KR101838309B1

KR101838309B1 - 아르가니아 나무의 탈분화, 미발현된 세포들의 시험관내 배양으로부터 제조되는 조제물, 피부 노화, 염증 및 흉터형성을 치료하는 그의 용도, 및 그의 생산 방법

Info

Publication number: KR101838309B1
Application number: KR1020127027671A
Authority: KR
Inventors: 니꼴라 스뜨와르; 앙느 망또; 나딸리 까스떼-리찌
Original assignee: 삐에르화브르데르모-코스메띠끄
Priority date: 2010-03-31
Filing date: 2011-03-30
Publication date: 2018-04-26
Also published as: TN2012000452A1; IL222201A0; EP2552401A2; EP2552401B1; PT2552401T; AU2011234469B2; CA2794115C; IL222201A; BR112012024630B1; MX2012011272A; FR2958163B1; CN102821750B; TWI513474B; CA2794115A1; US20130017178A1; RU2012144287A; WO2011121051A2; JP2013523691A; WO2011121051A3; AR080816A1

Abstract

본 발명의 목적은 탈분화되고 (dedifferentiated) 미발현된 (non-elicited) 아르간 세포들의 시험관내 배양으로부터 유래한 조제물 (preparation), 상기 조제물을 함유하는 미용적 또는 피부과학적 조성물, 피부 노화, 염증, 치유 (healing)의 치료를 위한 그의 용도들이다.

Description

아르가니아 나무의 탈분화, 미발현된 세포들의 시험관내 배양으로부터 제조되는 조제물, 피부 노화, 염증 및 흉터형성을 치료하는 그의 용도, 및 그의 생산 방법 {Preparation created from an in vitro culture of dedifferentiated, non-elicited cells of the Argania tree, use thereof for treating skin ageing, inflammation and scarring, and production thereof}

아르간 (Argan)은 사포타시아 (Sapotacea)과에 속하는 나무이고, 그의 과학적 명칭은 아르가니아 스피노자 (L.) 셀레스 (Argania spinosa (L.) Scelles)이다.

그의 습성은 올리브 나무와 유사하다; 이것은 짧고 꼬인 나무줄기를 가진다. 나무는 매우 단단하고 조밀하다. 가지들은 매우 가시가 많고, 또한 종종 집단으로 모인 작고, 끝이 뾰족하고, 교차하는, 짧고 (약 2 cm 길이) 협소한 나뭇잎들을 가진다. 잎들은 늘 푸르지만, 심한 가뭄이 있을 때마다 죽어서 잎이 떨어진다. 꽃들은 자웅 동체이고 다섯 개씩 모여 있다. 그들은 집단 화서 (glomerules)로 그룹을 이루고, 5월과 6월에 꽃을 피운다. 그들은 녹황색을 띤다.

아르간 나무 (Argan tree)는 5년생부터 처음 열매를 생산할 수 있다. 열매는 황색 계란형의 꼭지나 줄기가 없는 베리 (sessile berry)이고, 약 4 내지 5 cm의 길이가 된다. 이것은 서로 부착된 2 내지 3개의 편평한 종자들을 포함하는 견과를 둘러싼 과육으로 구성된다.

아르간 나무는 모로코에 널리 분포하고 모로코 남서부의 에소우이라 (Essaouira) 및 아가디르 (Agadir) 지방에 주로 위치하고 있다. 아르간 나무 숲이 약 830,000 헥타르에 달한다.

모로코 인구들은 아르간의 특히 단단한 나무를 연료 공급원으로서 먼저 이용하였다. 다른 주요한 전통적인 용도는 처음에 수작업으로 추출되었지만 지금은 프레스기를 사용하여 추출되는 오일이다. 본 오일의 첫 번째 용도는 식품이고; 지금은 또 다른 응용이 화장품이다. 본 오일 생산으로부터 유래하는 과육 및 잔여 케이크는 정상적으로 동물 사료로서 사용된다.

많은 미용학적 제품들이 아르간 나무로부터 개발되어져 왔다. 종자들로부터 유래한 오일, 예를 들어 용매에 의해 획득되는 오일 (프랑스 특허 제 Fr 2 553 788호), 비-비누화물 (unsaponifiable matter)로 농축강화된 아르간 오일 (프랑스 특허 제 Fr 2 724 663호)에 관하여 여러 발명 특허들이 있었다.

오일이 아닌 물질들, 예를 들어 오일의 추출 이후에 획득되는 종자 케이크로부터 유래한 펩타이드들; 피부 노화에 관한 문제점들을 치료하는 오일 및 케이크로부터 나온 펩타이드들의 조합 (프랑스 특허 제 Fr 2 756 183호)도 역시 특허를 받아왔다. 아르간의 잎들, 단백질들, 케이크로부터 나온 사포닌들 (saponins)에 관한 발명 특허도 또한 존재한다: 잎들로부터 나온 추출물들 (유럽 특허 제 EP 1 213 025호), 케이크 단백질들 (유럽 특허 제 EP 1 213 024호), 케이크 사포닌들 (유럽 특허 제 EP 1 430 900호). 더욱 최근에는, 항-노화 화장품으로서 아르간 열매의 과육으로부터 나온 추출물의 용도를 개시하는 유럽 특허출원 제 EP 1 968 536호가 제출되었다.

따라서, 아르간 나무 전체의 조성물이 피부과학적 (dermatological) 및/또는 미용적 (cosmetic) 용도로서 흥미롭다.

먼저 아르간 나무는 생태학적으로 이것이 "생태계 (ecosystem)" 식물이 되기 때문에 중요한 자원 식물이다. 이것은 가뭄이 있는 지역들에 완벽하게 적응하여 물과 바람의 침식으로부터 땅을 보호하고, 모로코에서 사막의 진행화를 막는다. 그러나 이것은 복수의 용도들을 가진 나무이기 때문에 역시 경제학적으로도 중요하다.

이것은 모로코의 선도적인 작물이다. 따라서, 아르간 나무의 숲은 국가가 아르간 숲에 대한 우월적인 권리들을 가지도록 진술하고 있는 1925년에 발표된 다히르 (법령)에 의해 보호되고 있었지만, 지방 인구들이 용익권 (열매, 죽은 나무, 아르간 나무들 아래의 작물들)을 가지고 있다. 유네스코 (UNESCO)는 최근에 아르간 숲을 생물환경권 (biosphere) 보유지로서 분류하였다.

이것은 화장품에 사용되는 그의 나무들 또는 잎들의 용도가 본 보호된 식물에 관한 심각한 결과들을 가질 수 있는 이유가 된다.

식물로부터 관심 있는 분자들을 획득하는 또 다른 수단은 만능성 (totipotent) 탈분화된 세포 배양들을 제조하는 것이다. 탈분화된 식물 세포들의 사용도 역시 미용적 제품들의 개발 중에 맞닥뜨리는 일정의 산업화 문제점들을 회피할 수 있다. 세포 배양으로, 서로 다른 식물 회분들 (batches) 또는 수확물들 간에 관심 있는 물질들의 농도의 차이가 사라진다. 이것은 또한 비교적 쉽고 비-파괴적인 기법이며 이를 확립하는 데 비용이 높지 않다. 마지막으로, 이것은 세포들이 배양 배지 내에 있고 활성 화합물들이 배양 배지 또는 세포내 액체 둘 중 하나에 있기 때문에 추출에 대한 필요성도 없어진다. 따라서, 단순한 마쇄 (grinding)로 이들 화합물들이 입수가능해진다.

국제특허출원 제 WO 03077881호는 적어도 하나의 식물알렉신 (phytoalexin)을 생산하도록 시험관내 배양된 탈분화되고 발현된 식물 세포들의 균질물 적어도 하나를 포함하는 국소적 적용을 위한 조성물을 개시하고 있다. 식물 물질은 포도나무로부터 유래하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 출원은 탈분화되고 발현될 수 있는 식물 세포들의 미용적 적용을 개시하고 있고, 여기에서 발현 (elicitation)은 국소적 사용 시 생물학적 활성을 나타내도록 충분한 양의 이차적인 대사물들을 유도하는 것이다.

놀랍게도 또한 예기치 않게도, 본 출원인은 탈분화되지만 미발현된 아르간 세포들의 시험관내 배양으로부터 유래한 조제물 (preparation)이 항-노화, 염증 및 치유의 분야들에서 훌륭한 미용적 및/또는 피부과학적 활성들을 가지는 점을 보여주었다.

획득된 결과들은 아르간의 특이적인 사례에서, 아르간 세포 배양들 (본 사례에서 미발현된 세포들)의 또 다른 응용이 상기에 언급된 내용의 범위에서 가능한 점을 보여주고 있다.

또한, 본 발명에서 개시된 바와 같이 조제물을 획득하는 것은 산업적으로 어렵고 비용이 많이 드는 단계인 발현 단계에 대한 필요성을 없앨 수 있다; 발현 (elicitation)은 세포 성장의 지연으로 인해 보다 더 낮은 바이오매스 수득 (yield)을 유도한다.

국제특허출원 제 WO 03077881호는 이러한 발현유도 (elicitation), 예를 들어 3일 동안 UV 방사; 24시간 내지 2일 동안 이산화탄소 처리; 5일 동안 UV 방사 및 이산화탄소 처리를 수행하는 다양한 방식들을 언급하고 있다.

아르간으로부터 유래한 식물 물질로부터 세포 탈분화를 한 다음 세포들의 현탁 배양으로 이루어진 본 발명의 체계 내에서 수행되는 공정은 본 식물의 정제되고, 농축되고, 균질한, 무균의 바이오매스 (biomass)를 신속하게 유도할 수 있다. 세포 배양은 세포 규모에서 직접적으로 본 식물의 생합성 경로들을 적용하는 것을 가능하게 만든다.

따라서, 본 발명은 탈분화되고 (dedifferentiated) 미발현된 (non-elicited)아르간 세포들의 시험관내 배양으로부터 유래한 조제물, 상기 조제물을 포함하는 미용적 또는 피부과학적 조성물, 또한 미용학 (cosmetology) 및/또는 피부과학 (dermatology)에서 그의 용도들, 선호하기로는 피부 노화, 염증 및 치유의 치료를 위한 것을 목적으로 한다.

보다 일반적으로, 현탁액으로 식물 조직들의 시험관내 배양들은 세포들의 일차적 또는 이차적 대사로부터 직접적으로 유래하는 활성을 가진 유기 화합물들을 생산하는 수단을 제공한다.

현탁액에서 식물 세포들은 동물 세포 배양들의 경우에서 줄기세포들의 상태와 유사한 탈분화 상태에 있다. 따라서, 이들 식물 세포들은 이론적으로 식물 전체에서 관찰되는 모든 대사물들을 생산할 수 있다. 탈분화는 생합성 경로들의 유전적 또는 후성적 (epigenetic) 교란을 초래하여 화학적 프로파일들이 식물 전체 및 그 결과로 나온 세포주들 간에 정량적으로 또한 정성적으로 서로 다르다. 따라서, 이론적으로는 식물 전체에서 관찰되지 않은 반응 중간물들이 세포 현탁액에서 나타날 수 있다. 이것은 새로운 기회를 제공하여 "잠복하는 (dormant)" 화학적 생물다양성에 접근할 수 있다.

현재의 기술 상태에서, 일반적으로 세포 배양의 발현들 (화학적, 물리적, 생물학적) (elicitations)은 더 이차적인 대사물들을 자극하고 생산할 수 있다. 본 발명에 따른 우리의 방법에서, 우리는 대부분의 사례와는 다르게 또한 놀랍게도, 발현이 필요하지 않고 바이오매스의 성장 및 요구되는 생물학적 활성들에 오히려 유해한 점을 보여줄 것이다.

본 발명의 목적들의 하나는 탈분화되고 미발현된 아르간 세포들의 시험관내 배양으로부터 유래한 조제물에 관한 것이다.

"탈분화된 식물 세포들 (dedifferentiated plant cells)"은 특정한 전문화 (specialization) 본성이 없는, 달리 말하면 자연적 상태에서 식물의 분열 조직과 유사한 생리학적 상태에 있는 식물 세포라면 모두를 말한다. 이들 세포들은 스스로 살아갈 수 있고 다른 세포들에 의존하지 않는다.

탈분화된 아르가니아 스피노자 (Argania spinosa) 세포들은 나무 또는 어린 새싹으로부터 채집된, 잎들, 엽병, 줄기, 껍질, 뿌리, 열매, 종자, 꽃 및 꽃 기관들 또는 봉우리, 보다 상세하게는 잎을 포함하는, 살아있는 식물 물질로부터 획득된다.

탈분화된 세포 배양들을 획득하는 방법은 당업자가 숙지하고 있는 방법이라면 모두에 의해 시험관내에서 획득된다. 예를 들어, Murashige, T., Skoog, F. 1962, A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-496; Plant Culture Media, Vol-1 Formulations and Uses E. F. George, D. J. M. Puttock, and H. J. George (1987) Exegetics Ltd. Edington, Westbury, Wilts, BA134QG England를 참조하라.

본 발명에 따른 조제물들은 다음의

a) 식물 물질의 무균화

b) 세포들의 탈분화

c) 발현인자 (elicitor)가 없는 배양 배지로 세포 현탁

d) 발현인자가 없는 배양 배지로 바이오매스 증식 및 생산,

및 조제물을 획득하는:

단계들을 순서대로 수행하여 획득될 수 있다.

상기 조제물들은 목적이 적은 양의 바이오매스를 생산하는 것이라면 얼렌메이어 (Erlenmeyer) 플라스크에서 또는 더 많은 양들의 경우라면 생물반응기 (bioreactor) 에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, 세포 현탁액 500 mL으로 얼렌메이어에서 수집되는 평균량은 건조 바이오매스 100g (즉, 바이오매스 200g /L 세포 현탁액)인 한편, 10 L 생물반응기에서 수집되는 평균 건조 질량은 3,000 g (300 g/L 바이오매스)이다.

세 가지의 주요한 방식들이

1. 불연속식 (discontinuous) 또는 회분식 (batch) 배양

2. 재충전/수집 또는 배지충전-회분식 (fed-batch) 배양

3. 연속식 (continuous) 배양:

생물반응기에서 식물 세포 배양을 위해 사용된다.

a. 식물 물질 무균화 단계

아르가니아 스피노자 체외이식편들 (explants), 보다 상세하게는 잎 체외이식편들을 입수하여 상온에서 수분 동안 소듐 또는 칼슘 아염소산염의 용액들 또는염화수은의 용액들로 탈오염시킨다 (decontaminate). 조직들은 무균 증류수로 헹군 다음 탈오염의 마지막 단계에 무균 증류수로 적어도 한 번 세척해낸다.

b. 세포 탈분화 단계

탈분화된 체외이식편은 슈크로스 및 성장인자들 (또는 호르몬들)이 첨가되었던 무라시지 & 스쿡 (Murashige & Skoog) 아가 영양배지와 접촉시켜서 라미나 플로우 후드 (laminar flow) 하에 놓아둔다. 이들 성장 호르몬들은 세포 분열들을 유도하도록 또한 세포 집단들 또는 탈분화된 캘러스들을 유도하도록 (캘러스화 (callogenesis)) 이식편들의 세포성 기작을 조절할 것이다. 획득된 캘러스들은 3 내지 4주마다 새로운 탈분화 영양배지로 옮겨질 것이다. 본 배지의 일정의 아가-농후 성분들은 캘러스들에 의해 대사화되거나 공기의 작용에 의해 분해될 수 있다.

일반적으로, 오옥신 (auxin) (2-4 디클로로-페녹시아세트산) 및 사이토키닌 (키네틴 (kinetin))에 기초한 호르몬성 조성물은 연약한 캘러스들의 형태로 신속하고 완벽한 조직들의 탈분화를 달성하고 (캘러스화) 액체 배지로의 이동 배양 (transfer)도 용이하게 하는 것이 성공적으로 테스트되었다. 무균의 잎 체외이식편들은 30g/L의 슈크로스, 8g/L의 아가, 0.5 mg/L의 키네틴 및 0.75 mg/L의 2-4 디클로페녹시아세트산 (24D) 첨가제들을 포함하고, pH 6으로 조정되어 121℃ (1 bar) 고압멸균기에 20분 동안 처리된 무라시지 및 스쿡 배지로 구성된 아가 배지와 접촉하면서 잎의 윗면 (adaxial face) 상에 침전될 수 있다 (Murashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-496). 체외이식편들을 포함하는 페트리 디쉬들은 28℃의 암소에서 배양되도록 놓아둔다. 첫 번째 캘러스들이 2주 이후에 나타난다. 획득된 캘러스들은 2 내지 3 cm의 크기를 유지하도록 스카펠 (scarpel)로 분리하여 3 내지 4주마다 새로운 배지로 옮겨준다. 이들 이동 배양은 연약한 캘러스들이 획득될 때까지 2 내지 6개월 동안 계속된다.

c. 발현인자가 없는 배양 배지에서 세포 현탁액을 제조하는 단계

아가 배지 상에서 캘러스들의 연속적인 이동 배양을 시행하는 세포 탈분화는 연약한 캘러스들의 형성을 유도한다. 세포들 간의 유착 시 이러한 이동 (drop)은 식물에 따라 2 또는 6개월 사이에 일어날 수 있는 탈분화의 결과이다. 이러한 상태는 유도되는 기계적인 스트레스들을 최소화하면서 세포 현탁액에서 캘러스들의 분해를 보장하기 때문에, 액체 배지로의 이동 배양을 선호한다. 따라서, 연약한 캘러스들의 수집물은 젤화제 (gelling agent) 없는 아가 탈분화 배지와 동일한 제형을 사용하여 제조된 액체 영양 배지 내로 도입된다 (부피로 10 내지 20%).

따라서 연약한 캘러스들은 2 내지 3일 동안 진탕기 (shaking table)의 작용에 의해 액체 배지에서 분해되고, 획득된 세포 현탁액은 미분해된 캘러스 부분들 모두로부터 떨어져 나와서 균질한 세포 현탁액을 형성한다. 본 현탁액은 충분히 진한 세포 집단을 획득하도록 계속 배양된다. 본 단계에서, 현탁액은 (계대 배양)또는 새로운 영양 배지로 희석되어 동일한 방식으로 배양이 시작된다.

초기 세포 현탁액은 200 mM의 배지를 포함하는 500 mL 얼렌메이어 플라스크에 넣은 약 20 내지 40 g의 연약한 캘러스들을 침전하여 시작될 수 있다. 따라서 연약한 캘러스들은 29℃에서 2 내지 3일 동안 암소에 둔 115 rpm의 진탕기의 작용에 의해 액체 배지에서 분해된다. 다음으로 세포 부유물은 피펫을 사용하여 모아지고, 분해되지 않은 잔여 캘러스 집단들은 분리하여 둔다. 따라서 세포 부유물은 균질한 세포 현탁액을 형성한다. 본 현탁액은 "충분히" 진한 세포 집단을 획득하도록 계속 배양된다. 획득된 세포 현탁액은 15일 동안 배양된 다음 새로운 배지에서 1 : 5의 희석으로 동일한 지속기간 동안 증식된다. 배양 배지의 조성 (영양소들, 성장인자들 등)에 적응되도록 하여 바이오매스 생산도 (biomass productivity)를 극대화하였다. 결과는 액체 세포 현탁액에 최적화된 ARGMS 바이오매스 증식 배지이다 (표 1 참조). 본 배지는 캘러스화를 위한 무라시지 & 스쿡의 변형된 버전이다. 본 배지는 KOH의 첨가에 의해 pH 6으로 조절된 다음 121℃ (p = 1 bar)에서 고압멸균기로 20분 또는 0.2 μm에서의 무균 여과로 이어진다.

표 1은 최적의 조건들 하에서 얼렌메이어 플라스크 또는 생물반응기에 넣은 현탁액으로 된 아르간 세포들의 배양에 사용되는 무라시지 & 스쿡 (ARGMS) 배지의 변형된 버전인 ARGMS 배지를 나타낸 것이다.

d. 발현인자가 없는 배양 배지로의 바이오매스 증식 및 생산 배양

여러 번의 이러한 계대 배양들을 거친 이후에, 세포 현탁액은 기간 내 획득된 세포 밀도가 일정해질 때 안정화된다. 다음으로, 바이오매스 생산도를 극대화하기 위한 배양 배지의 조성 (영양소들, 성장인자들 등)의 적응이 가능하다. 본 발명의 한 가지의 상세한 구현예에서, 바이오매스 생산 수단으로서 사용되는 최적화된 배지는 표 1에 기술된 배지이다.

세포 현탁액은 세포외 배지 또는 배양 부유물로부터 이를 분리하도록 여과되고 수집된 바이오매스는 증류수에 넣어 현탁액으로 다시 회수되고 0℃에 놓아둔다. 획득된 균질물 (homogenate)은 동결건조되거나 동결건조되기 이전에 이를 맑게 하도록 원심분리된다.

따라서 만들어진 "최적의 (optimum)" 조건 하에서 세포 배양이 안정화되고 15일 마다 세포 현탁액의 1 : 5 희석으로 얼렌메이어 플라스크 (증식 배양)에서 유지된다. 이것은 15일 배양 이후에 약 300 g/L의 세포 현탁액을 생산하도록 접종된, 또는 필요에 따라 생물반응기에 접종된 신선한 바이오매스 약 60 g/L의 세포 배양액과 동등하다.

얼렌메이어 플라스크 또는 생물반응기에서 획득된 조제물은:

- 세포 현탁액 (본 발명의 목적으로는, "세포 현탁액 (cell suspension)"은 그들의 배양 배지에 있는 세포들 (즉 바이오매스)를 말한다);

- 바이오매스 (본 발명의 목적으로는, "바이오매스 (biomass)"는 배양 배지로부터 분리된 세포 집단, 즉 여과 이후의 세포 현탁액을 의미한다);

- 증류수에 넣은 현탁액 내로 회수된 (또는 회수되지 않은) 이후에 마쇄된 바이오매스;

- 원심분리에 의한 또는 여과에 의한 마쇄된 바이오매스의 맑은 쥬스 또는 부유물;

- 배양 부유물 (본 발명의 목적으로는, "배양 부유물 (culture float)"은 세포들이 배양 기간 동안 남아 있는 배양 배지, 또는 세포외 배지이다);

로 구성될 수 있다.

세포 현탁액, 바이오매스 또는 마쇄된 바이오매스의 부유물이 관련되는지 여부와는 상관없이, 그들은 냉동 형태로, 또는 펜옥시-2-에탄올, 벤질 알코올 또는 화장품에 존재할 수 있는 보존제들의 리스트"라는 제목으로 된 미용 제품들에 관한 EU 지침에서의 부록 VI에 나타나 있는 보존 제품이라면 모두와 같은 보존 물질들의 첨가에 의해 변하지 않고 유지될 수 있다. 또한 그들은 글리콜 (프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜류 등)과 같은 미용학적으로 허용가능한 배지 상에서 10으로부터 60%까지 범위의 비율들로 희석될 수 있다. 세포 현탁액 또는 바이오매스도 역시 마쇄된 다음 상기에 기술된 바와 같이 이러한 냉동 형태로 또는 보존 물질들 또는 배지의 첨가에 의해 보존될 수 있다.

마쇄된 또는 마쇄되지 않은 세포 현탁액, 바이오매스 또는 바이오매스 부유물도 역시 냉동건조 또는 분무화 (atomization)에 의해 건조되어, 이와 같이 유지되거나 말토덱스트린, 락토스 또는 실리카 유형의 배지 또는 미용학적으로 허용가능한 배지 상에서 건조될 수 있다.

마지막으로, 세포 현탁액은 유용한 화합물들을 사용하여 친화 크로마토그래피에 의해 농축강화될 수 있다: 레진 (앰버라이트® (Amberlite®) XAD®-21a 유형의 폴리스티렌 공중합체들 등) 상에서의 흡착 또한 에탄올과 같은 적절한 용매로의 용출.

본 발명에 따른 방법으로 획득된 신선한 바이오매스는 현탁액 리터 당 약 100 내지 500 g을 나타내고, 더욱 바람직하게는 최적의 수집일 (즉 평균적으로 약 15일)에 나온 현탁액 리터 당 200 및 350 g 사이의 범위를 나타낸다.

다음의 표는 획득된 수율들 (획득된 산물의 그램수 / 세포 현탁액의 L로 된 수율)을 표현하고 있다:

본 발명은 또한 상기에 기술된 바와 같이 미발현되고 탈분화된 아르간 세포들의 배양으로부터 유래한 조제물을 활성 성분으로 포함하는 미용적 또는 피부과학적 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 조제물의 양은 조성물의 전체 무게의 0.1 및 10% 사이의 범위이다. 또한 보다 더 선호하기로는, 상기 추출물의 양은 0.2% 및 5% 사이의 범위이다.

본 발명에 따른 미용적 조성물은 유익하게 국소적 또는 경구적 적용, 선호하기로는 국소적 적용을 위한 화장품에 정상적으로 사용되는 생약 형태라면 모두로 존재할 수 있다. 국소적 경로에 의한 투여의 경우, 생약 형태는 크림, 젤, 연고 또는 스프레이일 수 있다. 경구적 제형은 정제들, 캡슐제들 및 음용가능한 현탁용 분말제들을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.

본 발명에 따른 미용적 조성물은 또한 보통의 미용적으로 양립가능한 부형제들을 포함한다.

미용적 조성물과 양립가능한 보통의 부형제들은 상기에 기술된 것들과 같은 형태들로 국소적 적용을 위한 미용적 조성물을 획득하도록 당업자라면 숙지하고 있는 것들 중의 부형제라면 모두일 수 있다.

상세하게 본 발명에 따른 미용적 및/또는 피부과학적 조성물은 에멀전화, 청정화, 거품 유형의 표면활성제들 등과 같은 첨가제들 및 제형 보조제들, 복합 제제들, 비후제들, 젤화제들, 안정화제들, 항미생물들 및 항산화제들을 포함하는 보존제들, 조절제들, 산성화제들, 알칼리화제들, 연화제들, 용매들, 채색제들 및 향료들을 포함할 수 있다.

또한 본 발명자들은 탈분화된 미발현된 아르간 세포들로부터 유래한 조제물들이 다음의 활성들을 가질 수 있는 것으로 확인하였다:

- 본질적인 및 비본질적인 노화 및 염증성 과정과 관련된 산화 과정을 제한하는 항산화, 항-라디칼 활성

- 콜라겐을 분해하는 금속성 단백분해효소 (metalloproteases)의 저해를 통하여 성숙한 피부의 기계적인 특성들 (견고성, 탄력성, 긴장성)을 개선하도록 세포외 기질 상에 미치는 활성.

마지막으로, 본 발명은 피부 노화, 염증 및 치유의 치료에 사용되는 본 명세서에서 기재된 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 상기 및 다른 기술적 과제와 특징은 다음과 같은 도면을 참조하여 이루어지는 본 발명의 실시예에 대한 설명을 통하여 당업자에게 명확해 질 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 미발현된 아르간 바이오매스 및 발현 이후에 획득된 아르간 바이오매스가 인간 HaCaT 각질세포들에서 TGF-β1의 합성에 미치는 효과들을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 아르간 바이오매스의 인간 각질세포들의 증식에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 아르간 바이오매스의 HaCaT 각질세포들의 이동에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

다음의 실시예들은 비제한적인 실시예들로서 기술된다.

본 발명에 따른 조제물을 생산하는 실시예들.

실시예 1: 신선한 바이오매스 / 얼렌메이어 플라스크에서 시행되는 공정

선호하기로는 3 내지 4개월 된 아르간 잎들은 순서대로 여러 번의 수조 처리에 의해 무균화되고: 1분 동안 70% 알코올, 3분 동안 2% 소듐 아염소산염, 다음으로 8분 및 10분 지속되는 탈무기질화 된 수조 처리로 두 번 헹구어진다.

무균의 잎 체외이식편들은 30 g/L의 슈크로스, 8 g/L의 아가를 포함하고, 0.5 mg/L의 키네틴 및 0.75 mg/L의 2-4 디클로페녹시아세트산 (2.4-D)이 보충되며 pH 6으로 조정되어 121℃ (1 bar) 고압멸균기에 20분 동안 처리된 무라시지 및 스쿡 배지로 구성된 아가 배지와 접촉하면서 잎의 윗면 (adaxial face) 상에 침전될 수 있다 (Murashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-496). 체외이식편들을 포함하는 페트리 디쉬들은 28℃의 암소에서 배양되도록 방치되고, 연약하고 안정화된 캘러스들이 획득될 때까지 증식된다.

초기의 세포 현탁액은 약 40 g의 연약한 캘러스들을 200 mL의 고압멸균된 배지를 포함하는 500 mL 얼렌메이어 플라스크에 침전시켜 만들어지고, 배지의 조성은 상기에 언급된 표 1에 기술되어 있다.

배양은 29℃의 암소에서 115 rpm의 진탕기 상에 한 주 동안 둔다. 다음으로 세포 부유물은 피펫으로 수집되고 캘러스들의 잔여 집단들은 남겨진다. 획득된 세포 현탁액은 15일 동안 배양된 다음 새로운 배지에서 1 : 5의 희석으로 동일한 지속 기간 동안 증식된다.

다음으로 현탁액은 진공 상태 하에서 여과되고 바이오매스는 회수된다. 획득된 신선한 바이오매스의 수율은 168 g/L이다.

바이오매스는 -20℃에서 보관된다.

실시예 2: 건조 바이오매스

실시예 2a: 건조 바이오매스 / 회분식 배양으로 생물반응기에서 시행되는 공정

실시예 1에서 기술된 바와 같이 획득된 4가지의 500 mL 얼렌메이어 세포 현탁액들을 접종기에 함께 모아서 10 L 생물반응기 내로 무균 상태로 주입된 2 L의 접종액을 형성한다. 본 생물반응기는 30 mg/L의 미리 무균화된 항-거품제를 보충하여 식힌 다음 생물반응기 용기 내에 밀폐된 회로에서 항온 조절된 물 순환에 의해 29.5℃로 유지되는 최적의 배지 8 L로 채워진다.

산소 탐침 (probe)은 컴퓨터화된 pO₂ 조절 장치 내로의 포화 및 유입 데이타에 의해 실시간으로 측정된다. 본 기기는 환기 시스템 내로 무균의 순수한 산소의 주입에 의해 pO₂를 80%로 유지한다. 또한 본 생물반응기는 동시에 pCO₂를 6%로 유지하도록 컴퓨터화된 pCO₂ 조절 장치 내로 데이타를 유입하는 유출 기체들 (상부 공간)에는 CO₂ 온라인 측정기를 장착하고 있다. 이것은 산소와 혼합된 환기 장치 내로 무균의 대기 공기의 주입으로 시행된다. 또한 생물반응기는 세포 현탁액을 교반하고, 이것이 침전되는 것을 방지하도록 75 rpm으로 회전하는 추진기 (propeller) 유형의 교반 시스템을 장착하고 있다. 자동 장치가 무균의 시료 채취 및 바이오매스의 감시를 가능하도록 생물반응기의 유출 면 상에 장착되어 있다.

회분식 배양은 신선한 바이오매스의 280 내지 320 g/L의 세포 밀도에 도달하도록 이들 일정한 온도 및 용해된 기체 조건들 하에서 15 내지 17일 동안 유지된다. 생물반응기는 본 회분식 배양이 완성된 이후에 비워지고, 바이오매스는 부흐너 깔대기 (Buchner funnel)를 사용하는 필터 상에서 여과에 의해 수집된다.

동일한 증류수 양에 녹인 수집된 신선한 바이오매스는 "초음파 청정기 (ultrasonic cleaner)"를 사용하여 저온 마쇄된 다음 냉동건조된다.

실시예 2b: 건조 바이오매스 / 배지충전 - 회분식 배양 10.0.0. 1으로 생물반응기에서 시행되는 공정

4가지의 500 mL의 얼렌메이어 세포 현탁액들이 실시예 2a에서 기술된 바와 같이 접종액으로서 사용되었다. 생물반응기는 실시예 2a에서 표시된 바와 같이 준비된다. 용해된 기체, 온도 및 교반 조절 시스템들은 실시예 2a에서 표시된 바와 같이 준비된다.

초기 배양은 신선한 바이오매스의 280 내지 320 g/L의 세포 밀도를 달성할 때까지 이들 일정한 온도 및 용해된 기체 조건들 하에서 15 내지 17일 동안 유지된다. 10 L 생물반응기의 80% 함량이 본 초기 배양이 완성된 이후에 배출된다. 다음으로, 8 L의 세포 현탁액은 수집된다. 본 현탁액에 있는 바이오매스는 부흐너 깔대기를 사용하는 필터 상에서 여과에 의해 수집된다. 2,240 내지 2,560 g의 신선한 바이오매스가 수집된다. 동일한 양의 증류수에 녹인 수집된 신선한 바이오매스는 초음파 청정기를 사용하여 저온에서 마쇄된 다음 냉동건조된다. 100 내지 130 g의 냉동건조된 바이오매스가 획득된다.

80%의 부분적 수집이 시행되는 동시에, 10 L의 배양 부피를 회복하도록 미리 고압멸균되고 식혀진 ARGMS 배지가 2 L의 세포 현탁액을 포함하는 생물반응기 내에 주입된다. 배지충전-회분식 배양은 신선한 바이오매스의 280 내지 320 g/L의 세포 밀도를 달성할 때까지 이들 일정한 온도 및 용해된 기체 조건들 하에서 5 내지 7일 동안 유지된다. 본 배양은 바이오매스가 지속되는 생리학적 세포 분열 상태에 있기 때문에 초기 배양보다 더욱 신속하여, 새로운 영양 배지의 주입은 24시간 이하의 잠복기 (latency phase) 및 바이오매스의 즉각적인 증식으로 특징 지워진다. 본 배지충전-회분식 배양의 마지막에는, 10 L 생물반응기의 80%가 제거된다. 다음으로 8 L의 세포 현탁액이 수집된다. 본 현탁액의 바이오매스는 부흐너 깔대기를 사용하는 필터 상에서 여과에 의해 수집된다. 다음으로 배양은 이전과 같이 재시작된다.

실시예 2c: 건조 바이오매스 / 연속식 배양 생물반응기에서 수행되는 공정

4가지의 500 mL의 얼렌메이어 세포 현탁액들이 실시예 2a에서 기술된 바와 같이 접종액으로서 사용된다. 생물반응기는 실시예 2a에서 표시된 바와 같이 준비된다. 용해된 기체, 온도 및 교반 조절 장치들은 실시예 2a에서 표시된 바와 같이 준비된다.

초기 배양은 신선한 바이오매스의 150 g/L의 세포 밀도 및 0.2 d^-1의 순간적인 신선한 바이오매스의 성장율에 도달할 때까지 이들 일정한 온도 및 용해된 기체 조건들 하에서 10일 동안 유지된다. 본 단계에서, 10 L 생물반응기의 1.2%의 함량이 1시간 20분마다 제거된다. 이들 시료들은 동일한 양의 새로운 ARGMS 배지를 생물반응기 내로 주입하여 보충된다. 본 방법은 세포들을 일정한 생리학적 상태 및 세포 밀도로 유지시킨다.

다음으로 100 내지 120 mL의 세포 현탁액이 수집된다. 본 현탁액에 있는 바이오매스는 부흐너 깔대기를 사용하는 필터 상에서 여과에 의해 수집된다. 15 g 내지 18 g의 신선한 바이오매스가 각 시료에 대해 수집된다. 동일한 양의 증류수에 녹인 수집된 신선한 바이오매스는 초음파 청정기를 사용하여 저온에서 마쇄된 다음 동결건조된다. 획득된 결과는 각 배출물에 대하여 0.71 내지 0.85 g의 냉동건조된 바이오매스이다. 따라서 배양은 적어도 60일 동안 유지된다. 이것을 시간 제한 없이 유지하는 것이 이론적으로 가능하다.

이전의 방식으로 된 연속식 배양의 장점은 청정화 (cleaning) 및 무균화를 요구하는 생물반응기를 다시 준비할 필요가 없고 세포 잠복기도 없는 점이다. 1 내지 1.5%의 세포 현탁액을 자동적으로 배출하고 이어지는 생물반응기에 새로운 배지의 보충은 생물반응기에서 진행 과정 동안 배양 배지의 조성에서 최소의 변화들을 유도한다. 따라서, 세포 집단은 다른 배양 방식들에서 관찰되는 바이오매스의 양적 생산도의 감소에 책임이 있는 잠복기 동안의 대사적 재적응 (readjustments)이라면 모두를 겪지 않는다.

실시예 3: 바이오매스가 실시예 2a에서 기술된 바와 같이 획득된 신선한 바이오매스 부유물

실시예 2a에서 기술된 바와 같이 획득된 20 g의 신선한 마쇄된 바이오매스가 10,000 g에서 15분 동안 원심분리되고, 부유물이 수집된다. 다음으로 이것은 냉동건조된다.

평균 수율은 신선한 바이오매스 g 당 30 mg의 냉동건조된 부유물이다.

미용적 조성물들의 실시예들 :

실시예 4: H/E 제형

실시예 5: E/H 제형

실시예 6: 항산화 활성의 평가

화학발광

본 방법은 광화학적 신호에 의해 자유 라디칼들 (슈퍼옥사이드 라디칼 O₂ ⁰ ^-)을 생성한다. 산화의 강도는 정상적 조건들 하에서 획득된 것보다 1,000배 더 크다. 검출은 화학발광 (chemiluminescence)에 의해 시행되고, 지용성 또는 수용성 항산화 추출물들 또는 분자들을 평가하는 데 사용된다. 결과들은 비타민 C 또는 트로록스 (Trolox) (6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산)의 동등한 양으로서 표현된다. 민감도는 1 나노몰의 단위이다.

결과들의 분석은 두 가지의 판단기준, 즉 곡선의 형태 (적분) 및 소프트웨어에 의해 주어진 나노몰로 표시되는 수치에 의존한다. (Igor Popov and Gudrun Lewin. Methods in enzymology [44] vol 300. 437-456; Maibach I Howard and coll. Journal of Cosmetic Dermatology Vol 7(2) 96-100 (2008)).

결과들은 1 μg의 표준물질 (= 트로록스)에 대해 검출되는 활성과 동등한 활성을 획득하는 데 필요한 시료의 μg으로 표현될 것이다. (ACL Kit).

결과들:

본 테스트에서 연구된 항산화 활성은 화학발광에 의해 특이적으로 슈퍼옥사이드를 포집하는 능력을 나타낸다.

표 2는 트로록스 동등물에서의 항산화 능력의 평가 및 정량을 나타낸 것이다.

실시예 2a에 따라 제조된 냉동건조된 바이오매스 및 실시예 3에 따라 제조된 마쇄된 냉동건조된 바이오매스의 부유물은 전세계적으로 동등한 항-라디칼 포집 활성을 가진다.

278 μg의 냉동건조된 바이오매스가 1 μg의 트로록스에 대해 검출되는 활성과 동등한 활성: 기준 항산화 분자, 코엔자임 Q10과 등등한 활성을 획득하는 데 필요하다.

171 μg의 마쇄된 냉동건조된 바이오매스 부유물이 1 μg의 트로록스에 대해 검출되는 활성과 동등한 활성을 획득하는 데 필요하다.

외부적 공격들 (추위, 오염, 담배, UV)의 결과로서 생산이 증가되는 자유 라디칼들은 피부 세포 DNA 뿐만 아니라 세포성 및 미토콘드리아성 막 DNA에 대한 손상에 책임이 있다. 또한 이들 자유 라디칼들은 염증의 과정에서 매우 중요한 역할을 한다. 이들 매우 반응성이 큰 대사물들은 세포 산화 스트레스 신호전달의 이차적인 전달자 (secondary messengers)이고 따라서 염증의 초기 매개인자들이다 (A. Van Der Vliet and coll, Chem Biol Interaction 85: 95- 116 1992).

실시예 2a 및 실시예 3에서 기술된 조제물들의 항-라디칼 활성은 본질적 및 비본질적인 피부 노화 및 염증에 대항하도록 돕는다.

실시예 7: 세포외 기질을 형성하는 콜라겐 상에 미치는 금속성 단백분해효소의 저해 평가

세포외 기질 (ECM)은 조직들을 위해 구조적 및 조절적 역할을 가진 동적인 구조체 (dynamic structure)이다. 이것은 피부에 그의 종창 및 기계적 특성들을 부여한다. 표피에서, 이것은 세포간 (intercellular) 공간을 차지하고 표피 구조에 대한 지지체를 제공한다. 또한 이것은 표피 세포들 간의 상호교환 작용들을 조절하고 세포 활성에서 역할을 담당한다. 이것은 섬유들, 상세하게는 콜라겐 및 기본적인 물질들 (물, 염들, 당단백질들, 글리코사미노글리칸들)로 구성된다. 콜라겐들은 공유적 수소 결합들에 의해 연결된 동일하거나 서로 다를 수 있는 세 가지의 폴리펩타이드 사슬들로부터 형성되는 섬유성 단백질들이다. 콜라겐들은 섬유성 망상조직의 필수적인 성분을 형성하고, 피부에 저항성 및 탄력성을 제공하는 기계적인 역할을 담당한다.

세포가 노화될 때, ECM의 대부분 성분들은 기질 금속성 단백분해효소 (MMPs)라고 불리는 아연-농후 엔도펩티다제 유형의 효소들에 의해 분해된다 (Hideaki Nagase § and J. Frederick Woessner. J Biol Chem, Vol. 274, Issue 31, 21491-21494, July 30, 1999). 그들은 막에 있거나 분리된다. 모든 MMPs는 강한 서열 및 구조 상동성을 가지지만 기질의 특이성은 서로 다르다. MMP1 또는 "간질성 콜라겐 분해효소 (interstitial collagenase)"는 제 I형 콜라겐 (정상 피부의 진피에서 80%의 함량)을 우세적으로 분해하고 제 Ⅱ형, 제 Ⅶ형, 제 Ⅷ형 및 제 X형 콜라겐들도 역시 분해한다.

특이적 펩타이드 기질 Mca-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2을 사용하는 인간 재조합 효소의 모델 상에서, 우리는 형광측정 정량법에 의해 직접적인 효소적 활성에 미치는 추출물들의 효과를 분석하였다 (David Leppertd and coll, Analytical Biochemistry 328 (2004) 166-17).

활성화된 효소가 서로 다른 조제물들과 미리-배양된 다음 기질의 존재 하에 놓아둔다. 효소는 Mca 형광단 (7 메톡시쿠마린-4-일)아세틸)을 제거물질 (quencher) Dpa (N-3-(2,4-디니트로페닐)-L-2,3 디아미노프로피오닐)로부터 분리하는 펩타이드를 절단한다. 다음으로 펩타이드는 320 nm에서 여기될 때 405 nM 파장을 가지는 형광을 방출한다. 따라서, MMP-1의 효소 활성이 측정되고 이는 방출된 형광에 비례적이다.

터보 (tubo) 테스트에서 이러한 점으로, 우리는 잠재적인 MMP1 활성 저해제들, 콜라겐들의 분해 개시에 결정적인 역할을 가진 효소를 검출할 수 있다. 우리는 MMP1 활성 저해의 백분율을 측정한다.

저해제 또는 산물과 관련된 효소적 저해의 백분율 계산:

저해% = 100 x [(최대 순 효소 활성)(저해제 존재 시 순 효소 활성)/최대 순 효소 활성]

결과들:

실시예 3에 따라 제조된 부유물은 MMP1 활성 및 의존적 용량을 60으로부터 500 μg/mL까지 유의하게 저해한다.

표 3은 (실시예 3에 따라 제조된) 냉동건조된 마쇄된 바이오매스의 부유물에서, MMP1의 저해를 백분율 (%) 결과들로 나타낸 것이다.

실시예 2a에 따라 제조된 냉동건조된 바이오매스는 60으로부터 1,000 μg/mL까지 테스트되었다. 전체적인 바이오매스의 물리화학적 간섭으로 인해, 우리는 저해 활성을 측정할 수 없었다. 그러나, 매우 유사한 추출물이 테스트되었고, 60 μg/mL으로부터 1,000 μg/mL까지 유의한 저해들을 보여주었다.

실시예 3에 따라 제조된 추출물은 노화가 일어날 때 MMPs의 증가된 활성에 대항할 수 있고, 콜라겐의 기계적인 역할을 유지하는 데 기여할 수 있어 피부에 저항성 및 탄력성을 제공한다.

실시예 8: HaCaT 각질세포들에서 TGF -β1 합성의 측정

TGF-β1 (형질전환 성장인자-베타 1)은 서로 다른 세포 유형들에 의해 분비되는 TGF-β의 슈퍼 패밀리에 속하고, 세포 성장의 조절 또한 복수의 세포 반응들 및 생물학적 공정들의 조절에 중요한 역할을 한다. 본 슈퍼 패밀리에 있는 사이토카인들의 주요한 활성들은 그들이 대부분의 세포들의 증식을 조정하고 섬유모세포들의 증식을 촉진하고 세포외 기질의 형성을 증가시키는 것이다 (Lawrence, 1996). TGF-β1은 또한 손상들의 복구, 치유 공정들에, 상세하게는 세포 골격 (cytoskeleton) (액틴)의 재조직화를 유도하고 또한 표피 세포들의 이동을 촉진하여 관여한다 (Cullen et al., 1997; Boland et al., 1996). 피부 조직에 나타나는 세포 집단 대부분은 각질세포 집단이다. 이것은 피부 세포들, 즉 섬유모세포들의 행동을 조절하고 영향을 줄 수 있는 성장인자들의 중요한 출처를 형성한다 (Ghahary et al., 2001).

장치 및 방법들

미발현된 바이오매스의 생산: 실시예 2a에 따른 발현된 바이오매스의 제조

무라시지 & 스쿡 배지는 성장인자들 (키네틴 및 24D) 없이 제조된다. 본 배지는 KOH의 첨가에 의해 pH 6으로 조절되고 121℃ (p = 1 bar)에서 20분 동안 고압멸균이 이어진다. 다음으로 본 배지는 증식 배양으로부터 유래한 세포 현탁액을 사용하여 1 : 5의 양으로 접종된다. 발현 (elicitation) 조건들은 6-벤질아미노퓨린 (BAP 또는 (N-(페닐메틸)-7H-퓨린-6-아민)의 농축된 용액 및 발현인자 제제들 (아세틸살리실산 및 메틸-자스모네이트 (methyl-jasmonate))을 키네틴 DMSO 내로 무균 첨가에 의해 이후 즉각적으로 만들어진다. 결과는 EMS 발현 배지이다 (표 4 참조). 다음으로 발현된 배양은 암소에서 115 rpm의 진탕기 상에서 15일 동안 유지된다. 다음으로 신선한 바이오매스가 수집되고, 마쇄되어 원심분리 되기 이전에 부흐너 깔대기 상에서 건조되며 또한 부유물은 냉동건조에 의해 안정화된다.

표 4는 EMS 배지, 즉 얼렌메이어 플라스크에서 현탁액으로 아르간 세포들의 발현 조건들 하의 배양에 사용되는 무라시지 & 스쿡 변형 배지를 나타낸 것이다.

HaCaT 각질세포들은 서로 다른 추출물들로 5시간 동안 처리된 다음, 세포들은 DMEM 배지로 37℃에서 배양된다. TGF-β1은 엘라이자 (ELISA) 키트를 사용하여 배양 부유물들에서 용량이 정해진다.

실시예 2a에 따라 제조된 미발현된 아르간 바이오매스 및 발현 이후에 획득된 아르간 바이오매스가 인간 HaCaT 각질세포들에서 TGF-β1의 합성에 미치는 효과들을 첨부된 도 1에 보여준다. 그들은 HaCaT 각질세포들에서 실시예 2a에 따라 제조된 미발현된 아르간 바이오매스 (50 μg/mL)가 TGF-β1의 합성을 48%로 촉진하는 한편, 발현된 아르간 바이오매스는 TGF-β1의 합성을 26%로 저해하는 것을 보여주고 있다.

실시예 9: 인간 각질세포들의 증식 및 세포 이동의 측정

실시예 9a: 인간 각질세포들의 세포 증식의 측정

상처들의 치유는 조직들의 정상적인 복구에서의 많은 국소적 및 전신적 인자들의 상호작용이 관여하는 복합적이고도 동적인 생물학적 공정이다. 치유의 진행은 네 가지의 상호의존적인 단계들을 포함한다: 항상성 (homeostasis), 염증, 증식 및 리모델링. 증식은 세 가지 분명하게 관찰가능한 공정들, 즉 입자생성 (granulation), 수축 (contraction) 및 재표피화 (reepithelialization)을 의미한다.

입자생성 동안, 복구 공정의 나머지 단계에 관여할 세포들의 증식이 이들 세포들의 상처의 기저부로의 이동과 함께 관찰된다. 이들 세포들은 대식세포들 (macrophages), 섬유모세포들 (fibroblasts) 및 내피세포들 (endothelial cells)을 포함한다. 대식세포들은 화학주성 (chemotactic) 인자들 및 성장인자들을 계속적으로 방출한다. 섬유모세포들은 상처의 바닥에서 세포들의 성장에 필요한 새로운 세포 기질을 구축한다. 본 스캐폴딩은 세포 이동을 용이하게 한다.

상처의 수축은 상처의 크기 감소를 위한 기작이고 섬유모세포들은 이러한 수축에서 선도적인 역할을 담당한다.

재표피화는 외부 환경에 대항하고 효과적인 장벽을 재형성하고 색소침착 되고 그의 감각적 및 면역 기능들을 회복할 수 있도록 상처를 덮고 있는 표피를 재생하는 것으로 구성된다. 따라서 이것은 각질세포 이동 및 증식 과정들 뿐만 아니라 이러한 신생-표피세포의 분화 및 진피와 표피를 재연결하는 기저 막의 회복을 의미한다. 상처의 중심으로 기본적인 세포들의 이동이 상처의 양쪽 면들을 봉합하는 것을 가능하게 할 때, 이동에 의해 남겨진 공간들을 채우고 삼차원적인 재생에서 표피 조직으로 세포들을 공급하도록 체세포 분열의 전달 (wave)이 일어난다.

각질 세포들, 섬유모세포들 및 내피세포들의 증식 단계들은 활성 성분의 치유 활성을 검증하는 기능적인 현상의 하나인 것으로 고려될 수 있다. 섬유모세포들 또는 내피세포들의 증식에서의 증가가 진피의 치유에 관여할 것인 한편, 각질세포들의 증식에서의 증가는 재표피화에 관여한다.

장치 및 방법들: 세포 증식

사용된 기법은 S기 세포들의 DNA 내로 뉴클레오타이드, 티민 유사체의 하나인 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrDU)의 도입을 측정한다.

수술 이후에 제거된 피부로부터 분리된 각질세포들은 완전 KSFM (BPE 25 μg/mL; EGF 1.5 mg/mL)에서 배양된다. 세포들은 평가될 분자들의 존재 시 5% CO₂로 대기 조건에서 37℃로 48시간 동안 배양된다.

세포 증식율에 비례적인 BrDU의 도입이 퍼옥시다제에 결합된 항-BrdU 항체들의 시스템에 의해 평가된다. 퍼옥시다제의 기질의 첨가는 발색 반응을 일으킨다 (바이오트랙 엘라이자 시스템 (Biotrak Elisa System)). 해당하는 흡광도 (DO)는 450 nm에서 측정된다. 따라서 본 데이타는 세포 증식율에 비례적이다.

다음으로 증식 백분율은 다음의 공식을 사용하여 결정된다:

증식% = [DO_(처리) - DO_{(대조군 최소)} / DO_{(대조군 최대)} - DO_{(대조군 최소)}] x 100

주석:

대조군_최소 = 최소 배지로 배양된 세포들

대조군_최대 = 완전 배지로 배양된 세포들

따라서, 대조군_최소는 0% 증식에 해당하고, 대조군_최대는 100% 증식에 해당한다.

세포 증식에 관한 결과들은 도 2에 나타나 있으며 실시예 2a에 따라 제조된 아르간 바이오매스의 인간 각질세포들의 증식에 미치는 효과를 설명하고 있다.

그들은 실시예 2a에 따라 제조된 아르간 바이오매스가 0.1 μg/mL에서 인간 각질세포들의 증식을 25%로 촉진하는 것을 보여준다. 바이오매스가 0.01 μg/mL에서 테스트될 때는 효과가 전혀 측정되지 않는다.

실시예 9b: 인간 각질세포들의 세포성 이동의 측정

장치 및 방법들: HaCaT 각질세포들의 세포 이동

세포 이동을 연구하는 데 사용되는 프로토콜은 96-웰 키트의 사용을 기초로 한다. 본 테스트의 원리는 웰 (96-웰 플레이트)의 중심으로 향한 세포들의 이동을 연구하는 것으로 구성된다. 이것을 성취하기 위하여, 각 웰의 중심에 정지기 (stopper)를 놓아두어 2 mm 직경 검출 영역을 만든다. 다음으로 HaCaT 세포들을 본 정지기 주변에 접종한다. 일단 세포들이 정기기들 주변의 표면에 잘 결합되면 정기기들은 당겨지고, 따라서 세포들은 검출 영역으로 이동할 수 있다. 정지기들이 없고 활성 성분들은 있는 플레이트들은 DMEM 0% SVF에서 37℃로 24시간 동안 배양된다. 다음으로 세포들의 이동을 평가하기 위하여 정기기가 위치하였던 영역에 위치하는 세포들의 양이 분석된다. 세포들은 획스트 33342 (Hoechst 33342)로 표시되고 탐침 (cache)이 본 영역에 위치하는 세포들만 관찰하고 계수하는 데 사용된다. 8개 웰들의 평균이 각 조건에 대해 작성된다.

결과들은

- 형광 강도로서 (IF - 이동되었던 세포들의 양에 비례적)

- 대조군 0% SVF에 상대적인 활성 백분율로서 표현된다.

[(IF_처리-IF₀ _%이동)/(IF_대조군0 _% _SVF-IF₀ _%이동)] x 100

주석:

IF_{(0% 이동)}은 정지기들을 포함하는 웰들의 IF (형광 강도)에 해당하고 따라서 기저 노이즈에 해당한다.

도 3은 세포 이동의 결과들을 보여주고, 실시예 2a에 따라 제조된 아르간 바이오매스의 HaCaT 각질세포들의 이동에 미치는 효과를 설명하고 있다.

그들은 실시예 2a에 따라 제조된 아르간 바이오매스가 0.01 또는 0.03 μg/mL에서 HaCaT 각질세포들의 이동을 각각 79% 및 73%로 촉진하는 것을 보여준다.

Claims

활성 성분으로서 탈분화되고 (dedifferentiated) 미발현된 (non-elicited) 아르간 (argan) 세포들의 시험관내 배양으로부터 유래한 조제물 및 미용적으로 허용가능한 부형제를 함께 포함하고, 상기 조제물은 배양 배지가 없는 세포 현탁액, 바이오매스 (biomass) 또는 마쇄된 바이오매스 형태로서 피부 노화 (skin aging) 및 피부 염증 (inflammation) 처치를 위한, 미용 조성물.
활성 성분으로서 탈분화되고 (dedifferentiated) 미발현된 (non-elicited) 아르간 (argan) 세포들의 시험관내 배양으로부터 유래한 조제물 및 피부과학적으로 허용가능한 부형제를 함께 포함하고, 상기 조제물은 배양 배지가 없는 세포 현탁액, 바이오매스 (biomass) 또는 마쇄된 바이오매스 형태로서 피부 노화 (skin aging) 및 피부 염증 (inflammation) 처치를 위한, 피부과학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조제물의 양은 상기 조성물의 전체 무게의 0.1 및 10% 사이의 범위인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 조제물의 양은 상기 조성물의 전체 무게의 0.1 및 10% 사이의 범위인 것을 특징으로 하는, 조성물.
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