BG67493B1 - Стандартизиран растителен екстракт от биомаса на инвитро култури, метод за неговото получаване и използване - Google Patents

Стандартизиран растителен екстракт от биомаса на инвитро култури, метод за неговото получаване и използване Download PDF

Info

Publication number
BG67493B1
BG67493B1 BG113104A BG11310420A BG67493B1 BG 67493 B1 BG67493 B1 BG 67493B1 BG 113104 A BG113104 A BG 113104A BG 11310420 A BG11310420 A BG 11310420A BG 67493 B1 BG67493 B1 BG 67493B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
extract
biomass
myconoside
vitro
standardized
Prior art date
Application number
BG113104A
Other languages
English (en)
Other versions
BG113104A (bg
Inventor
Васил Георгиев
Георгиев Георгиев Васил
Атанас Павлов
Иванов Павлов Атанас
Original Assignee
"Инова Бм" Оод
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by "Инова Бм" Оод filed Critical "Инова Бм" Оод
Priority to BG113104A priority Critical patent/BG67493B1/bg
Priority to US17/912,237 priority patent/US20230193331A1/en
Priority to MX2022010818A priority patent/MX2022010818A/es
Priority to KR1020227036339A priority patent/KR20220156887A/ko
Priority to CA3171701A priority patent/CA3171701A1/en
Priority to PCT/BG2020/000016 priority patent/WO2021184086A1/en
Priority to JP2022554456A priority patent/JP2023525203A/ja
Priority to IL296467A priority patent/IL296467A/en
Priority to EP20727574.4A priority patent/EP4121511A1/en
Priority to AU2020436453A priority patent/AU2020436453A1/en
Priority to BR112022015883A priority patent/BR112022015883A2/pt
Priority to CN202080097832.3A priority patent/CN115380105A/zh
Publication of BG113104A publication Critical patent/BG113104A/bg
Publication of BG67493B1 publication Critical patent/BG67493B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9789—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C12P7/20—Glycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/10—General cosmetic use

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до стандартизиран растителен екстракт от биомаса на инвитро култури от Haberlea rhodopensis Friv. (HR), съдържащ биологично активни вещества и техните първични и вторични метаболити, съдържащ в тегл. %, както следва: органични киселини от 4.0 до 6.0, мастни киселини от 0.5 до 1.5, аминокиселини от 8.0 до 12.0, стероли от 0.5 до 1.0, свободни феноли от 3.0 до 6.0, захари от 45 до 55 и полифеноли от 25.0 до 35.0 с преобладаващо съдържание на миконозид от 70% до 96% в полифенолната фракция, съставляващо от 18% до 35% в общия екстракт и до състав, съдържащ стандартизирания екстракт и глицерол, както и до метод за получаването на стандартизирания екстракт. Методът съгласно настоящото изобретение с неговите оптимално подбрани стъпки, специфични условия, параметри, като температура, време, разбъркване, светлина, растежни фактори и др. постига освен максимална обемна продуктивност на целевите вещества и миконозид, така и стабилна продуктивност на растителните инвитро култури и представлява надеждна продуктивна непрекъсната 24/7 система за продуциране на НR. Елиминирана е зависимостта от природните фактори, ограничената наличност и защитеност на редките му диви растителни популации. Избегнати са и ограниченията на сезонността и бавния растеж на HR, като е разработен възобновяем, екологично чист метод. Разработеният метод осигурява алтернативни, възобновяеми и устойчиви източници на растителна суровина, необходима за получаването на целевия екстракт. Полученият стандартизиран екстракт по миконозид го прави особено ценен със защитното му въздействие върху здравето на човека, както и успешното му използване с неговите фармакологични, козметични ефекти и във функционалното хранене.

Description

Област на техниката
Изобретението се отнася до стандартизиран растителен екстракт, по-специално от биомаса на инвитро култури, съдържащ ценни биологично-активни вещества (БАВ) и вторични метаболити, който да намери приложение за изготвяне на средства с приложение във фармацията, козметиката и в хранителновкусовата промишленост, както и до метод за неговото получаване.
Предшестващо състояние на техниката
Растенията в природата съдържат огромно разнообразие от БАВ, като в зависимост от техния произход, условия на растеж, време на прибиране на реколтата, технологията на извличане и др., се повлиява и качеството на продукта.
Култивираните лечебни растения имат редица предимства пред дивите растения. Те могат да бъдат наблюдавани и събирани в най-подходящия период, както и се избягва близостта им с други неподходящи растителни видове.
Растителният род Haberlea е монотипен род с единствен представител вида Н. rhodopensis Friv. (Родопски силивряк), за краткост (HR). Растението е древен Терциерен реликт, разпространен само в Централна и Южна България в Стара планина и Родопите, а и в североизточната част на Гърция - Родопи, планината Пангеон и планината Фалакро. Н. rhodopensis традиционно се използва в етнофармацията и местната традиционна медицина от векове [1].
Известно е също изолирането на растителни екстракти от листа на HR. Изолираните биосъединения от растителните екстракти са източник на незаменими природни съставки. Полифенолите, гликозидите, захарите и др. са широко разпространени освен в плодовете, зеленчуците и в растенията и имат голямо значение поради физиологичните си функции за здравето на хората.
Известен е етанолен екстракт от HR, получен при изсушаване на цялото растение посредством разпрашаване, последвано от екстрахиране с етанол в продължение на 3 h при разбъркване на стайна температура, филтруване, отделяне на неразтворимите вещества, последвано от концентриране под вакуум и сушене чрез лиофилизация до получаване на екстракт. От същия източник е известен и воден екстракт на HR, при който цялото растение се изсушава чрез разпрашаване, екстрахира се с гореща до 120°С стерилизирана вода за 20 min в автоклав, следва отделяне чрез филтрация при поддържане на висока температура на неразтворимия материал и лиофилизане. Получените екстракти притежават анти-стареещ, антиоксидантен, избелващ и имуностимулиращ ефект [5].
Има данни за екстракт на HR, получен при екстракция с водно-алкохолен разтвор (етанол/вода, без да е описан метода за получаването му) и пречистен с гелна хроматография върху Sephadex LH-20, съдържащ изолирана фракция, която е особено богата на фенилетаноидния гликозид - миконозид, отговорен за биоактивността на Haberlea екстракти. Наблюдавана е ефективността на екстракта в същия източник и е докладвано, че миконозидът стимулира антиоксидантната защита на кожата, подобрява еластичността й посредством стимулиране на синтезата на външно клетъчни структурни и притежава цитопротективни и UV-защитни ефекти, служи като средство против стареене на кожата, като я предпазва от окисляване, повишава еластичността й, засилва нейния блясък и притежава потенциал за прилагане в козметиката [3].
Известен е също фитохимичен състав на 70% етанолен екстракт от листа на HR, съдържащ голяма група основни биоактивни съединения в т. ч и вторични метаболити, като: фенолни киселини, флавоноиди, мастни киселини, фитостероли, каротеноиди, разтворими липиди, олиго и полизахариди, свободни захари, полиоли, органични киселини, в т. ч миконозид с доказани антиоксидантен и хепатопротекивен ефекти [1].
Известен е още и фитохимичният профил на метанолен екстракт от листа на HR, получен посредством използване на комбинация от течно/течна екстракция, препаративна и полу-препаративна HPLC, който съдържа два фенолни гликозида - миконозид и пауцифлозид. Фракцията, богата на миконозид (кафеоил фенилетаноиден гликозид) е с потенциална роля за оцеляване на растението и притежава антиоксидантна активност, поради присъствието на кофеоил и две свободни хидроксилни групи от фениловия си пръстен. Основните групи БАВ и вторичните метаболити, открити в различни екстракти на HR по време на нормалния растеж и по време на сухия период на растението са органични киселини, мастни киселини, аминокиселини, фенолни киселини и захари [4].
В наши дни екстрактите на HR, получени директно от природния растителен вид успешно се прилагат в козметиката, хомеопатията и фармацията, поради доказаното им антимикробно, антивирусно, антиоксидантно, имуномодулиращо, цитотоксично, противораково, химиопротективно, генопротективно и радиопротективно действие.
От друга страна растителният вид HR е особено ценен и рядък ендемичен вид и като такъв е сред забранените видове за колекциониране от природата. През последните години например са създадени ин витро системи за регенерация и микро размножаване на HR, с които тези редки растения биха могли да запазят своите естествени популации. Създадена е инвитро банка от HR растения от различни локации. В същия източник е описан и ефективен метод за регенерация и микроразмножаване, при който семената на растителния вид се подлагат на стерилизация с 70% ЕЮН за 1 min, третиране с хипохлорид за 6-10 min и 3-5 min с 0.1% HgCI2 и трикратни изплаквания с дестилирана вода, а получените стерилни семена HR се поставят на класическа среда MS (както и MS В5, WPM) без добавяне на хормони за 3-4 месеца за прорастване и получаване на разсад. След субкултивиране на растителните клъстери са получени инвитро системи за 1-1,5 месеца до напълно развити растения с готовност за трансформиране за 6-7 месеца при нестерилни условия в контролирана парникова среда [2].
Същевременно, биотехнологията на растенията, по-специално култивирането на растителните клетки ин витро се превръща в обещаващ инструмент за устойчиво и непрекъснато производство на БАВ от растения. Принципите на създаване на растителни клетъчни култури и размножаване на растителни клетки в твърда и в течна среда за култивиране, както и общите процеси, свързани с установяване и култивиране на растителни клетки, са описани за други, различни от HR растителни видове.
Получени са отделни екстракти от растителни клетъчни култури на Rosa sp., съдържащи ценни натурални (природни) продукти (НП) за козметична употреба при кожа и коса за предотвратяване на признаци на стареене съгл. [6].
Растителна клетъчна биомаса се използва за производството на фенилпропаноиди от Ajuga repens и вербаскозид от Olea europea, Syringa vulgaris или Appia citobara, както и производството на екстракт, стандартизиран по отношение съдържанието на вербаскозиди от клетъчни култури на Syringa vulgaris с доказана антиоксидантна активност, предназначен за лечение на акне и за предотвратяване на косопад, съгл. [7].
Получен е също и препарат под формата на екстракт от инвитро култура от Арганово дърво (Argania spinosa), предназначен за използване при лечение на стареене на кожата и възпаление на кожата, съгл. [8].
Стандартизиран екстракт, получен от инвитро недиференцирани растителни клетки на Dracocephalum ruyschiana, съдържащ БАВ с доказана антирадикална активност и приложение в козметиката за защита и регенериране на кожата, където са получени размножени ин-витро недиференцирани клетки на Dracocephalum ruyschiana, отгледани на полутвърда или течна среда на тъмно или на светлинен фотопериод за 14-16 h с отделяне на клетъчната биомаса, последвано от екстракция на получената клетъчна биомаса с етанол или етанол, глицерол и вода в съотношения от 20:20:60 към 50:50:0 (обем/обем), сушене на клетъчната маса и допълнителна екстракция със същия екстрагент, съгл. [9].
Засега не се съобщава за екстракт, получен от биомаса от инвитро култури на HR, с неговите БАВ и вторични метаболити.
Въпреки това, общите принципи за култивиране на растителни клетки не са приложими за широкомащабно размножаване на клетки за производствени цели и трябва да се разработят специфични технологични процеси. За поддържане на растителните инвитро култури (диференцирани или недиференцирани) при условията на инвитро култивиране, е важно да се определи оптималното съотношение на растежните регулатори (ауксини, цитокинини и гиберелини), което е строго специфично, както и да се дефинира за всяка клетъчна линия (всеки вид растение). Промените в условията на култивиране на клетките, както и използването на елиситори, предшественици и абсорбционни матрици, са от решаващо значение за производството на специфични биологично активни съединения/метаболити и са специфични за използваните растителни видове, както и за желаните целеви съединения.
Синтезата, обаче на ценни БАВ и метаболитни съставки в инвитро култура е сложен процес с много неизвестни параметри. Натрупването на природните съставки и вторичните метаболити в клетъчната биомаса е резултат от динамичния баланс между биосинтеза, биотрансформация и биодеградивни процеси. Важен е подборът на подходящите и оптимални условия - хранителна среда и стимулиращи фактори за всяка съставка, присъща на интактното растение.
Често природните продукти, получени от традиционните екстракти са с недостатъчна хомогенност, както и количествата на целевите лечебни съставки варират сезонно и географски в сравнение с тези, получени от инвитро културите.
Също така, от особена важност за целите на получаване на екстракт от биомасата на инвитро култури и неговото включване в продукти за козметиката, фармацията и хранителната индустрия е да се работи със стандартизирани суровини.
Проблемът на настоящото изобретение е да се получи стандартизиран екстракт, по-специално екстракт от инвитро култури (прорастъци, меристемни (шутови) култури, коренови култури (нормални, добавъчни и трансформирани корени), соматични ембриони, калусни култури, клетъчни суспензионни култури) на HR, който да е с гарантирано по количество съдържание на фенилетаноидния глюкозид миконозид, при константни физикохимични характеристики и състав на останалите съпътстващи ценни
БАВ компоненти, които същевременно да са получени по максимално ефективен дизайн на метод на биосинтеза.
Техническа същност на изобретението
Този проблем, съгласно настоящото изобретение се решава посредством стандартизиран растителен екстракт, по-специално екстракт от биомаса на инвитро култури (прорастъци, меристемни (шутови) култури, коренови култури (нормални, добавъчни и трансформирани корени), соматични ембриони, калусни култури, клетъчни суспензионни култури) на HR, съдържащ БАВ в т. ч. и техните вторични и първични растителни метаболити - мастни киселини, стероли, органични киселини, аминокиселини, свободни фенолни киселини и захари. Количеството на БАВ в екстракта е съответно в тегл. %: за мастни к-ни 0.5 до 1.5, стероли от 0.5 до 1.0, органични киселини от 4.0 до 6.0, за аминокиселини от 8.0 до 12.0, свободни феноли от 3.0 до 6.0 и захари от 45.0 до 55.0 и полифенолни съединения от 25,0 до 35,0 %, съдържащи фенилетаноиден гликозид - миконозид, който съставлява между 70 и 96% от полифенолната фракция. Полученият екстракт от биомасата на инвитро култури от HR е богат на миконозид и стандартизиран по него, чието количество в екстракта е в границите от 18% до 35% от тоталния екстракт. Чрез разтваряне на стандартизирания екстракт в глицерол се получава състав на продукт с контролирано съдържание на миконозид от 0.01 до 15,00% според потребностите на съответната индустрия фармацевтична, хранителна и козметична индустрия.
Описаният стандартизиран екстракт от инвитро култури съгласно настоящото изобретение е получен по метод, включващ следните основни стъпки:
1) Получаване на инвитро култури от HR, където се извършва:
- избор на експлант от отделна част или орган от растението, по-специално от листа, стебло, хипокотил, корен, семена, антери, плодници, чашелистчета, семепъпки;
- повърхностна стерилизация на избраният експлант посредством неколкократно измиване със стерилна дестилирана вода за 1-240 min, обработка с 40-85% етанол за 10-190 s, последваща обработка с 2-10% дезинфектант за 10-60 min с или без добавен към тях детергент, промиване със стерилна дестилирана вода и подсушаване за 1-20 min;
- иницииране на получените стерилни експланти върху полутвърди или течни хранителни среди с или без добавени растежни регулатори и култивиране при 18-32°С на фото режим - тъмно или режим светло/тъмно за всеки от тях за 8-16 h и pH на средата от 5.0 до 6,2 до получаване на 85-100% диференцирани или недиференцирани култури (прорастъци, меристемни култури, коренови култури, соматични ембриони, калусни култури, клетъчни суспензионни култури) за период 2-5 седмици. Пренасяне на получените инициирани инвитро култури за самостоятелно култивиране върху полутвърди хранителни среди с или без добавени растежни регулатори и с или без добавени редуциращи агенти и/или антиоксиданти при 18-32°С на същия фото режим за 15-45 дни до получаване на между 5-30% селектирани свръх продуктивни по отношение на натрупването на миконозид и морфологично стабилни линии от общия брой генерирани ин-витро линии и поддържане на селектираните инвитро линии чрез периодично препосяване върху свежа полутвърда хранителна среда с или без добавени растежни регулатори за 20 до 35 дни.
2) Получаване на биомаса:
- пренасяне за култивиране на получените високопродуктивни линии в стерилна течна хранителна среда с добавени: въглероден източник, растежни регулатори, антиоксиданти до получаване на 70-100% адаптирани клетъчни линии, т. н. посевен материал към условията на дълбочинно култивиране;
- инокулулиране в течна среда на получения посевен материал и неговото култивиране отново при 18-32°С на същия фото режим в колби, в биореактори или в системи с временно разбъркване при режим на разбъркване за 1-30 min и покой от 1 до 12 h за период 1-6 седмици до достигане на контролно съдържание на миконозид в биомасата не по-малко от 80 mg/g за суха биомаса, последвало от добавяне на фактори за повишаване продукцията на вторични растителни метаболити, избрани от: елиситори, подхранване със свежа хранителна среда, добавяне на предшественици, включване на втора фаза в култивационната система за улавяне на секретираните вторични метаболити или тяхна комбинация, за период 3-15 дни до получаване на обогатена на миконозид биомаса (не по-малко от 100 mg/g суха биомаса);
- отделяне на обогатената биомаса от културалната течност и нейното сушене при 20-80°С или се лиофилизира с добив суха биомаса не по-нисък от 10-15g/l и в даден случай сушене на получената културална течност посредством вакуум изпаряване при 30-70°С или лиофилизиране с добив на суха маса не по-нисък от 15-30 g/l;
3) Получаване на екстракт от биомаса на инвитро култури от HR:
- смесване и хомогенизиране на получената изсушена биомаса, в даден случай и с културалната течност в дезинтегратор;
- мацерация на сухата смес с 30-80% етанол за 16-72 h, при температура 18-45°С с или без помощта на ултразвук;
- филтриране на получената смес и отделяне на утайката, събиране и сушене на филтрата под вакуум при температура 30-70°С до получаване на гъста течност (екстракт), съдържаща влага 10-30% и съдържание на миконозид (не по-малко от 150 g/kg) в екстракта; и
- разтваряне на получения изсушен стандартизиран екстракт с добавяне на глицерол и разбъркване до пълно хомогенизиране. Полученият разтвор е с контролирано съдържание на миконозид от 0.01% до 15.00%, съгласно потребностите на съответната индустрия - фармацевтична, хранителна и козметична.
Подходящи хранителни среди са стандартни полутвърди и течни варианти, избрани от: MS (Murashige and Skoog), WP (McCown Woody Plant), LS (Linsmaierand Skoog), Gamborg B5, Heller, Nitsch, Schenk и White или c модификациран състав на макросолите, микросолите и витамините. За нуждите на екстракта, средите са модифицирани допълнително чрез добавяне на въглероден източник, като захароза и/или глюкоза (от 1% до 9%), активен въглен 0-5%, редуциращ агент като 2-Mercaptoethanol и/или Dithiothreitol, в концентрации от 0 до 10 mg/l, антиоксиданти, като аскорбинова киселина и/или лимонена киселина от 0 до 10 mg/l, желиращ агент - агар-агар или джелрит в концентрации от 0.1% до 10%.
Основните растежни регулатори са избрани от ауксини (picloram и α-naphtalene acetic acid), цитокинините (kinetin и 6-benzylaminopurine) и/или гиберелини в концентрации от 0-20 mg/l. Като ауксини е възможно да се използват picloram и/или α-naphtalene acetic acid, като цитокинини - kinetin и/или 6benzylaminopurine, като гиберелини са използвани Gibberellic acid 4+7 и/или Gibberellic acid А3. Други възможни ауксини са: lndole-3-acetic acid, lndole-3-butyric acid, Dicamba, p-Chlorophenoxyacetic acid и βBG 67493 B1
Naphtoxyacetic acid), цитокинини: 2-iP, 4-CPPU, 6-benzylaminopurine riboside, Dihydrozeatin, Zeatin, Metatropoline и Thidiazuron) и гиберилини: Gibberellic acid.
Използваните елиситори са избрани от: биотични, като полизахариди или хитозан; или абиотични, като метил жасмонат, жасмонова киселина, абсцисова киселина или с физичен фактор (осмотични агенти, УВ светлина), които добавени в изключително ниски концентрации, служат като сигнали за стимулиране на вторичния метаболизъм на растителната клетка или с подхранване със свежа хранителна среда, или добавяне на предшественици (аминокиселини и захари), или чрез включване на втора фаза (активен въглен или абсорбционна смола) в култивационната система за улавяне на секретираните вторични метаболити.
Култивирането за растежа на диференцирани и недиференцирани растителни култури в инвитро условия се извършва съответно:
- в биореактори за дълбочинно култивиране с механично (stirred tank) и пневматично (bubble column) разбъркване при контролирани условия и строго поддържан микроклимат, оптимални за растежа на растителните култури в инвитро условия; или
- в системи с временно разбъркване при полуавтоматизирани асептични системи с контролирани условия и строго поддържан микроклимат, оптимални за растежа на диференцирани растителни култури в инвитро условия. Осигурява се краткотраен контролиран контакт на растителния материал с хранителната среда, за контролирано време при временно разбъркване с въздушно, гравитационно или механично предвижване на течната фаза. Използвани са системи като PLANTFORM, PLANTIMA, RALM, RITA, SETIS или техни аналози;
- в колби на ротационна клатачка при обороти от 80-150 rpm.
Полученият екстракт от биомаса, продуцирана от инвитро култури на HR съдържа целевите биоактивни вещества, богат е на захари, които достигат до 55% от сместа, както и аминокиселини до 12% и полифенолни съединения до 35%, съдържащи 70-96% миконозид, което прави екстракта изключително ценен.
Стандартизацията на екстракта по фенилетаноидния глюкозид - миконозид го прави особено ценен със защитното му въздействие върху здравето на човека, както и успешното му използване с неговите фармакологични, козметични ефекти и във функционалното хранене. Антиоксидантният ефект на миконозида допълнително обуславя използването му в козметиката, като средство против стареене на кожата, против бръчки, петна и други.
Разработеният метод за получаване на екстракта съгласно настоящото изобретение с неговите оптимално подбрани стъпки, специфични условия, параметри, като температура, време, разбъркване, светлина, растежни фактори и др. постига освен максимална обемна продуктивност на целевите вещества и миконозид, така и стабилна продуктивност на растителните инвитро култури и представлява надеждна продуктивна непрекъсната 24/7 система за продуциране на НП.
Елиминирана е зависимостта от природните фактори, ограничената наличност и защитеност на редките му диви растителни популации. Избегнати са и ограниченията на сезонността и бавния растеж на HR, като е разработен възобновяем, екологично чист метод. Разработеният метод осигурява алтернативни, възобновяеми и устойчиви източници на растителна суровина, необходима за получаването на целевия екстракт.
Осигурена е възможност за еднородност на партидата на крайния НП, както и за постоянно качество и гарантиране на стандартизиран по миконозид екстракт от инвитро култури на HR.
Освен това, използваните подходящи среди за култивиране, заедно с включените към тях оптимални нива на растежните фактори и стимулиращи агенти, водят до успешното образуване на инвитро култури (прорастъци, меристемни култури, коренови култури, соматични ембриони, калусни култури, клетъчни суспензионни култури) и генериране на биомаса, съдържаща целевите ценни БАВ. Получените култури имат значителна способност за мащабиране на процеса на тяхното култивиране в рамките на индустриално значимите биореактори и системи с временно разбъркване, предназначени да увеличат максимално добива и съдържанието на биосинтезираните НП.
Видът и концентрацията на използваните стимулиращи агенти (елиситори, предшественици и абсорбционни фази), възрастта и стадия на развитие на инвитро културата в момента на извличане са особено важни фактори, които са оптимизирани и допринасят за постигането на високите нива на бисинтез и акумулация на НП с особено сложна молекулна структура при използвания метод.
Елиминирана е опасността от микробна контаминация, както и попадането на биологичен материал от други растителни, гъбни, плесенни, микробни или животински видове в произведената инвитро растителна биомаса и получения екстракт. Всичко това прави екстракта с неговия природоидентичен химичен състав, съдържащ разнообразни и ценни БАВ съединения, както и използвания метод, получаващ максимален добив на биомаса и екстракт предпочитани и особено подходящи за стандартизиране по фенилетаноидния гликозид и тяхното прилагане в хранителната, козметичната и лекарствената индустрия.
Примери за изпълнение на изобретението
Настоящото изобретение се илюстрира, без да се ограничава от следните примери:
Пример 1
Получаване на инвитро култури от HR:
1.1. Измиване
Семена 10 до 50 броя от HR с размери 0.6 mm х 0.1 mm се измиват двукратно, за 30-60 min в стерилна дестилирана вода с добавен гиберелини 0.5 mg/l, обработват се със 70% етанол за 100 s и с 8% калциев хипохлорид за 50 min, последвано от двукратно промиване със стерилна дестилирана вода за 5-10 min, подсушаване на получените стерилни семена върху стерилна филтърна хартия за 10-15 min.
1.2. Инициране
Получените стерилни семена се оценяват за качество и морфология, отстраняват се мъртвите и морфологично изменени индивиди и се пренасят за инициране върху агаризирана, предварително стерилизирана при 121°С за 30 min стандартна MS хранителна среда с добавена 5% захароза и агар-агар 5%, pH 6.0, като се култивират в термостат при температура 28°С ± 2°С на тъмно за период от 2 седмици, като се следи за асептичност до образуване от семената на прорастъци между 95-100%.
1.3. Самостоятелно култивиране
Получените прорастъчни инвитро култури са готови за самостоятелно култивиране върху агаризирана MS хранителна среди с добавена 5% захароза и агар-агар 5%, при pH 6.0. Култивиране в термостат при 28± 2°С на режим светло/тъмно за 12 h за 30-35 дни до получаване на морфологично стабилни линии - свръхпродуценти на миконозид, чрез периодично определяне количеството на продуцирания в културите миконозид и селектиране на 25% високопродуктивни линии от общия брой на генерираните инвитро линии.
2) . Получаване на биомаса:
2.1. Поддържане, адаптиране - субкултивиране на селектираните инвитро прорастъчни линии.
Избраните линии се поддържат - чрез периодично препосяване на всеки 30 дни, върху свежа полутвърда хранителна среда, същата както етап 1.3, като се следи за настъпили изменения в морфология и стабилност и се анализира количеството на миконозид. Взема се биомаса 10 g от високопродуктивните линии и се подлагат на култивиране в стерилна течна MS среда със същите добавки и pH в колба от 2000 ml на ротационна клатачка при обороти от 140 rpm, следи се за промени в морфологията, растежа, хомогенността, стабилността и количеството на миконозида, най-адаптивните линии, които са от 95-100% продължават за следващото дълбочинно култивиране, като посевен материал.
2.2. Култивиране на адаптираните инвитро меристемни линии, за производство на биомаса.
Взема се 25 g свежо тегло/l течна култура, намираща се в експоненциална фаза на развитие на възраст от 20 дни, култивира се при температура 28°С на светло/тъмно за 12 h за 5 седмици в система с временно разбъркване при период на разбъркване от 25 min и период на покой 6 h. Получават се от 180 g свежа биомаса на литър при съдържанието на миконозид в получената биомаса 105 mg/g суха биомаса;
2.3. Активиране продукцията на биомасата
Към развитата биомаса, намираща се в късна експоненциална фаза на развитие (на възраст от 20 до 40 дни), асептично са добавени абиотични елиситори jasmonic acid и methyl jasmonate в концентрация от 5 mg/l и се култивира при гореописаните условия за 12 дни. В края на процеса се получава обогатена биомаса със съдържание на миконозид 152 mg/g суха биомаса. Отделяне на получената биомаса от културалната течност чрез филтруване през стерилна мрежа, следва промиване със стерилна дестилирана вода и сушене във вентилационна сушилня при 60°С. Полученият добив е 15 g суха биомаса за литър. Качеството на получената биомаса на всяка партида се следи по отношение съдържанието на миконозид и фенолни съединения.
Културалната течност се събира и се изсушава до суха на вакуум изпарител при 60°С. Полученият добив е от 30 g/l суха маса.
Сравнителни HPLC профили за съдържанието на миконозид в биомаса на инвитро култура от HR (А), биомаса от диворастящо растение (В) и биомаса на инвитро прорастъчна култура от HR (С) са представени на фигура 1.
3) Получаване на екстракт от инвитро биомаса от прорастъчна култура на HR, стандартизиран по миконозид:
Получените суха биомаса и културална течност се смесват и хомогенизират в дезинтегратор. За целта се използват 2 kg суха биомаса и 2.5 kg суха културална течност (получени от 200 I дълбочинна инвитро прорастъчна култура). Добавя се водно-етанолна смес 70% етанол при хидромодул 20 (тегло към обем) за 35 h, при 40°С с помощта на ултразвук в продължение на 15 min на всеки 4 h, получената утайка се отделя чрез вакуум филтрация и филтратът се събира и изсушава посредством вакуум изпаряване на 40°С до получаване на гъста течност, съдържаща 12% влага.
Получава се 1 kg екстракт от биомаса на инвитро меристемна култура от HR, съдържаща миконозид 208 g/kg.
Полученият екстракт е охарактеризиран фитохимично, резултатите са представени в таблица 1. Количеството на миконозида, както и съдържанието на фенолни съединения, мастни киселини, органични киселини, амино киселини, захари и стероли се следи с HPLC и GC/MS методи.
HPLC съдържание на миконозид в екстракт от биомаса на инвитро културата от HR, получена по описания пример 1 и сравнена със стандартен 70% етанолов екстракт от HR от растения, растящи в природния си хабитат, както и със стандартен 70% етанолов екстракт от биомаса на инвитро прорастъчна култура от HR са представени в таблица 2.
3.1. Разтваряне на получения екстракт от инвитро култура на HR по отношение съдържанието на миконозид.
Към 240,4 g от така получения екстракт, съдържащ миконозид 208 g/kg се добавят 759,6 g глицерол до достигане на 1 kg екстракт, съдържащ 5% миконозид. Получената смес се разбърква до пълното хомогенизиране на екстракта чрез използване на вибрационна бъркалка. Полученият разтвор се опакова в стерилни опаковки и съхранява за целите на неговото използване в козметични продукти, фармацевтични препарати или хранителни добавки. За целите на козметиката н-р стандартизираният екстракт от инвитро култури на HR е подходящ в количество от 0,1 до 15% за продукти под формата на крем, емулсия, гел и др.
В таблиза 3, също така е представен сравнителен анализ на антиксидантните свойства на екстракт от инвитро култури на HR, получен съгласно пример 1 в сравнение със стандартния 70% етанолен екстракт от растения HR, растящи в природата. Оценена е способността на получения екстракт да улавя свободните DPPH и ABTS радикали, както и способността му да редуцира медните (II) и железните (III) йони.
Таблица 1:
Фитохимичен състав на екстракт от биомаса на инвитро културата от HR, получен съгл. пример 1/GC/MS и HPLC методи в % тегл.
Мастни киселини 1.10
Стероли 0.93
Органични киселини 5.06
Аминокиселини 9.91
Свободни фенолни киселини 0.47
Захари 53.50
Полифеноли 2823
BG 67493 Bl
Апарат Agilent Technology Hewlett Packard 7890 A+/MSD 5975 (Hewlett Packard, Palo Alto, CA, US), свързан c масспектрометър Agilent Technology 5975C inert XL EI/CI MSD (Hewlett Packard, Palo Alto, CA, US). Колона HP-5MS (30 m x 250 pm x 0.25 pm) при температурна програма от 60°С за 2 min, покачване до 260°С със стъпка 5°С за минута и задържане на 260°С за 8 min. Обемът на инжектираната проба е 1 pl, при съотношение на смесване от 10:1. Температура на ижектора 250°С с поток, носещ газ (хелий) от 1 mL/min. EI/MS спектърът е записван при 70 eV.
HPLC система, Waters 1525 Binary pump (Waters, Milford, MA, USA), Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector (Waters, Milford, MA, USA), управлявана от Breeze 3.30 софтуер; Колона Supelco Discovery HS C18 (5 pm, 25 cm x 4,6 mm), 128°C; подвижна фаза c градиент на 2% оцетна киселина и ацетонитрил;
Таблица 2:
Фитохимичен HPLC сравнигтелен анализ фенилетаноиден глюкозид-миконозид.
екстр&кг от HR съгл. пример. 1 тд/ЮОд екстракт стандартен 70¾ етанолов екстракт от HR / тдИ Мд свежо тегло растение от природата стандартен 70¾ етанолов екстракт от биомаса на инвитро култура от HR съгл. пример 1; mg/WOg свежа биомаса
Myconoside 20863,00 1249,61 2053,93
BG 67493 Bl
Пример 2
Методът се провежда както пример 1, с тази разлика, че се обработват листа на HR вместо семена, а като инвитро култура се получават и използват коренови култури, като култивирането се извършва в колонен биореактор с пневматично разбъркване (bubble column), повишаването на биосинтеза се осъществява с подхранване, вместо с елиситиране и полученият екстракт съдържа само натрупаната биомаса без културална течност.
1) Получаване на инвитро култури от HR:
1.1. Измиване
Млади листа 3 до 10 броя от HR с размери 2-5 cm се измиват за 3 min в стерилна дестилирана вода с добавен детергент (Tween 80), след което се обработват с 80% етанол за 60 s и с 6% калциев хипохлорид за 30 min, последвано от трикратно промиване със стерилна дестилирана вода за 3 min и се подсушават на стерилна филтърна хартия за 2 min.
1.2. Инициране
Стерилните листа се обработват, като се изрязват и отстраняват мъртвите участъци. Листата се нарязват на сегменти от по 0,5 до 1,0 cm и се иницират върху полутвърда, предварително стерилизирана при 121°С за 30 min стандартна В5 хранителна среда с добавена 4% захароза и 8 mg/1 picloram, джелрит 3% и допълнително добавени 5 mg/1 аскорбинова киселина и 5 mg/1 - 2-Mercaptoethanol pH 5.5, като се култивират при температура 24°С ± 2°С на тъмно за 4 седмици, като се следи за асептичност до образуване от листата на коренови култури при 90% от експлантите.
1.3. Самостоятелно култивиране
Получените инвитро култури от добавъчни корени се култивират самостоятелно върху същата среда от примера, етап 1.2 с добавен към нея 3 g/Ι активен въглен в термостат при 24°С на тъмно за 37 дни до получаване на морфологично стабилни линии-свръхпродуценти на миконозид, като са селектирани 15% високопродуктивни линии от общия брой на генерираните инвитро линии.
2) Получаване на биомаса
2.1. Поддържане, адаптиране на селектираните инвитро коренови култури.
Избраните линии коренови култури се поддържат - чрез периодично прекосяване на всеки 37 дни върху полутвърда свежа среда от примера на етап 1.3, следи се за настъпили изменения в морфологията и стабилност и се определя количеството на миконозид. Взема се 15 g биомаса от високопродуктивните линии и се подлагат на култивиране в стерилна течна В5 среда със същите добавки от примера на етап 1.3 в колба от 500 ml на ротационна клатачка при обороти от 100 rpm и 85% от най-адаптивните линии продължават за следващото дълбочинно култивиране, като посевен материал.
2.2. Култивиране на адаптираните инвитро коренови култури за производство на биомаса.
Работи се с 30 g свежо тегло/l коренова култура, намираща се в експоненциална фаза на развитие на възраст от 30 дни, култивира се на течна В5 среда със същите добавки от примера на етап 1.3, при температура 24°С ± 2 на тъмно за 4 седмици в колонен биореактор с пневматично разбъркване (bubble column), при дебит на аериращия въздух от 0,3 l/l/min. Получават се от 130 g/l свежа биомаса на литър при съдържание на миконозид в получената биомаса 120 mg/g суха биомаса.
2.3. Активиране продукцията на биомасата
Към развитата биомаса, намираща се в късна експоненциална фаза на развитие (на възраст 35 дни), асептично се извършва подхранване със свежа течна В5 хранителна среда до запълване на работния обем на биореактора и се култивира при гореописаните условия за период от 10 до 15 дни. В края на процеса се получава обогатена биомаса със съдържание на миконозид 170 mg/g суха биомаса. Получената биомаса се отделя от културалната течност чрез филтруване, промива се и се подлага на сушене. Полученият добив е 12 g суха биомаса за литър.
3) Получаване на екстракт от инвитро биомаса от коренова култура на HR, стандартизиран по миконозид.
kg от получената изсушена биомаса от култивираната инвитро коренова култура се смила и екстрахира посредством мацерация с 80% водно-етанолна смес при хидромодул 40 (тегло към обем) за същото време и температура съгл. пример 1, с тази разлика, че се провежда без ултразвук до получаване гъста течност, съдържаща влага 15%. Получава се 500 g екстракт от биомаса на инвитро коренова култура от HR, съдържаща миконозид 280 mg/g.
3.1. Разтваряне на полученият екстракт от инвитро коренова култура на HR по отношение съдържанието на миконозид.
В съд се претеглят 357,1 g от така получения богат на миконозид екстракт от инвитро коренова култура на HR. Към него се добавят 642,9 g глицерол до достигане на желаното тегло от 1 kg екстракт, съдържащ 10% миконозид. Получената смес се разбърква до пълното хомогенизиране на екстракта чрез използване на ултразвук, опакова се в стерилни опаковки и се съхранява за целите на неговото използване.
Пример 3
Провежда се както пример 1, с тази разлика, че се обработват плодници, вместо семена, а като инвитро култура се получават и използват калусни и клетъчни суспензионни култури, вместо прорастъчни култури, а култивирането се извършва в ерленмайерови колби.
1) Получаване на инвитро калусни култури от HR
1.1. Измиване
Новосформирани плодници 2 до 5 броя от HR с размери 0,2-0,5 cm се измиват за 1-2 min в стерилна дестилирана вода, след което се обработват със 70% етанол за 90 s и с 10% Натриев хипохлорит за 40 min, последвано от промиване със стерилна дестилирана вода за 1min и се подсушават на стерилна филтърна хартия за 1min.
1.2. Инициране
Получените стерилни плодници се обработват, като се срязват хоризонтално наполовина и се пренасят за инициране върху полутвърда, предварително стерилизирана при 121 °С за 30 min стандартна WP хранителна среда, с добавена 2% захароза, 1 mg/l 1-naphtalene acetic acid, 1 mg/l 6-benzylaminopurine и агар-агар 4%, pH 5, като се култивират при температура 26°С ± 2°С на тъмно за 3 седмици, като се следи за асептичност до образуването на калусни култури при 93% от експлантите.
1.3. Самостоятелно култивиране
Получените инвитро калусни култури са готови за самостоятелно култивиране в термостат върху същата от примера среда, етап 1.2 с добавени citric acid от 3 mg/L и активен въглен 1 g/l при същата температура на тъмно 27 дни до получаване на морфологично стабилни линии-свръхпродуценти на миконозид, като са селектирани 11% високопродуктивни линии от общия брой на генерираните инвитро линии.
2. Получаване на биомаса
2.1. Поддържане, адаптиране на селектираните инвитро и образуване на клетъчни суспензионни култури:
Избраните линии калусни култури се поддържат - чрез периодично препосяване върху свежа полутвърда WP хранителна среда, както предходния етап на всеки 27 дни, следи се за настъпили изменения в морфология и стабилност и се анализира количеството на миконозид. Взема се същото количество съгл. пример 2, етап 2.2 биомаса от високопродуктивните линии и се култивира в стерилна течна WP среда със същите добавки от предходния етап в колба от 1000 ml на ротационна клатачка при обороти от 80 rpm до получаване на клетъчна суспензионна култура, състояща се от малки и средни по размер агрегати, получените най-адаптивни от 75% линии продължават за следващото дълбочинно култивиране, като посевен материал.
2.2. Култивиране на адаптираните клетъчни суспензионни култури за производство на биомаса.
Взема се 100 g свежо тегло/l клетъчна суспензионна култура, намираща се в експоненциална фаза на развитие на възраст от 7 дни, култивира се при 26°С на тъмно за 9 дни в колби от 2000 ml на ротационна клатачка при обороти 80 rpm. Получават се 110g/l свежа биомаса със съдържание на миконозид в получената биомаса 80 mg/g суха биомаса;
2.3. Активиране продукцията на биомасата
Към развитата биомаса, намираща се в късна експоненциална фаза на развитие (на възраст 6 дни), асептично се добавя 1 g стерилизирана абсорбционна смола (Amberlite XAD7) като втора фаза. Култивирането продължава още 4 дни до получаване на обогатена биомаса, съдържаща миконозид 100 mg/g суха биомаса. По-нататък се обработва, както пример 1, като биомасата и културалната течност се сушат чрез лиофилизация при -40°С. Добивът е 9 g суха биомаса за литър и 15 g суха маса културална течност за литър.
3) Получаване на екстракт от инвитро биомаса от клетъчна суспензионна култура на HR, стандартизиран по миконозид.
Изсушените общо 1 kg биомаса и културална течност се хомогенизират и екстрахират посредством мацерация с водно-етанолна смес 30% етанол при хидромодул 10 (тегло към обем) при същата температура и време, както и утаяване, разделяне и сушене съгласно пример 1 до получаване на гъста течност, съдържаща 20% влага.
Получават се 100 g екстракт от биомаса на инвитро клетъчна суспензионна култура от Haberlea rhodopensis, съдържаща миконозид 150 mg/g.
3.1. Разтваряне на полученият екстракт от инвитро суспензионна култура на HR по отношение съдържанието на миконозид.
Претеглят се 100,0 g от така полученият богат на миконозид екстракт от инвитро клетъчна суспензионна култура на HR. Към него се добавят 400,0 g глицерол до достигане на желаното тегло от 500 g екстракт, съдържащ 3% миконозид. Разбърква се до пълното хомогенизиране на екстракта чрез използване на ротационен хомогенизатор или хомогенизатор под високо налягане и полученият разтвор се опакова в стерилни опаковки и съхранява за целите на неговото използване.
Таблица 3:
Сравнителен анализ на антиксидантните свойства на екстракт от инвитро култури HR, получен съгласно пример 1 в сравнение със стандартния 70% етанолен екстракт HR от природата:
Тотални феноли ring GAE/g DPPH, ECw mgftnl TEAC, mM Trolex Equivalent /g FRAP, mM Trolex Equivalent Iq CUPRAC, mM T rotex Equivalent /g
екстракт от РСС на HR 30,87±0.57 0,041 493,0510,97 622,8713,60 1199,91*14,39
стандартен 70% етанолов екстракт от HR 29,4410,09 0,042 402,6913,95 564,0715,15 1037,90*24,44
BG 67493 Bl
DPPH (2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl) /HR екстракт/ 0.1 mM разтвор на DPPH радикал/на тъмно, при 21 °C за 15 min / % намаление на абсорбцията при λ = 517 спрямо това на контролна проба (с добавка на метанол)/ определяне ЕС50 (ефективна концентрация, която инхибира 50% от DPPH радкала в 0.1 mM разтвор на DPPH).
ТЕАС / ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) радикала/ HR екстракт се добавя към разтвор на предварително генериран ABTS радикал/тъмно, при 21 °C за 15 min/% намаление на абсорбцията при λ = 734 nm спрямо това на контролна проба (с добавка на метанол)/резултат, като mM Trolox ((±)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid).
За оценка на редуциращата активност са използвани:
CUPRAC /HR екстракт/ разтвор на Си(П) йони в присъствие на комплексообразовате Неокуприн/ тъмно, при 21 °C за 15 min/ редукция на Си(П) до Cu(I)/ абсорбционен максимум при λ = 450 nm/mM Trolox резултат;
FRAP - HR екстракт/разтвор на Fe(III) йони в присъствие на TPTZ (2,4,6-tris(2-pyridyl)-striazine)/TbMHO, при 21°С за 15 min/ редукция на Fe(III) до Fe(II) / Fe-TPTZ комплекса/абсорбционен максимум при λ = 593 nm/ mM Trolox резултат.

Claims (4)

  1. Стандартизиран растителен екстракт от биомаса на инвитро култури, съдържащ биологично активни вещества и техните първични и вторични метаболити, характеризиращ се с това, че екстрактът е продуциран от инвитро култури от Haberlea rhodopensis Friv. (HR) и съдържа в тегл. % както следва: органични киселини от 4.0 до 6.0, мастни киселини от 0.5 до 1.5, аминокиселини от 8.0 до 12.0, стероли от 0.5 до 1.0, свободни феноли от 3.0 до 6.0, захари от 45 до 55 и полифеноли от 25.0 до 35.0 с преобладаващо съдържание на миконозид от 70% до 96% в полифенолната фракция, съставляващо от 18% до 35% в общия екстракт.
  2. Състав, съдържащ стандартизиран екстракт съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че съдържа и глицерол и съдържанието на миконозид е от 0.01% до 15.00%.
  3. Метод за получаване на стандартизиран екстракт от растителни инвитро култури съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че експланти на HR се подлагат на неколкократно измиване със стерилна дестилирана вода за 1-240 min, обработка с 40-85% етанол за 10-190 s и последваща обработка с 2-10% дезинфектант за 10-60 min с или без добавен детергент, промиване неколкократно със стерилна дестилирана вода и подсушаване за 1-20 min, култивиране на получените стерилни експланти върху полутвърда или течна стерилна хранителна среда с или без добавени растежни регулатори при 18-32°С на фоторежим на тъмно или светло/тъмно за 8-16 h и pH 5-6.2 до получаване на 85-100% диференцирани или недиференцирани култури за период от 2-5 седмици, последващо самостоятелно култивиране на получените инвитро култури върху полутвърда стерилна хранителна среда с или без добавени растежни регулатори и с или без добавени редуциращи агенти и/или антиоксиданти при 18-32°С на същия фоторежим за 15-45 дни до получаване на между 5-30% селектирани свръхпродуктивни на миконозид и мофологично стабилни линии инвитро култури от общия брой генерирани инвитро линии, които се поддържат върху свежа полутвърда среда с или без добавени растежни регулатори за 20-35 дни, където получените високопродуктивни инвитро култури се култивират за допълнително адаптиране в стерилна течна хранителна среда с добавени: въглероден източник, растежни регулатори и/или антиоксиданти до получаване на 70-100% адаптирани към дълбочинното култивиране клетъчни линии, т. н. посевен материал, който се инокулира отново в течна среда за следващо култивиране в колби, биореактори или системи с временно разбъркване за 1-30 min и покой за 1-12 h при 18-32°С на същия фоторежим за 1-6 седмици до достигане на контролно съдържание на миконозид в биомасата не по-малко от 80 mg/g суха биомаса, следващо добавяне на фактори за повишаване биосинтезата на вторични растителни метаболити, избрани от: елиситори, подхранване със свежа хранителна среда, добавяне на предшественици, включване на втора фаза в култивационната система или тяхна комбинация за период 3-15 дни до получаване на обогатена на миконозид биомаса, последвано от отделяне на получената биомаса от културалната течност и сушене при 20-80°С или лиофилизация до добив не по-нисък от 10-15 g/l суха биомаса и в даден случай вакуум изпаряване на получената културална течност при 30-70°С или лиофилизация с добив суха маса не по-нисък от 15-30 g/l, след което получената суха смес, съдържаща миконозид не по-малко от 100 mg/g се хомогенизира в дезинтегратор и се подлага на мацерация с 30-80% етанол за 16-72 h при 18-45°С с или без помощта на ултразвук, извършва се филтриране на получената смес, отделяне на утайката, събиране и концентриране под вакуум при 30-70°С на получения филтрат до получаване на гъста течност (екстракт) с влага 10-30%, съдържащ миконозид в екстракта не по-малко от 150 mg/g екстракт и накрая полученият концентриран екстракт се разтваря, като към него се добавя глицерол, хомогенизира се до пълното му разтваряне и получаване на краен стандартизиран по миконозид растителен екстракт от инвитро култури на Haberlea rhodopensis Friv.
  4. Биомаса, получена чрез култивиране съгласно претенция 3, характеризираща се с това, че съдържа миконозид не по-малко от 100 mg/g суха биомаса.
BG113104A 2020-03-19 2020-03-19 Стандартизиран растителен екстракт от биомаса на инвитро култури, метод за неговото получаване и използване BG67493B1 (bg)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BG113104A BG67493B1 (bg) 2020-03-19 2020-03-19 Стандартизиран растителен екстракт от биомаса на инвитро култури, метод за неговото получаване и използване
US17/912,237 US20230193331A1 (en) 2020-03-19 2020-03-19 Standardized plant extract from biomass of in vitro cultures, method for preparation and use thereof
MX2022010818A MX2022010818A (es) 2020-03-19 2020-04-15 Extracto vegetal normalizado a partir de biomasa de cultivos in vitro, metodo para su preparacion y uso.
KR1020227036339A KR20220156887A (ko) 2020-03-19 2020-04-15 인비트로 배양의 바이오매스로부터의 표준화된 식물 추출물, 그의 제조 방법 및 사용
CA3171701A CA3171701A1 (en) 2020-03-19 2020-04-15 Standardized plant extract from biomass of in vitro cultures, method for preparation and use thereof
PCT/BG2020/000016 WO2021184086A1 (en) 2020-03-19 2020-04-15 Standardized plant extract from biomass of in vitro cultures, method for preparation and use thereof
JP2022554456A JP2023525203A (ja) 2020-03-19 2020-04-15 インビトロ培養物のバイオマス由来の標準化植物抽出物、その調製方法及び使用
IL296467A IL296467A (en) 2020-03-19 2020-04-15 A standardized plant extract from the biomass of in vitro cultures, a method for its preparation and use
EP20727574.4A EP4121511A1 (en) 2020-03-19 2020-04-15 Standardized plant extract from biomass of in vitro cultures, method for preparation and use thereof
AU2020436453A AU2020436453A1 (en) 2020-03-19 2020-04-15 Standardized plant extract from biomass of in vitro cultures, method for preparation and use thereof
BR112022015883A BR112022015883A2 (pt) 2020-03-19 2020-04-15 Extrato vegetal padronizado a partir de biomassa de culturas in vitro, método para preparação e uso do mesmo
CN202080097832.3A CN115380105A (zh) 2020-03-19 2020-04-15 来自体外培养物的生物质的标准化植物提取物、其制备方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BG113104A BG67493B1 (bg) 2020-03-19 2020-03-19 Стандартизиран растителен екстракт от биомаса на инвитро култури, метод за неговото получаване и използване

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG113104A BG113104A (bg) 2021-09-30
BG67493B1 true BG67493B1 (bg) 2023-01-31

Family

ID=70802551

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG113104A BG67493B1 (bg) 2020-03-19 2020-03-19 Стандартизиран растителен екстракт от биомаса на инвитро култури, метод за неговото получаване и използване

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20230193331A1 (bg)
EP (1) EP4121511A1 (bg)
JP (1) JP2023525203A (bg)
KR (1) KR20220156887A (bg)
CN (1) CN115380105A (bg)
AU (1) AU2020436453A1 (bg)
BG (1) BG67493B1 (bg)
BR (1) BR112022015883A2 (bg)
CA (1) CA3171701A1 (bg)
IL (1) IL296467A (bg)
MX (1) MX2022010818A (bg)
WO (1) WO2021184086A1 (bg)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023093998A1 (en) * 2021-11-26 2023-06-01 Medena Ag Composition, in particular cosmetic formulation, comprising a verbascoside extract
WO2024098120A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Innova Bm Ltd. Myconoside-rich extract from in vitro systems of plants belonging to genera haberlea and ramonda, method of preparation, and use as chemo-, radio- and uv protector

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1736167B1 (en) 2005-06-20 2018-03-21 I.R.B. Istituto Di Ricerche Biotecnologiche S.r.l. Extracts obtained from cell line cultures from Syringa vulgaris IRB-SV25/B (DMS:16857), their preparation and use
JP5465037B2 (ja) 2010-02-22 2014-04-09 株式会社ノエビア 抗老化剤、抗酸化剤、美白剤、免疫賦活剤、皮膚外用剤および機能性経口組成物
FR2958163B1 (fr) 2010-03-31 2014-06-13 Fabre Pierre Dermo Cosmetique Preparation issue d'une culture in vitro de cellules dedifferencieres non elicitees d'arganier, leur utilisation pour le traitement du vieillissement cutane, de l'inflammation et de la cicatrisation, et leur obtention.
GB2508571A (en) 2011-10-03 2014-06-04 Marketing Store Worldwide Lp Efficient electronics module
LV15436B (lv) 2018-03-16 2020-02-20 Alternative Plants, Sia Ādu atjaunojoša un aizsargājoša kosmētikas aktīvā viela no dracocephalum ruyschiana ģints nediferencētu šūnu biomasas un tās sagatavošanas paņēmiens

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021184086A1 (en) 2021-09-23
KR20220156887A (ko) 2022-11-28
AU2020436453A1 (en) 2022-10-20
EP4121511A1 (en) 2023-01-25
CN115380105A (zh) 2022-11-22
CA3171701A1 (en) 2021-09-23
US20230193331A1 (en) 2023-06-22
JP2023525203A (ja) 2023-06-15
MX2022010818A (es) 2022-09-29
IL296467A (en) 2022-11-01
BR112022015883A2 (pt) 2022-10-04
BG113104A (bg) 2021-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101126315B1 (ko) 산삼 또는 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 노화 방지 또는 항산화용 조성물
US9167840B2 (en) Production and extraction of procyanidins from plant cell cultures
BG67493B1 (bg) Стандартизиран растителен екстракт от биомаса на инвитро култури, метод за неговото получаване и използване
Bauer et al. Potential of different Coleus blumei tissues for rosmarinic acid production
Farag Cannabinoids production in Cannabis sativa L.: An in vitro approach
Choi Panax ginseng CA Meyer: micropropagation and the in vitro production of saponins
Navarro et al. Efficient use of biomass and extract of the microalga Desmodesmus subspicatus (Scenedesmaceae) in asymbiotic seed germination and seedling development of the orchid Cattleya warneri
Ionkova Optimization of flavonoid production in cell cultures of Astragalus missouriensis Nutt.(Fabaceae)
WO2007107803A2 (en) Process and modified media for preparing callus- and cell suspension cultures of hypericum perforatum l.
WO2019008225A1 (en) METHOD FOR PRODUCING BETULACEAE FAMILY CELL CULTURES, COMPOSITIONS COMPRISING THE CELL CULTURES AND USE OF THE CELL CULTURES
Grzelak et al. Initiation and growth characteristics of suspension cultures of Calendula officinalis cells
Szymańska et al. Field cultivation and in vitro cultures, root-forming callus cultures and adventitious root cultures, of Panax quinquefolium as a source of ginsenosides
JP3030782B2 (ja) ポドフィロトキシン類化合物の製造法
de Andrade Salles et al. Valeriana glechomifolia: in vitro propagation and production of valepotriates
Çölgeçen et al. Callus production and analysis of some secondary metabolites in Globularia trichosantha subsp. trichosantha
Kusuma et al. Aeration volume and inoculum density using in bioreactor to optimized biomass production and secondary metabolites in Gynura procumbens (Lour.) Merr
WO2021240349A1 (en) Method for the production of triterpenic acids by in vitro culture of calluses deriving from the pulp of red sentinel (rs) apple
Abo El-Fadl et al. Enhancing the biochemical constituents in avocado callus using encapsulated chitosan nanoparticles
Ebrahimzadeh et al. Influence of plant growth regulators on callus induction, silymarin production and antioxidant activity in Silybum marianum L. gaertn. by tissue culture.
El-Sadek et al. Novel application of Spirulina platensis extract as an alternative to the expensive plant growth regulators on Capparis cartilaginea (Decne.)
Ahmed et al. In vitro regeneration and improving kaempferol accumulation in blackberry (Rubus fruticosus L.) callus and suspension cultures
Aruna et al. Influence of aseptic seedling explants on in vitro shoot multiplication of Caralluma adscendens var. attenuate Wight
Idris et al. Sucrose enhanced stigmasterol production in callus cultures of Wedelia biflora (L.) DC
Ajay et al. Direct and Indirect Organogenesis in Hippophae salicifolia D. Don., A Nutraceutically Important Plant
YURTERİ Effect of Plant Growth Regulators on Different Explants and Explant Size of Yellow Everlasting (Helichrysum pallasii Sprengel Ledeb.) Under in vitro Conditions