서 수행되는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 하기 추가 단계들, 즉
f. 액체/고체 분리 단계;
g. 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 것으로서, 배양 배지로부터 분리된 바이오매스로 이루어진 세포 추출물을 회수하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 하기 추가 단계들, 즉
f. 액체/고체 분리 단계;
g. 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 것으로서, 배양 배지의 액체 상으로 이루어진 세포 추출물을 회수하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 추가 단계, 즉 추출물을 파쇄하는 단계 및 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 파쇄 세포 재료를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 얻어진 파쇄 재료를 대상으로 액체/고체 분리가 수행된 다음, 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 세포 추출물로서 액체 상이 회수되는 것을 특징으로 한다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 얻어진 파쇄 재료를 대상으로 액체/고체 분리가 수행된 다음, 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 세포 추출물로서 세포 파편 고체 상이 회수되는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 단계 c) 및/또는 단계 d)의 배양 배지가 페닐-암모니아-리아제 기질을 함유하는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 페닐-암모니아-리아제 기질이 페닐알라닌, 구체적으로 L-페닐알라닌, 신남산, 아스파르트산, 글루탐산 및 이것들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 얻어진 추출물이 적어도 하나의 N-페닐프로페노일 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 N-페닐프로페노일 아미노산이
P1: 1-O-(4-쿠마로일)-β-D-글루코스
C15H18O8
P2: N-p-쿠마로일아스파르트산 또는 아스파르트산; (S)-형, N-(4-하이드록시신나모일)
C13H13NO6
P3: N-cis-(p-쿠마로일)글루탐산 또는 글루탐산; (S)-형, N-(4-하이드록시-Z-신나모일)
C14H15NO6
P5: 4-하이드록시신나미드
C9H9NO2
P6: 글루탐산; (S)-형, N-신나모일
C14H14NO5
및 이것들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법에 의해 수득 가능하고, 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인, 미모사 푸디카 세포의 시험관 내 배양 추출물을 제공하는 것도 또한 본 발명의 목적이다.
본 발명은 또한 자체의 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 것을 특징으로 하는, 미모사 푸디카 세포의 시험관 내 배양 추출물에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 미모사 푸디카 세포의 시험관 내 배양 추출물은 적어도 하나의 N-페닐프로페노일 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 의한 추출물은 또한 적어도 하나의 N-페닐프로페노일 아미노산이
P1: 1-O-(4-쿠마로일)-β-D-글루코스
C15H18O8
P2: N-p-쿠마로일아스파르트산 또는 아스파르트산; (S)-형, N-(4-하이드록시신나모일)
C13H13NO6
P3: N-cis-(p-쿠마로일)글루탐산 또는 글루탐산; (S)-형, N-(4-하이드록시-Z-신나모일)
C14H15NO6
P5: 4-하이드록시신나미드
C9H9NO2
P6: 글루탐산; (S)-형, N-신나모일
C14H14NO5
및 이것들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 추출물은, 추출물 중 적어도 하나의 N-페닐프로페노일 아미노산 총 함량이 건조 바이오매스 1 g당 1 μg 내지 50 μg, 더욱 우선적으로는 건조 바이오매스 1 g당 10 μg 내지 40 μg에 포함되는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 추출물은, 세포가 미분화 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 염증성 피부 장애의 치료에 사용되기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 추출물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 흉선기질림포포이에틴의 억제제로서 사용되기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 추출물에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 염증성 피부 장애는 아토피 피부염, 소양증 및 건선으로부터 선택된다.
흉선기질림포포이에틴 억제제로서 사용되기 위한 조성물로서, 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물도 또한 본 발명의 목적이다.
아토피 피부염, 소양증 및 건선으로부터 선택되는 염증성 피부 장애를 치료하기 위한 피부과 조성물로서, 본 발명에 따른 추출물 유효량만큼과, 피부과용 부형제 적어도 하나를 포함하는 조성물도 또한 본 발명의 목적이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 것으로서 본원에 기술된 바와 같은 추출물의, 피부 노화와, 피부 산화 스트레스, 예컨대 환경 오염으로 말미암은 산화 스트레스와 연관된 피부 장애의 미용적 처치를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 화장품용으로서 허용 가능한 부형제와 합하여진, 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 화장품 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 기술된 바와 같이 피부과용으로서 허용 가능한 부형제와 합하여진, 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 피부과 조성물에 관한 것이다.
마지막으로 본 발명은 또한 본 발명에 따른 조성물의, 피부 노화, 그리고 피부 산화 스트레스, 예컨대 환경 오염으로 말미암은 산화 스트레스와 연관된 피부 장애의 미용적 처치를 위한 용도에 관한 것이기도 하다.
정의
"탈분화"란 표현은, 세포가 분열 상태, 즉 미분화된 세포인 상태, 즉 자체의 형태학적 특징을 상실하고, 원래 있던 조직의 일부를 이루었던 세포와 물리적으로 상이하게 된 세포의 상태로 되돌아간 것을 지칭한다.
본 발명의 일 구현예에서, 추출물의 미모신 함량은 건조 중량 1 g당 5 ng 미만, 더욱 구체적으로 건조 중량 1 g당 4 ng 미만, 더욱더 구체적으로 건조 중량 1 g당 3 ng 미만, 더욱더 구체적으로 건조 중량 1 g당 2 ng 미만, 또는 더욱더 구체적으로 건조 중량 1 g당 1 ng 미만이다.
그러므로 본 발명에 따른 미모사 푸디카 세포의 미분화 상태로의 배양은 사실상 미모신을 포함하지 않는 추출물의 수득을 가능하게 한다는 점은 특히 주목할만하고 놀라운 점이고, 이와 같은 화합물은 독성을 가지므로 이 점은 본 발명에 있어서 중요한 장점이다.
본 발명의 내용 중 "추출물"이란 용어는, 일단 액체 배양 배지 중에 함침된 미분화 미모사 푸디카 세포를 주성분으로 하는 배양액의 번식이 중단된 경우에는, 동일하게 배양 배지를 지칭하기도 한다. 이와 같은 추출물의 1 리터당 건조 중량은 100 g 내지 500 g, 구체적으로 1 리터당 건조 중량 150 g 내지 350 g이다. 재료는 주로 미분화된 세포의 바이오매스로 이루어져 있다.
본 발명에 따른 추출물은 또한 상기 배양 배지의 고체 분획, 즉 배양 배지로부터 분리된 미분화 미모사 푸디카 세포로 이루어진 바이오매스에 관한 것이기도 하다.
본 발명에 따른 추출물은 또한 상기 배양 배지, 즉 미분화 미모사 푸디카 세포가 제거된 배양 배지의 액체 분획에 관한 것이기도 하다.
이와 같은 고체 분획 및 액체 분획은 당 업자에게 널리 공지된 액체/고체 분리 기술, 예컨대 원심분리, 침강, 여과로부터 선택될 수 있는 기술에 의해 용이하게 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 추출물은 또한 파쇄된 미분화 미모사 푸디카 세포로 이루어질 수도 있다. 이와 같이 파쇄된 재료는, 번식을 중단시킨 다음 배양 배지를 파쇄함으로써 직접 수득될 수 있다. 그러므로 이처럼 파쇄된 재료는 세포 막과 세포 벽 파편, 세포내 함유물 뿐만 아니라, 배양 배지 및 이에 포함되어 있는 화합물 및 분자를 함유한다.
특정 구현예에 따른 추출물을 구성하는, 이 같은 파쇄된 재료는 전술된 바와 같이 수득된 미분화 미모사 푸디카 세포뿐만 아니라, 이에 결합되어 있는 화합물 및 분자로 이루어진 배양 배지의 고체 분획을 파쇄함으로써 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 추출물은 또한 상기 정의된 바와 같은 파쇄된 재료의 고체 분획으로 이루어질 수도 있다. 이러한 추출물은 세포벽 및 세포막 단편뿐만 아니라, 이에 결합되어 있는 임의의 화합물과 분자를 포함한다.
마지막으로 본 발명에 따른 추출물은, 미분화 미모사 푸디카 세포를 함유하는 배양 배지의 고체 분획을 파쇄하여 재현탁한 후 얻어진, 파쇄된 재료의 액체 분획에 의해 제시될 수 있다.
파쇄는, 예를 들어 Utra-Turrax형의 믹서를 사용하는, 당 업자에게 공지된 임의의 방법에 의하거나, 또는 유리 비드와 함께 (선택적으로는 초음파의 도움을 받아) 진탕을 진행함으로써 수행될 수 있다.
그러므로 본 발명에 따른 추출물은 몇 가지 형태를 취할 수 있음이 밝혀졌다.
바람직하게 본 발명에 따른 추출물은 미분화 미모사 푸디카 전 세포(whole cell) 또는 미분화 미모사 푸디카 파쇄 세포를 함유한다. 이 추출물은, 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만, 우선적으로는 4 ng 미만, 우선적으로는 3 ng 미만, 더욱 구체적으로는 2 ng 미만, 더욱더 구체적으로는 1 ng 미만인 것에 의해 특징지어진다.
고체 분획(전 세포 또는 세포 단편)이 제거된 액체 분획으로 이루어진, 본 발명에 따른 추출물에 관한 내용 중 미모신 양은 추출물 1 ml당 5 ng 미만, 우선적으로는 4 ng 미만, 우선적으로는 3 ng 미만, 더욱 구체적으로는 2 ng 미만, 더욱더 구체적으로는 1 ng 미만이다.
더욱 일반적으로, 세포의 1차 또는 2차 대사로부터 직접 유래한 활성 유기 화합물을 수득하기 위해서는 현탁된 식물 조직의 시험관 내 배양이 사용될 수 있다.
현탁된 식물 세포는 미분화 상태에서 동물 세포 배양시의 줄기세포 전능성과 유사하게 그 전능성이 유지된다. 그러므로 이러한 식물 세포는 이론상 전 식물체(whole plant)에서 관찰되는 대사물질 모두를 생산할 수 있다. 탈분화는 유전적 또는 후성적 성질을 보이는 생합성 경로의 붕괴를 초래하므로, 전 식물체와 이로부터 생산된 세포주 사이 화학적 프로필은 양적으로나 질적으로 차이가 나게 된다. 따라서 이론상 전 식물체에서 관찰되지 않는 반응 중간체들이 세포 현탁액에서 보일 수 있으며, 그 반대일 수도 있다. 이 점은, 새로운 자원을 제공하고, 식물성화학물질의 잠재적 생물다양성에의 접근을 허용한다.
본 발명의 목적들 중 하나는, 미분화 미모사 푸디카 세포의 시험관 내 배양액으로부터 얻어진 제제에 관한 것이다.
"미분화" 식물 세포 또는 "탈분화" 식물 세포란, 구체적으로 특화된 특징 그 어떤 것도 가지지 않는, 즉 자연 상태의 식물 분열 조직에 가까운 생리적 상태에 있는 임의의 식물 세포를 의미한다. 이러한 세포는 다른 세포에 의존하지 않고 스스로 자생할 수 있다.
미모사 푸디카 세포의 초기 탈분화는, 식물 또는 어린 순, 예를 들어 잎, 잎자루, 줄기, 뿌리, 종자, 꽃 또는 식물의 기관이나 싹, 더욱 구체적으로는 종자 또는 잎으로부터 취하여진 생 식물 재료를 바탕으로 이루어진다.
탈분화된 세포를 배양하기 위한 방법은, 당 업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 문헌[Murashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-496 / Plant Culture Media, Vol-1 Formulations and Uses E. F. George, D. J. M. Puttock 및 H. J. George (1987) Exegetics Ltd. Edington, Westbury, Wilts, BA134QG England]에 언급된 방법에 의해 시험관 내에서 이루어진다.
본 발명에 따른 추출물은 하기 연속 단계들, 즉
a) 세포를 탈분화시키는 단계,
b) 세포를 미분화된 생리적 상태로 유지시키면서, 배양 배지로 세포 현탁액을 제조하는 단계,
c) 배양 배지로 번식 배양을 실시하여 바이오매스를 제조하는 단계,
d) 특정 구현예에서, 관심 대사물질을 가지는 배양액 중의 세포내 구획을 생물전환에 의해 농후화하는 단계,
f) 추출물을 수득하는 단계
를 수행함으로써 수득될 수 있다.
제조는, 만일 그 목적이 소량의 바이오매스를 제조하고자 하는 것이라면 Erlenmeyer 플라스크에서 수행될 수 있으며, 그 목적이 다량의 바이오매스를 제조하고자 하는 것이라면 생물반응기 내에서 수행될 수 있다. 예를 들어 Erlenmeyer 플라스크에서 세포 현탁액 500 ml로써 수득되는 건조 바이오매스의 평균 양은 175 g(또는 세포 현탁액 1 L 당 바이오매스 350 g)인 반면에, 10 L들이 생물반응기에서 획득되는 건조 바이오매스의 평균 양은 3000 g(또는 바이오매스 1 L당 300 g)이다.
조직 성장 및 2차 대사물질 생성을 개선하기 위해서는, 배양된 종과 이의 배양 스트레스에 대한 감수성에 따라 상이한 유형의 생물반응기가 사용될 수 있다. 생물반응기에서 식물 세포를 배양하기 위한 주요 방식으로서는 하기와 같이 3가지가 있을 수 있다:
1. 불연속 또는 회분식 배양,
2. 재충전(recharge)/획득(harvest) 또는 유가식 배양, 및
3. 연속 배양.
식물 재료 멸균 단계
미모사 푸디카 외식편, 더욱 구체적으로는 종자가 수집된 후에는, 70% 에탄올 용액 → 차아염소산나트륨 또는 차아염소산칼슘 용액 또는 염화수은 용액으로 실온에서 수 분 동안 종자를 대상으로 오염물질제거가 진행된다. 오염물질제거의 막바지에 조직은 멸균 증류수로 헹구어지고 나서, 멸균 증류수로 적어도 1회 세척된다.
세포 탈분화 단계
만일 종자가 사용된다면, 종자를 대상으로 오염물질제거가 수행된 후, 수크로스와 성장 인자들이 보충된 Murashige & Skoog 영양 아가 배지로 발아가 진행된다. 발아는, 세포 분열을 자극하고, 탈분화된 세포 클러스터 또는 캘러스를 제조하기 위해(캘러스형성(callogenesis)을 도모하기 위해), 외식편의 세포내 기작을 조정할 것이다. 수득된 캘러스는 3주 ~ 4주마다 새 탈분화 영양 배지로 운반될 것이다. 실제로 이 아가 배지의 임의의 성분들은 캘러스에 의해 대사될 수 있거나, 또는 공기의 작용에 의해 분해될 수 있다.
당 업자는 또한, 예를 들어 미분화된 세포를 수득하기 위해, 탈분화된 조직, 예컨대 잎으로부터 유래한 외식편을 사용할 수 있다.
일반적으로, 액체 배지로의 운반을 유리하게 해 줄 무른 캘러스(friable calluse)의 형태로의 신속한 탈분화와 일사불란한 세포 증식을 달성하기 위하여(캘러스형성을 달성하기 위하여), 성장 인자, 예컨대 옥신(피클로람 또는 4-아미노-3,5,6-트리클로로-2-피리딘카르복실산) 및 시토키닌(키네틴)을 기반으로 한 호르몬 조성물이 성공적으로 시험되었다. 멸균된 종자는, 30 g/L 수크로스 및 8 g/L 아가로 이루어진 배지로서, 1.5 mg/L 키네틴 및 2 mg/L 4-아미노-3,5,6-트리클로로-2-피리딘카르복실산(피클로람)이 보충되었고, pH 6으로 조정된 후, 121℃(1 bar)에서 20분 동안 고압살균된 아가 배지와 접촉된다. 종자를 담고있는 Petri 접시는 28℃의 어두운 환경에서 항온처리된다. 처음의 캘러스는 수 일, 구체적으로는 2주 후에 보이기 시작한다. 형성된 캘러스는 대략 3주 ~ 4주마다 새 배지로 운반되되, 단 이때 캘러스는 그 크기를 약 2 cm 내지 3 cm로 유지시키기 위해 메스로 나누어진다. 이 같은 운반은 약 수 주 동안, 심지어 수 개월(예컨대 6개월 내지 8개월) 동안 계속되며, 그 결과 무른 캘러스가 수득된다.
배양 배지 중 세포 현탁액을 제조하는 단계
아가 배지 상에서 이루어지는 캘러스의 연속 운반에 의한 세포 탈분화는 무른 캘러스의 형성을 초래한다. 이로 말미암은 세포간 유착 감소는, 식물에 따라 2개월 내지 6개월 사이에 일어날 수 있는 탈분화의 결과이다. 이처럼 세포간 유착이 감소한 상태는, 기계적 스트레스 유도를 최소화하면서 세포 현탁액 중에서 캘러스가 붕괴되도록 보장하므로, 액체 배지로의 운반에 유리하다. 그러므로 무른 캘러스 무리(10 용적% 내지 20 용적%)는 탈분화 아가 배지와 동일한 조성을 가지되 겔화제는 사용하지 않고 제조된 액체 영양 배지에 도입된다.
그러므로 무른 캘러스는 수 일 동안 행하여지는 진탕 테이블의 작동에 의해 액체 배지 중에서 붕괴되고, 이로부터 생성된 세포 현탁액으로부터는 붕괴되지 않은 캘러스 부분이 제거됨에 따라, 균질한 세포 현탁액이 제조된다. 이 현탁액은, 충분히 조밀한 세포 집단을 수득하기 위해 배양된다. 이 단계에서, 현탁액은 새 영양 배지 중에서 (계대배양되거나) 희석된 다음, 동일한 방법으로 배양된다.
초기 세포 현탁액은, 무른 캘러스 약 20 g 내지 약 40 g을, 배지 200 ml가 담긴 500 ml들이 Erlenmeyer 플라스크 중에 넣어 제조될 수 있다. 이 무른 캘러스는 29℃의 어두운 환경에서 2일 내지 3일 동안 행하여지는 진탕 테이블(115 rpm)의 작동에 의해 액체 배지 중에서 붕괴된다. 그 다음, 세포 현탁액이 피펫으로 수집되는데, 이때 붕괴되지 않은 잔여 캘러스 클러스터는 남는다. 이에 따라 세포 현탁액은 세포 마이크로클러스터(micro-cluster)의 균질 현탁액을 형성하게 된다. 이 현탁액은 "충분히" 조밀한 세포 집단을 수득하기 위해 배양된다. 이로부터 얻어진 세포 현탁액은 14일 동안 배양되고, 이후 동일 기간 동안 새 배지로 5배 희석되어 번식된다. 배양 배지의 조성(영양소, 성장 인자 등)은 바이오매스의 생산성이 최대화되도록 조정되었다. 그 결과, 액체 세포 현탁에 최적화된 SENSMS 바이오매스 번식 배지가 제조되었다(표 1 참조). 이 배지는 캘러스형성을 위한, Murashige & Skoog 배지의 변형된 형태의 것이다. 이 배지에 KOH가 첨가됨에 따라 pH는 6으로 조정되고, 이후 121℃에서 20분 동안 고압살균(p = 1 bar)하거나 0.2 μm 멸균 여과가 수행된다.
배양 배지로 이루어지는 번식 배양 및 바이오매스 제조
이 같은 계대배양이 수 회 이루어진 후, 해당 기간에 걸쳐 도달한 세포 밀도가 일정해질 때 세포 현탁액은 안정화된다. 그 다음, 바이오매스의 생산성을 최대화하기 위하여 배양 배지의 조성(영양소, 성장 인자 등)이 조정된다. 이처럼 최적화된 배지는 활성 주성분들을 추출하기 위한 바이오매스 제조 수단으로서 사용된다.
이와 같이 확립된 "최적" 조건 하에서 세포 배양액은 안정화되고, 14일마다 세포 현탁액을 5배 희석함으로써 Erlenmeyer 플라스크(번식 배지) 내에서 유지된다. 이 세포 배양액은 14일 동안 배양된 후, 세포 현탁액 약 350 g/L를 이루게 될 새 바이오매스 약 60 g/L이 접종된 세포 배양액, 또는 생물반응기에 필요에 따라 접종된 세포 배양액에 상당한다.
새 바이오매스는 현탁액 1 리터당 100 g 내지 500 g, 더욱 바람작하게 현탁액 1 리터당 200 g 내지 350 g에 해당한다.
선택적 단계: 배양액 중
세포내
구획 내 관심 대사물질의 생물전환에 의한 농후화
그 구조가 최종 산물의 구조와 충분히 유사한 "전구체"를, 세포 내에 존재하는 효소 기구를 이용하여 혼입, 변형 또는 전환시키고자 하는 바램으로, 종종 이러한 전구체를 세포에 제공하는 것은 필수이다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 단계 c) 및/또는 단계 d)의 배양 배지가 페닐-암모니아-리아제 기질을 함유하는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 페닐-암모니아-리아제 기질이 페닐알라닌, 구체적으로 L-페닐알라닌, 신남산, 아스파르트산, 글루탐산 및 이것들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은, 수득된 추출물이 적어도 하나의 N-페닐프로페노일 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 한다.
세포에 의하여 전구체가 변형되는 이 같은 과정은 "생물전환"이라 칭하여진다. 배양 배지에 전구체를 첨가하는 것은, 관심 2차 대사물질의 생산을 증가시키기 위한 흥미로운 접근법일 수 있다. 이 개념은, 관심 대사물질의 생합성 경로에 있어서 반응 중간체인 임의의 화합물이 최종 생성물의 수율을 아마도 증가시킬 수 있을 것이라는 원리에 바탕을 두고 있다. 그러므로 NPA의 구조(이하 화학식 참조)를 바탕으로 하였을 때, 임의의 분자(아미노산)가 이러한 반응 중간체의 전구체인 것으로 보인다. 예를 들어 아미노산 L-페닐알라닌은 페닐-암모니아-리아제(PAL) 효소의 활성을 상승 조정하기 유용한 전구체이다. 이와 유사하게, 신남산은 동일한 현상의 출발점에 있을 수 있다. 특히 아스파르트산 또는 글루탐산과의 다수의 조합도 또한 고려될 수 있다. 본 발명자들은 이와 같은 다양한 전구체를 (단독으로 또는 조합하여) 사용하여 다수의 실험을 실시하였는데, 놀랍게도 본 발명자들은 L-페닐알라닌으로 미모사 푸디카 세포에서 전에 없던 유용한 NPA, 예컨대
P1: 1-O-(4-쿠마로일)-β-D-글루코스
C15H18O8
P2: N-p-쿠마로일아스파르트산 또는 아스파르트산; (S)-형, N-(4-하이드록시신나모일)
C13H13NO6
P3: N-cis-(p-쿠마로일)글루탐산 또는 글루탐산; (S)-형, N-(4-하이드록시-Z-신나모일)
C14H15NO6
P5: 4-하이드록시신나미드
C9H9NO2
P6: 글루탐산; (S)-형, N-신나모일
C14H14NO5
및 이것들의 혼합물을 수득하였다.
추출물 수득
번식이 중단된 후, 생성된 세포 현탁액은 여과 또는 원심분리되어 배양 배지로부터 분리될 수 있으며, 그 결과 세포외 배지(또는 배양 상청액)와 획득된 바이오매스 둘 다가 수득된다. 그 다음, 바이오매스는 용도에 따라 상이한 방식으로 처리될 수 있다. 바이오매스는 동결건조에 의해 건조되거나, 예를 들어 0.8% 캐러기난 및 1% 시트르산과 68.2% 글리세린 중에 30%로 재현탁된다. 용매 추출은 또한 세포 현탁액을 대상으로 처음에, 예를 들어 초음파처리나 프렌치 프레스(French press)에 의해 세포 분산을 수행함으로써 수행될 수 있다.
제제
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 미모사 푸디카 세포의 시험관 내 배양 추출물과, 화장품용 및/또는 피부과용으로 허용 가능한 부형제, 바람직하게는 국소 적용을 위한 부형제 하나 이상을 포함하는, 화장품 조성물 또는 피부과 조성물에 관한 것이다.
본 화장품용 및/또는 피부과용으로 허용 가능한 부형제는 당 업자들에게 공지된 것들 중 임의의 부형제일 수 있다. 특히 본 발명에 따른 조성물은, 특히 크림, 로션, 겔, 연고, 에멀전, 마이크로에멀전, 스프레이 등의 형태를 가지는 국소 조성물일 것이다.
본 발명에 따른 화장품 조성물 또는 피부과 조성물은, 구체적으로 첨가제 및 제형 보조제, 예컨대 유화제, 증점제, 겔화제, 수성 정착제, 도포제, 안정화제, 염료, 향수 및 보존제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 또 다른 목적은 본 발명에 따른 추출물의, 염증성 피부 장애 치료, 예컨대 환경 오염으로 말미암은 산화 스트레스 치료에 있어서 항산화제로서의 용도와, 노화 방지제로서의 용도이다.
"염증성 피부 장애"란, 아토피 피부염, 소양증, 소양증으로 말미암은 가려움증(TSLP 억제), 습진 및 건선을 의미한다.
바람직하게 상기 피부과 염증성 장애는 아토피 피부염, 소양증, 습진 또는 건선으로 이루어진다. 다른 구현예에 따르면, 본 특허출원에 의해 간주되는 발명은 활성 주성분으로서 적어도 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
따라서 본 발명은, 바람직하게 화장품 조성물 또는 피부과 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 피부과 염증성 장애를 치료하기 위한 것이다.
바람직하게 상기 피부과 염증성 장애는 아토피 피부염, 소양증, 소양증으로 말미암은 가려움증, 습진 또는 건선으로 이루어진다.
본 발명에 따른 조성물은, 유중수(W/O) 에멀전 또는 수중유(O/W) 에멀전, 다중 에멀전, 예컨대 수중유중수(W/O/W) 에멀전 또는 유중수중유(O/W/O) 에멀전, 마이크로에멀전의 형태, 또는 이외에 수분산액(hydrodispersion) 또는 지분산액(lipodispersion), 겔 또는 에어로졸의 형태로 제조될 수 있다. 피부과용으로서 또는 화장품용으로서 양립 가능한 부형제는 당 업자에게 공지되어 있는 것들 중 임의의 부형제로서, 국소 적용을 위한 유액, 크림, 밤, 오일, 로션, 겔, 포밍겔, 연고, 스프레이 등의 형태의 조성물을 수득하기 위한 것일 수 있다.
피부과 조성물 및 화장품 조성물 이외에, 본 발명은 또한 의료용 제품으로 사용하기 위한 약학 조성물에 관한 것이기도 하다.
그러므로 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 설명에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체란, 부작용을 일으키지 않고, 예를 들어 활성 화합물(들)의 투여를 돕거나, 유통기한을 늘려주며/늘려주거나, 체내 효율을 높이거나, 용액 중 용해도를 증가시키거나, 보관을 개선하는, 약학 조성물에 함유된 화합물 또는 화합물들의 조합으로서 정의된다. 이러한 약학적으로 허용 가능한 담체는 널리 공지되어 있으며, 투여 방식과 성질에 따라서 당 업자에 의해 취사선택될 것이다.
실시예: WAVE 생물반응기(5 L) 내 식물 세포 배양
재료 및 방법: MS SENS 배지(이 배지의 조성에 관하여는 상기 표 1 참조) 4 L가 담긴 유용 용적(useful volume) 5 L의 WAVE 반응기(Sartorius)에 엠. 푸디카 세포 배양 현탁액(세포 밀도: 생 중량(FW) 1 L당 300 g 내지 400 g)을 접종하였다.
매개 변수:
- 온도: 27℃
- 공기량: 0.5 L/분(lpm)
- 압력: 5 mPa 내지 10 mPa
- 요동 각도(rocking angle): 7°
- D0 내지 D9에 걸쳐 rpm을 증가(D0, 19 rpm → D9, 27 rpm)시킴으로써 75%로 유지되는 pO2
- 25 rpm에서 D9 내지 D15에 걸쳐 공기중 O2를 농후화함으로써(D9, 5% O2 → D15, 20% O2) 75%로 유지되는 pO2
생물전환 배지가 첨가되었던 배양 13일차(D13)가 될 때까지, 당 소모량과 상관된 바이오매스의 증가(다만 이는 생 중량(FW) 또는 건조 중량(DW)에 의해 평가됨)(곡선의 하강 부분)가 성장 동력학에 따라서 관찰되었다.
생물전환 및 획득
4 L 배양액을 회분 배양한 지 13일(D13) 후, 세포 농도는 300 g/L(FW) 내지 350 g/L(FW)이었는데, 이는 12 g/L(DW) 내지 14 g/L(DW)에 상당하는 농도이다. 이 세포 농도에 도달하였을 대, 멸균 여과에 의해 전구체를 주입하여 생물전환을 수행하였는데; 본 발명자들은 다양한 아미노산(아스파르트산, 신남산, 글루탐산 또는 L-페닐알라닌)을 선택하였고, 이 아미노산들 중 L-페닐알라닌이 NPA 생물전환 수율의 관점에서 본 발명의 배양 조건하에 최선의 결과를 달성하였다. 이하는 전구체와 이 전구체의 농도의 예들이다.
하이드록시신남산
(이의 유도체, N-
페닐프로페노일
아미노산(
NPA
) 포함)에 유리한 생물전환 배지
화합물을 H2O에 희석하고, 혼합물을 멸균 여과를 거쳐 생물반응기에 첨가하였다. 48시간 후, 즉 D15와 D16 사이에, 예를 들어 "20 μm 나일론 백"을 사용하는 직접 여과에 의해 바이오매스를 획득하였다. 바이오매스를, 획득된 바이오매스 용적에 상당하는 용적의 멸균 탈염수로 1회 세척하였다. D13에 평가한 세포 농도는 D15에서의 세포 농도와 상당(+/- 10%)하여야 하였다. 배양을 통틀어서 초래된 현탁액 용적 감소는 주로 취하여진 시료들로 말미암은 현상이었다.
특정 용적의 배양액을 D13, D14, D15 및 D16에 취한 후, 용매로 추출한 다음, 다양한 추출물을 용해하고 나서, 질량 분광분석법과 병행되는 HPLC에 의해 분석하였다. 본 출원의 도면들은, D13(전구체 L-페닐알라닌을 첨가한 날)을 기준으로 새로운 피크들이 D14 및 D15에 점진적으로 출현하였고, D16에 최고 세기에 도달하였음을 보여주고 있다.
피크 P1, P2, P3, P4, P5 및 P6는 D16에 분리되었는데, 이 피크를 보이는 분획을 대상으로 질량분광분석 및 NMR을 수행함으로써 분자들의 구조를 확인하였다. 피크 P4의 분획물은 극소량이어서 구조를 확인할 수 없었다. 본 발명자들은 처음으로, 그리고 놀랍게도 전구체 L-페닐알라닌이 생물전환에 가장 좋은 아미노산이었음을 확인하였다.
P1, P2, P3, P5 및 P6를 보이는 NPA 생성물들을 질량분광분석법 및 NMR에 의해 동정하였다.
NPA 명칭 목록:
P1: 1-O-(4-쿠마로일)-β-D-글루코스
C15H18O8
P2: N-p-쿠마로일아스파르트산 또는 아스파르트산; (S)-형, N-(4-하이드록시신나모일)
C13H13NO6
P3: N-cis-(p-쿠마로일)글루탐산 또는 글루탐산; (S)-형, N-(4-하이드록시-Z-신나모일)
C14H15NO6
P5: 4-하이드록시신나미드
C9H9NO2
P6: 글루탐산; (S)-형, N-신나모일
C14H14NO5
실시예
2: 미모사
푸디카
식물 세포에 존재하는
미모신
대 잎에 존재하는 미모신의 검정
본 실시예의 목적은, 추출물 중 미모신을 동정 및 정량하기 위한 분석 조건을 개발하는 것이다. (생물전환이 일어난) 엠.푸디카 세포의 현탁 배양액으로부터 유래하는 바이오매스를 ETOH80 또는 ETOH60으로 추출하였다. 엠.푸디카의 건조 잎을 말린 다음, 파쇄하고, 동일한 용매로 추출하였다. Sigma사의 L-미모신을 동정 및 정량의 기준으로 사용하였다. 시료를 HPLC/질량분광분석법으로 분석하였다.
재료 및 방법: 분석 조건
ABSciex TripleTOF 4600 질량분광분석계
방법(ES+): TOF(100ms) / MRM(50ms)
컬럼: Acquity HSS C18, 1.8 μm, 2.1x100 mm, 0.5 μm 소결
용리액: A(H2O-0.1%HCO2H) / B(CH3CN-0.1%HCO2H)
유속: 500 μl/분
주입량: 10 μl
구배:
정량 검정은, 대조군 용액에서 도달한 정량 하한치(LLOQ)가 5 ng/mL임을 확립하였다. 본 발명의 하이드로에탄올 시료의 제조 방법과 이의 LLOQ는, 본 발명의 세포 배양 시료 중 미모신이 검출 한계치(바이오매스 1g당 미모신 1 ng)만큼 존재, 즉 부재한다고 볼 수 있음을 확인시켜주었다.
- 세포의 EtOH80 및 EtOH60 추출물(20% w/w) < 새로 공급한 세포 1 ng/g
- 동결 건조 세포의 EtOH60 추출물(5% w/w) < 동결건조 세포 1 ng/g
- 식물의 EtOH60 추출물 = 건조 식물 1 g당 2160 ng
- 식물의 EtOH80 추출물 = 건조 식물 1 g당 780 ng
본 분석들을, 생물전환이 일어나지 않는 PCC를 대상으로 동일한 방법으로 수행하였는데(즉 NPA 전구체를 첨가하지 않고 수행하였는데), 그 결과 미모신 함량이 또한 새로운 세포 또는 동결 건조된 세포 1 g당 1 ng 미만이었음이 확인되었다.
결과적으로, 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 엠.푸디카 식물 세포 배양액에 있어서 미모신과 같은 원치않는 성분 그 어떠한 것도 검출하지 못하였다.
실시예 2 - 소염 활성: 식물 추출물 대 PCC 추출물의 비교
본 실시예에서, 본 발명자들은 2" 미모사 푸디카 추출물들(E11 및 E13)의 소염 활성을 비교하였다. 추출물 E11은 건조 및 파쇄한 미모사 푸디카 잎을 아세트산에틸로 추출하여 얻어진 것이고, 추출물 E13은 Erlenmeyer 플라스크 내에 담긴, 생물전환이 일어나지 않은 미모사 푸디카 식물 세포 배양액으로부터 유래한 파쇄 재료를 동일한 용매로 추출하여 얻어진 것이다. 용매를 증발시켜 건조한 후 추출물 2개의 중량을 측정하였다. 이 추출물 2개를 DMSO 중에 취하였다. 동일 농도의 두 추출물의 소염 활성을 평가 및 비교하기 위해, 본 발명자들은 문헌(Kang et al. 2002. J Pharmacol Exp Ther. 302:138-144)에 따라, 표면에 TLR4 수용체를 발현하는 마우스 대식세포, 즉 RAW264.7 세포를 세균 LPS로 자극하는 단계로 이루어진 시험관 내 약리 시험을 실시하였다. 매개변수 몇 개를 연구하고, 이를 기준 소염제인 덱사메타손과 비교하였다:
- Griess 기술에 의한 아질산염 제조. 아질산염 수준은, 유도성 아질산염 산화물 합성효소(iNOS)에 의해 유도되는 NO 합성의 수준을 반영함.
- 시토카인 분비: 인터루킨-6(ELISA에 의해 확인)
- TNF-알파 생성(다중 검정에 의해 확인)
세포 배양
RAW264.7 세포는 마우스 대식세포 계통의 것이었다. 이 세포는 접착성을 가지는 것으로서, 이 세포를 12웰 평판에서, 10% FCS, 2mM L. 글루타민 및 50 μg/mL 젠타마이신이 보충된 DMEM 배지 중 100000개 세포/cm²(Millipore Scepter 계수)가 되도록 배양하였다.
합류도 약 70%가 되었을 때, 세포를 동일 농도(건조 중량)의 미모사 푸디카 추출물 E11(식물) 또는 E13(PCC)으로 처리하였거나, 또는 기준 소염제 덱사메타손(Biovison 1042-1) 1 μM로 1시간 동안 처리하였으며, 이후 0.2 μg/mL [이.콜라이(E. coli) 055:B5] LPS로 활성화하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2 하에서 항온처리하였다. 24시간 후 세포 상청액을 회수하여 얼음에 담가두고, 4℃ 및 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 다음, 분취하여 -80℃에 보관하여 두었다. 세포 시험을 3회 반복하였는데, 이때 3회 중 2회는 동일 시험의 반복이었다. 결과들의 평균 값을 그래프로 제시하였다.
MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브롬화물)로 대사 시험(metabolic test)을 실시하여 세포 생존력을 모니터링하였다(SIGMA CGD1 키트(효소, 즉 미토콘드리아 숙신산염 탈수소효소의 활성을 기반으로 한 키트) 사용). 이 모델에서 시험될 추출물의 용량을 결정하기 위해 이 시험을 사전에 실시하였다.
아질산염 검정
새로이 마련하였거나 또는 (-80℃로) 동결시킨(다만, 동결은 검정에 영향을 미치지는 않음) 세포 상청액 중 검정에 영향을 미치지 않는 NO의 합성 수준을 평가하였다. 본 검정의 원리는, 540 nm에서 흡광도를 보이는 핑크색 아조 화합물을 생성하는 Griess 반응(디아조화)를 바탕으로 한다.
IL-6 검정
200배 희석한 세포 상청액 중 IL-6를, 공급자(R&D Systems, 키트 M6000B)의 프로토콜에 따라 비색 ELISA에 의해 검정하였다.
TNF-알파 검정
유세포분석 및 ELISA의 원리들을 기반으로 한, Luminex xMAP(다중 피분석물 프로파일링) 기술을 이용하여 세포 상청액 중 TNF-알파의 동시 검정을 96웰 미세평판에서 수행하였다. 기재로서 사용된 마이크로비드는, 컬러 코드(상이한 형광도)로써 이 마이크로비드를 식별시키는 형광단 2개와 정확한 비율로 통합되었다. 세포측정기(Bio-Plex 200)의 광학 시스템은 2개의 레이저로 이루여져 있는데, 이 레이저 중 하나는 레드 레이저(red laser)(λ = 635 nm)로서, 이는 각 마이크로비드 중에 한정되어 존재하는 염료 혼합물을 여기시킨다. 두 번째 레이저는 그린 레이저(green laser)(λ = 532 nm)로서, 이는 시토카인을 정량하기 위해 특정의 검출 항체에 부착된 리포터 형광단을 여기시킨다. 시스템은 데이터 획득 및 분석 소프트웨어(Bio-Plex Manager 4.1 버전)가 탑재된 컴퓨터에 의해 제어된다.
해동 후, 상청액을 배양 배지로 10배 및 40배 희석한 후, Milliplex 키트(Millipore, 품목 번호 MCYTOMAG-70K-04)를 사용하여 시험하였다. 이 키트는 시토카인을 검정하기 위한 기준, 검출용 항체 및 특정의 비드를 포함한다.
결론
농도를 평균내어 나타냈다. 억제 %는 (추출물에 대해 언급할 때) 0.2% DMSO 대조군에 상대적이다. 건조 시료를, DMSO를 사용하여 사전에 용해한 다음, 수성 완충제 중에 희석하여, 세포 시험을 실시하였다.
도면 범례:
도 1: 아질산염 검정
도 2: IL6 검정
도 3: TNF-알파 검정
다양한 시료를 X축에 나열하였다(좌→우).
- O: 음성 대조군 - 0.2 μg/mL LPS로 활성화된 RAW246.7 세포 배양액.
- DEXA: 양성 대조군 - 1 μM 덱사메타손(Biovison 1042-1)과 함께 1 시간 동안 세포를 항온처리한 다음, 0.2 μg/mL LPS로 활성화.
- DMSO: 1 시간 동안 (E11 및 E12를) 용해하기 위해 사용된 용매 대조군과 함께 항온처리한 후, 0.2 μg/mL LPS로 활성화.
- E11: 엠.푸디카 잎으로부터 얻어진 추출물(50 μg/mL)과 1 시간 동안 항온처리한 다음, 0.2 μg/mL LPS에 의해 활성화.
- E13: 식물 세포로부터 얻어진 추출물(50 μg/mL)과 1 시간 동안, 이후 0.2 μg/mL LPS에 의해 활성화.
아질산염 검정
NO 생성은 오로지 유도성으로서, 덱사메타손에 의해 유의미하게 억제될 수 있었다(i% = 35). 0.2% DMSO는 본 검정에 어떠한 영향도 미치지 못하였다. 식물 추출물 E11은 아질산염 생성을 약하게 억제하였던 한편(i% = 16%), 추출물 E13은 기준 소염제와 동등한 방식으로 기준 소염제로 달성되는 억제율에 매우 가깝게 아질산염 생성을 억제하였다(i% = 32%).
IL-6 ELISA
LPS로 활성화된 세포(O)는 IL-6를 분비하였다. 덱사메타손(DEXA)은 IL-6 분비를 억제하였다(i% = 38%). 추출물 E11은 IL-6 분비를 i% 24%로 억제하였고, 추출물 E13은 IL-6 분비를 i% 31%로 억제하였다.
TNF-알파의 LUMINEX 검정
RAW264.7 세포는 TNF-알파를 기저 수준(평균 0.23 ng/mL)으로 분비하였다. 이와 같은 생성은 0.2 μg/mL LPS에 의해 TNF-알파를 10 ng/ml 이하로 활성화하였다. 이러한 활성화는 덱사메타손에 의해 약하게 억제될 수 있었다(i% = 16%). PCC 추출물 E13은 TNF-알파 생성을 감소시켰다(i% = 40%). 이와는 반대로 식물 추출물 E11은 TNF-알파 생성을 증가시켰는데, 이 E11은 LPS의 활성을 증가(+112%)시키는 것으로 보였다.
결과적으로, 본 모델에 있어서 아질산염 NO의 억제, 전염증성 시토카인인 IL-6의 억제를 통해 반영되는, 본 검정의 결과들은 동일 농도의 추출물 2개, 즉 E11 및 E13가 대조군인 DEXA와 유사하게 염증을 강력히 억제함을 보여준다. 놀랍게도 이러한 실험 조건 하에서 PCC 추출물인 E13은 DEXA보다 TNF-알파를 더 강하게 억제하는 한편, 식물 추출물 E11은 그 억제능을 향상시켰다.
실시예 3: 항산화 활성 - ORAC 시험
산소 라디칼 흡광능(Oxygen Radical Absorbance Capacity; ORAC) 시험을 이용하여 항산화 활성을 평가하였다(Dιvalos A. et al.; Polish journal of food and nutrition sciences; 2003;12 /53:133-136). ORAC 값은 추출물의 항산화능을 평가하는데 사용된다. AAPH(2,2'-아조비스-2-메틸-프로판이미다미드, 이염화수소염)은 퍼옥실 유리 라디칼의 공급원이다. ORAC 시험에서 AAPH는 유리 라디칼에 의한 플루오레세인 분해 역학을 모의하는데 사용된다. 이는, 시간에 따른 형광도의 감소와, 시험 대상이었던 추출물 또는 기준(여기서는 Trolox)의 농도 감소를 초래한다. Trolox(비타민 E의 유사체)는 강력한 항산화제로 알려져있다. Trolox(표준 용액) 또는 추출물의 첨가는, 플루오레세인이 분해되는 것을 막아준다. 이는, Trolox 표준 용액에 대해 측정되는 항산화 활성의 평가를 가능하게 한다.
- 생물전환이 일어난 미모사 푸디카 PCC의 추출물(NPA). 회분 WO2. 시료들을 D13(생물전환일), D14(오전 10시), D14(오후 4시), D15, D16 및 D17에 취하였다.
- 샘플링된 추출물들을 물로 희석하였다.
ORAC 시험
사용된 용액들: 모든 용액은 인산염 완충제 75 Mm(pH 7.6) 중에 제조하였다. 1.17 μM 플루오레세인(117 mM 원액 사용, 4℃에 1주일 동안 보관). 125 mM AAPH(즉석 제조됨). 1 mM Trolox(-20℃에 보관).
Trolox 표준 용액의 제조:
반응 용적: 200 μl
하기 성분들을 검은색의 96웰 평판에 넣었다: 항산화제(Trolox 표준 용액 또는 시험될 추출물(파쇄된 세포 배양 배지)) 20 μl + 1.17 μM 플루오레세인 160 μl). 막으로 덮인 평판을 37℃에서 15분 동안 항온처리하였다. 웰당 125 mM AAPH를 20 μl 첨가하였다. 이러고 나서 바로 분광형광계(SpectraMax) 내 37℃에서 항온처리를 수행한 다음, 여기 파장 485 nm와 방사 파장 520 nm에서 1분마다 데이터 판독을 실시하였다(총 90분). 각각의 시험은 3회 반복 수행하였다. 각각의 시험(Trolox 표준 용액 또는 시료)에 대한 곡선하면적(AUC)을 추산하였다. 순 AUC(net AUC)를 '표준 용액점 또는 시료 AUC - 블랭크 AUC'로 산정하였다. 교정 곡선을 순 AUC의 함수인 Trolox 농도(μM) 플롯으로 작성하였다.
1차 방정식을 사용하여, 검정된 시료들 각각에 대한 Trolox 등가 치(Trolox Equivalent; TE)(μM)를 결정하였다.
Trolox 등가 치(μM) = a x (순 AUC) 2 + b x (순 AUC)
[식 중, a 및 b는 1차 방정식에 의해 결정됨]
ORAC 값은 추출물 100g당 Trolox(μmole)에 상응한다.
ORAC 값( TEAC ) = Trolox 등가 치(μM) x 20 x ([시험된 추출물]/100,000 x 20)
도 4는, 1 ml당 건조 중량이 75 mg인 추출물(200배 희석)의, 생물전환단계 전후의 항산화 활성을 보여주는 것이다.
결과: x축에 배양일(시간), 즉 D13, D14(오전 10시), D14(오후 4시)로부터 X일 후와, D15, D16, D17 후 각각 24시간 경과시 채취한 PCC 추출물 WO2와, 마지막 시료인 40% ETOH 블랭크 대조군 단독(항산화 활성 비발현)을 표시하였고, 이 플롯에는 활성이 제시되어 있다. D14, 즉 배양 13일차 이후로서 생물전환(AA 첨가)이 일어난지 1일 후, TEAC(TROLOX 등가 치(μM))는 5배로 증가하여, 이 상태로 D16 ~ D17까지 안정적으로 유지되었다. 결과적으로 생물전환은 NPA가 존재함으로 말미암아 항산화 활성을 증진할 수 있었다.
실시예 4: 약리학 - 활성: 유도성 아토피 피부염(AD)의 시험관 내 모델
아토피 피부염 표현형을 보이는 시험관 내 모델에 있어 미모사 푸디카의 소염 활성에 관한 다중매개변수 평가. 약리학적 모델에 관하여는 문헌[Castex-Rizzi et al. (Br J Dermatol. 2014. 170 Suppl 1:12-8]에 기술되어 있다.
4.1 추출물 및 화합물
파쇄, 건조 및 표준화된 미모사 푸디카 배양 배지 W01D15(생물전환 진행)로부터 수집한 PCC 추출물을, 40% EtOH 중 용액에 용해시키거나/이 용액으로 희석하였다(초기 농도 75 mg/ml). 화합물을 즉석으로 용해하여 생존능 시험을 실시하였을 뿐만 아니라, 적당한 용량으로는 유도성 아토피 피부염 모델에 대한 약리학적 작용을 평가하였다.
4.2 세포 유형
Lonza사의 정상적 인간 상피각질형성세포(Normal Human Epidermal Keratinocytes: NHEK). 이 세포를 표준 배양 조건 하에서 증식시켰다.
4.3 아토피 피부염 표현형의 유도
NHEK 세포를 접종하고 나서, 각질형성세포-SFM 배양 배지에서 배양하였다. 그 다음, 배양 배지를 시험될 화합물 및 추출물을 함유하는 배지, 또는 대조군으로 사용되는 용매(화합물 처리가 이루어지는 동안 적용된 농도에 상당하는 농도인 40%만큼의 EtOH)를 함유하는 배지로 교체하였다. 1시간 동안"예비 항온처리" 한 후, 염증 유도제 혼합물(Poly(I:C), IL-4, IL-13)을 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다.
유도제를 포함하지 않을 뿐 아니라 화합물도 포함하지 않는 대조군도 이와 마찬가지로 처리하여, 본 발명자들이 유도 모델(NHEK vs NHEK + 유도제)을 인증하는 것을 허용하였다.
또한 NHEK 세포를 기준 생성물, 즉 0.29 mM의 덱사메타손으로도 처리하여 효능 대조군으로 삼았다.
유도제 혼합물과의 항온처리(24시간) 후 RNA를 세포로부터 추출하였다.
4.5 RT-qPCR에 의한 차등 발현 분석
4.5.1. 총 RNA 추출 및 cDNA 합성
RNABle(Eurobio) 및 RNeasy 미니 키트(QIAGEN)를 사용하여 추출을 실시하였다. 추출된 총 RNA를 분광분석계(NanoDrop, ND1000, Thermo Scientific)로 검정하였으며, 또한 이 총 RNA의 품질을 아가로스 겔 상에서 분석하였다.
4.5.2. 정량적 PCR 기술
- 원리
실시간 PCR은, 도처에 발현되는 기준 유전자의 발현에 비한 표적 유전자의 발현의 비율에 관한 상대적 정량을 허용하는 정확하고, 민감하며, 신속한 방법이다. 이 기술은, 전령 RNA의 정량을 가능하게 해준다. 이 작업은, 증폭될 표적의 양쪽 중 어느 한 쪽에 존재하는 프라이머 2개를 DNA 중합효소를 사용하여 연장시킴으로써 RNA를 상보성 DNA로 역전사시킨 후 수행된다. 기하급수적인 증폭이 일어나는 잡종화 단계가 진행되는 동안 형광단(SYBR Green)이 통합됨으로 말미암아, 새로이 생성된 증폭 생성물의 양을 정량할 수 있을 뿐만 아니라 이 양을 실시간으로 모니터링할 수도 있다. PCR 생성물이 기하급수적으로 증가함으로 말미암아 신호가 증가하게 되면, 제조자의 지침에 따라 Biosystems PE 분석 프로그램을 사용하여 검출이 개시되고, 그 결과 역치 주기(Ct: 역치값에 도달하는 주기)의 회차수로부터 정량적 값들이 얻어진다. 즉 "0" 시간에서 표적 유전자의 cDNA 양이 많을수록 Ct 회차수(역치값에 도달하기 위한 주기의 회차 수)는 더 적다.
정량적 RT-PCR 분석을 표준화하기 위해, 동일한 실험에서 "기준 유전자"라 칭하여지는 내인성 대조군 적어도 하나는 정량되어야 한다. 이 "기준 유전자"는 세포의 처리 조건 또는 미처리 조건과는 독립적으로 구성적 발현을 보여야 한다. 선택된 표적 유전자의 상대적 발현은, RQ(상대적 정량; Relative Quantification) 소프트웨어(제조사 Applied Biosystems에 의해 제공)를 이용하여 ΔΔCt법에 의해 추산된다. 또한, 대조군 NHEK 세포(화합물 대신 담체로서 사용되는 화합물인 DMSO(소정 %)로 처리된 세포 및 미처리된 세포)의 유전자 발현 값을 1로 간주하여, 소정 화합물에 의해 유도된 각각의 유전자의 발현 값을 정규화하였다. 따라서 각각의 화합물로써 소정 유전자에 대해 구하여진 RQ값은, 대조군 세포(즉 발현 값이 1인 세포)의 유전자 발현에 대한, 이와 같은 처리후 유전자의 상대적 발현을 나타낸다.
- 프라이머의 선택
Oligo 4(National Biosciences, Plymouth, MN)를 비롯한 컴퓨터 프로그램의 도움을 받아 프라이머를 선택하였다. 선택 기준은, 증폭될 단편의 크기(80개 뉴클레오티드 내지 120개 뉴클레오티드), 프라이머의 크기(21개 뉴클레오티드 내지 25개 뉴클레오티드), 프라이머의 잡종화 온도(약 65℃) 및 프라이머의 위치를 고려하는데; 실제로 프라이머는, 2개의 프라이머 중 하나가 인트론과 엑손 두 개에 걸쳐지도록, 또는 만일 2개의 상이한 엑손 사이에 끼어있는 인트론이 2 kbp를 초과하면 프라이머 2개가 상이한 엑손 2개 각각의 내부에 결합하도록 디자인된다. 매우 특이적인 프라이머의 위치 선택은 시료 오염이 일어났을 경우, 심지어 해리 곡선에서 오염 발생이 확인되지 않을 때조차도 게놈 DNA가 증폭되는 것을 막아준다(ABI, 7900HT). 이러한 예방책은 모두 게놈 DNA에 의한 최소한의 오염일지라도 정량적 RT-PCR만큼 민감한 기술로 얻어진 결과에 매우 유의미한 영향을 줄 수 있다는 사실을 바탕으로 한다. 또 다른 중요한 선택 기준은, 선택된 프라이머 쌍이, 생성된 특이적 PCR 생성물을 비특이적으로 방해하여 (여기서 사용된 SYBR Green 기술에 고유한) 결과를 왜곡시킬 이중체를 형성하지 않도록 보장하는 것이다. 마지막으로 프라이머는 공통 영역 및/또는 다형성을 포함하지 않는 것으로 선택된다. 표적 유전자의 프라이머로서 선택된 뉴클레오티드 서열의 총 특이성은, 인간 게놈 전역에 걸친 콜라주(뉴클레오티드-뉴클레오티드 블라스트(blast))를 제조해 봄으로써 시험된다(Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990).
- 표준 증폭 곡선
NHEK 세포로부터 추출한 RNA에 대해 2개씩 제조한 프라이머를 대상으로 5배 연속 희석(4점 희석)에 의해 그 효능을 시험하였다. 효능이 100%에 가까운(기울기가 3.32인) 프라이머 쌍들만이 남게 되었다. SYBR Green법에 의해 얻어진 정량적 PCR 결과를 왜곡시킬 수 있었던 이중체가 형성되지 않도록 보장하기 위해, 주형 부재 대조(No-Template Control; NTC) 증폭도 또한 수행하였다. 수득된 증폭 생성물이 유일무이하도록 보장하기 위해, 7900HT 디바이스로 작성된 해리 곡선을 사용하였다. 프라이머 효능이 감소하는 것을 어떻게든 막기 위해 표준 증폭 곡선을 정기적으로 검사하였다.
- 증폭
SYBR Green법(SYBR Green PCR 코어 시약 키트, Applied Biosystems)을 이용하여 ABI Prism 7900 서열 검출 시스템(Applied Biosystems) 상에서 증폭을 실시하였다. 증폭은, 변성 단계(95℃에서 10분)와, 이후 잡종화(95℃에서 15초) 및 연장(65℃에서 1분)의 주기를 40회 반복하여, 각 가닥의 기하급수적 증배를 보장하는 단계로 이루어진다.
- 정량된 유전자
AD 표현형에 특징적인 것으로서 정량된 유전자를, 하기 표 2의 좌측 컬럼에 나열하였다. 반응 값은 정규화하였다. (표의 좌측으로부터 우측 방향으로) AD라고 표시된 컬럼은, (활성 제제 부재시) 각 유전자의 유도 수준을 나타낸다. ETOH40이라고 표시된 컬럼은, 용매로 말미암아 일어날 수 있는 반응 방해를 검출하기 위해 활성 제제를 사용하지 않고 용매만을 단독으로 사용하였을 때 얻어진 값에 해당한다. 그 옆에 (W01이라 표시된) 컬럼 2개는 유도 후 시험 시료가 2가지 농도, 즉 1.5 mg/ml 및 0.75 mg/ml로 존재할 때의 값이다. 마지막 컬럼은 양성 대조군, 즉 0.28 mM 덱사메타손에 의해 얻어진 값을 보여준다.
결과
표에 제시된 결과들은, 전염증 유전자 및 염증 유전자 (인터루킨 및 케모카인)의 억제력뿐만 아니라 (아토피 피부염에는 결핍된) 항미생물 펩티드의 유도를 보여준다. 강하게 유도된 항미생물 펩티드는 DEFB103, RNASE7였는데, 특히 건선의 경우는 S100A7(W01에 의해 유도됨)로서, 이는 용량 의존적 방식으로 유도되었다. 억제된 인터루킨은 IFNB1, IL1A 및 IL1B였다. IL4R 및 TLR3 수용체는 억제되었는데, 이 수용체들 중 TLR3 수용체는 케모카인 TSLP의 거의 완전한 억제와 긴밀하게 상관되어 있다. 이들 인자 2개는 AD 환자에서, 더욱 구체적으로는 AD 환자에서 소양증이 나타날 때 과발현된다(Miyagaki et al. 2015. J Dermatol Science 78:89-94). 이처럼 시험관 내 AD 모델에 있어 미모사 푸디카 PCC 추출물에 의한 강력한 항 TSLP 억제를 본 발명자들이 처음으로 입증하였다. 케모카인 CCL11, CCL13, CCL20, CCL27, CCL5, CX3CL1, IL15, 특히 IL8은 용량에 상관없이 추출물 W01에 의해 강력하게 억제되었다. 요약하면, 본 실험은 미모사 푸디카 PCC 추출물이 전염증 인자와 염증 인자 대다수, 특히 AD 환자에 있어서 소양증을 유발하는 인자 TSLP를 덱사메타손 대조군에 뒤지지 않고 오히려 더 많이 억제함을 보여준다.
Claims (32)
- 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 미모사 푸디카 세포 추출물의 시험관 내 제조를 위한 방법으로서, 하기 단계들, 즉
a. 미모사 푸디카의 멸균 식물 재료를 제공하는 단계;
b. 식물 재료로부터 유래한 세포를 탈분화하는 (dedifferentiation) 단계;
c. 탈분화된 세포를 미분화 상태로 유지시키기 위해 미분화 세포를 액체 배지 중에 현탁 배양하는 단계;
d. 미분화 세포 바이오매스를 배양 배지 중에서 번식 배양하는 단계;
e. 번식을 중단시키고, 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 세포 추출물을 수득하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 미모사 푸디카 식물 재료는 잎, 줄기, 잎자루, 뿌리, 종자, 꽃 및 싹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 탈분화 단계인 단계 b)는 하나 이상의 성장 인자를 함유하는 고체 배지상에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 하나 이상의 성장 인자는 옥신, 시토카인, 지베렐린 및 이것들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 호르몬을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 탈분화된 세포 캘러스를 수득하기 위해 탈분화 단계인 단계 b)가 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 c)는 하나 이상의 성장 인자를 함유하는 액체 배지 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 하나 이상의 성장 인자가 탈분화 배지 중의 성장 인자와 동일한 것 또는 동일한 것들인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 번식 배양 단계인 단계 d)는, 일정한 세포 밀도가 얻어질 때까지 연속적인 계대배양 또는 희석에 의해 액체 배양 배지 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 하기 추가 단계들, 즉
f. 액체/고체 분리 단계;
g. 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 것으로서, 배양 배지로부터 분리된 바이오매스로 이루어진 세포 추출물을 회수하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서, 하기 추가 단계들, 즉
f. 액체/고체 분리 단계;
g. 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 것으로서, 배양 배지의 액체 상으로 이루어진 세포 추출물을 회수하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서, 추출물을 파쇄하는 단계 및 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 파쇄 세포 재료를 회수하는 단계와 같은 추가의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항에 있어서, 얻어진 파쇄 재료를 대상으로 액체/고체 분리가 수행된 다음, 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 세포 추출물로서 액체 상이 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항에 있어서, 얻어진 파쇄 재료를 대상으로 액체/고체 분리가 수행된 다음, 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 세포 추출물로서 세포 파편 고체 상이 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 c) 및/또는 단계 d)의 배양 배지는 페닐-암모니아-리아제 기질을 함유하되, 상기 페닐-암모니아-리아제 기질은 페닐알라닌, L-페닐알라닌, 신남산, 아스파르트산, 글루탐산 및 이것들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 얻어진 추출물은 적어도 하나의 N-페닐프로페노일 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, N-페닐프로페노일 아미노산은
P1: 1-O-(4-쿠마로일)-β-D-글루코스
C15H18O8
P2: N-p-쿠마로일아스파르트산 또는 아스파르트산; (S)-형, N-(4-하이드록시신나모일)
C13H13NO6
P3: N-cis-(p-쿠마로일)글루탐산 또는 글루탐산; (S)-형, N-(4-하이드록시-Z-신나모일)
C14H15NO6
P5: 4-하이드록시신나미드
C9H9NO2
P6: 글루탐산; (S)-형, N-신나모일
C14H14NO5
및 이것들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 의한 방법에 의해 수득 가능하고, 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인, 미모사 푸디카 세포의 시험관 내 배양 추출물.
- 자체의 미모신 함량이 건조 중량 1 g당 5 ng 미만인 것을 특징으로 하는, 미모사 푸디카 세포의 시험관 내 배양 추출물.
- 제17항에 있어서, 적어도 하나의 N-페닐프로페노일 아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 추출물.
- 제19항에 있어서, 적어도 하나의 N-페닐프로페노일 아미노산은
P1: 1-O-(4-쿠마로일)-β-D-글루코스
C15H18O8
P2: N-p-쿠마로일아스파르트산 또는 아스파르트산; (S)-형, N-(4-하이드록시신나모일)
C13H13NO6
P3: N-cis-(p-쿠마로일)글루탐산 또는 글루탐산; (S)-형, N-(4-하이드록시-Z-신나모일)
C14H15NO6
P5: 4-하이드록시신나미드
C9H9NO2
P6: 글루탐산; (S)-형, N-신나모일
C14H14NO5
및 이것들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 추출물. - 제17항에 있어서, 추출물 중 적어도 하나의 N-페닐프로페노일 아미노산 총 함량은 건조 바이오매스 1 g당 1 μg 내지 50 μg에 포함되는 것을 특징으로 하는 추출물.
- 제17에 있어서, 세포는 미분화 세포인 것을 특징으로 하는 추출물.
- 제17에 있어서, 염증성 피부 장애의 치료에 사용되기 위한 추출물.
- 제17에 있어서, 흉선기질림포포이에틴의 억제제로서 사용되기 위한 추출물.
- 제23항에 있어서, 상기 염증성 피부 장애는 아토피 피부염, 소양증, 소양증으로 말미암은 가려움증, 습진 및 건선으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 추출물.
- 아토피 피부염, 소양증, 소양증으로 말미암은 가려움증, 습진 및 건선으로부터 선택되는 염증성 피부 장애를 치료하기 위한 피부과 조성물로서, 유효량의 제17항에 의한 추출물과, 피부과용 부형제 적어도 하나를 포함하는 피부과 조성물.
- 화장품용으로서 허용 가능한 부형제와 합하여진, 제17항에 의한 추출물을 포함하는 화장품 조성물.
- 제27항에 있어서, 피부 노화, 그리고 피부 산화 스트레스에 대한 비-치료적 (non-therapeutic) 미용적 처치되는, 화장품 조성물.
- 제28항에 있어서, 상기 산화 스트레스는 환경 오염으로 말미암은 산화 스트레스인 화장품 조성물.
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