LV15436B - Ādu atjaunojoša un aizsargājoša kosmētikas aktīvā viela no dracocephalum ruyschiana ģints nediferencētu šūnu biomasas un tās sagatavošanas paņēmiens - Google Patents
Ādu atjaunojoša un aizsargājoša kosmētikas aktīvā viela no dracocephalum ruyschiana ģints nediferencētu šūnu biomasas un tās sagatavošanas paņēmiens Download PDFInfo
- Publication number
- LV15436B LV15436B LVP-18-20A LV180020A LV15436B LV 15436 B LV15436 B LV 15436B LV 180020 A LV180020 A LV 180020A LV 15436 B LV15436 B LV 15436B
- Authority
- LV
- Latvia
- Prior art keywords
- range
- cells
- ruyschiana
- active substance
- biomass
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/18—Antioxidants, e.g. antiradicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/53—Lamiaceae or Labiatae (Mint family), e.g. thyme, rosemary or lavender
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
- A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
- A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
- A61K8/9789—Magnoliopsida [dicotyledons]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
- A61Q19/08—Anti-ageing preparations
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Birds (AREA)
- Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
1. Ādu atjaunojoša un aizsargājoša kosmētikas aktīvā viela, kas ir standartizēts šūnu biomasas ekstrakts, kurš iegūts no in vitro pavairotas augu šūnu biomasas, kur minētās in vitro pavairotās augu šūnas ir nediferencētas D.ruyschiana kallusa šūnas. 2. Aktīvā viela atbilstoši 1. pretenzijai, kur minētie kallusi ir audzēti uz cietas kultivēšanas barotnes virsmas vai nu tumsā, vai 14–16 stundu gaismas fotoperiodā. 3. Aktīvā viela atbilstoši 1. pretenzijai, kas ir iegūta no D.ruyschiana suspensijas šūnu kultūras, kurā šūnas tiek audzētas šķidrā kultivēšanas barotnē vai nu tumsā, vai 14–16 stundu gaismas fotoperiodā. 4. Metode ādu atjaunojošas un aizsargājošas kosmētikas aktīvās vielas sagatavošanai atbilstoši jebkurai no iepriekš norādītajām pretenzijām, kas sastāv no sekojošiem secīgiem soļiem: i) in vitro pavairotas nediferencētas D.ruyschiana kallusa šūnas tiek audzētas uz cietas barotnes vai šķidrā kultivēšanas barotnē, ii) D.ruyschiana kallusa šūnu biomasa tiek atdalīta no kultivēšanas vides, iii) šūnu biomasa tiek ekstraģēta ar etanolu koncentrāciju diapazonā no 30 līdz 70 %, vai arī ar etanola, glicerīna un ūdens maisījumu, kur etanola, glicerīna un ūdens attiecības ir diapazonā no 20 % / 20 % / 60 % līdz 50 % / 50 % / 0 % (v/v/v), un biomasas attiecība pret šķīdinātāju ir diapazonā no 1:3 līdz 1:10 (w/v). 5. Metode atbilstoši 4. pretenzijai, kur šūnas atbilstoši solim (i) tiek audzētas tumsā. 6. Metode atbilstoši 4. pretenzijai, kur šūnas atbilstoši solim (i) tiek audzētas 14–16 stundu gaismas fotoperiodā. 7. Metode atbilstoši 5. un 6. pretenzijai, kurā metode papildus ietver soli (iv) ekstraktu, kas iegūts no šūnām, kas kultivētas tumsā, un ekstraktu, kas iegūts no šūnām, kas kultivētas 14–16 stundu gaismas fotoperiodā, kombinēšanu, kur ekstraktu savstarpējā attiecība ir diapazonā no 1:1 līdz 1:5 (v/v). 8. Metode atbilstoši jebkurai no iepriekšminētajām pretenzijām, kur D.ruyschiana biomasa, kas atdalīta no kultivēšanas vides solī (ii), tiek liofilizēta un sekojoši ekstraģēta, kā aprakstīts solī (iii), ar etanolu koncentrāciju diapazonā no 30 līdz 70 %, vai arī ar etanola, glicerīna un ūdens maisījumu, kur etanola, glicerīna un ūdens attiecības ir diapazonā no 20 % / 20 % / 60 % līdz 50 % / 50 % / 0 % (v/v/v), un liofilizētās biomasas attiecība pret šķīdinātāju ir diapazonā no 1:50 līdz 1:100 (w/v). 9. Aktīvās vielas izmantošana atbilstoši no 1. līdz 3. pretenzijai kosmētisko kompozīciju sagatavošanā. 10. Aktīvās vielas izmantošana atbilstoši 9. pretenzijai koncentrāciju diapazonā no 0,25 līdz 2 %. 11. Aktīvās vielas izmantošana atbilstoši 9. vai 10. pretenzijai, kur kafijskābes atvasinājumu saturs aktīvajā vielā ir diapazonā no 45 līdz 70 % no kopējā flavonoīdu satura ekstraktā.
Description
IZGUDROJUMA APRAKSTS [001] Tehnikas nozare
Izgudrojums saistīts ar nediferencētas augu šūnu kultūras iegūšanu un liela šūnu apjoma pavairošanu, lai ekstraģētu bioloģiski aktīvas vielas izmantošanai kosmētikā.
[002] Zināmais tehnikas līmenis
Lielais pieprasījums pēc dabīgām funkcionālām augu izcelsmes aktīvajām vielām, ierobežota un striktāk regulēta sintētisko un dzīvnieku izcelsmes aktīvo vielu izmantošana ir veicinājusi biotehnoloģisku metožu izmantošanu kosmētikas aktīvo vielu ražošanā. Savvaļas vai ar tradicionālajām lauksaimniecības metodēm kultivēti augi nereti producē zemas vēlamo bioloģiski aktīvo savienojumu koncentrācijas. Turklāt ir ārstniecības augi, kurus nav iespējams kultivēt, kā arī tādi ārstniecības augi, kuri ir reti sastopami vai apdraudēti, un šo augu producētie bioloģiski aktīvie savienojumi nozarei šobrīd ir nepieejami. Augu biotehnoloģija, it īpaši, augu šūnu kultivēšanas in vitro metodes ir kļuvušas par perspektīvu veidu, kā ilgtspējīgi un ar nemainīgu kvalitāti producēt augu izcelsmes bioloģiski aktīvās vielas (Trehan S, Michniak-Kohn B, Bēri K. Plant stem cells in cosmetics: current trends and future directions. Future Science OA. 2017;3(4):FS0226. doi:10.4155/fsoa-2017-0026).
[003] Augu šūnu kultūru veidošanas un šūnu pavairošanas uz cietas kultivēšanas virsmas vai kultivējot šķidrā barotnē principi iepriekš ir aprakstīti zinātniskos rakstos un patentu pieteikumos (EP1736167B1). Vispārīgie augu šūnu kultūru veidošanas un kultivēšanas procesi ir aprakstīti patenta pieteikumā W02004033673A2. Tomēr vispārīgie augu šūnu kultivēšanas principi nav piemērojami liela mēroga šūnu pavairošanai ražošanas vajadzībām un ir nepieciešamība izstrādāt specifiskus tehnoloģiskos procesus. Lai šūnu kultūru uzturētu nediferencētā stāvoklī un panāktu efektīvu šūnu proliferāciju, nepieciešams katrai šūnu līnijai (katrai augu sugai) pielāgot auksīnu un citokinīnu attiecības. Šūnu kultivēšanas apstākļu modificēšana un dažādu elicitoru izmantošana ir būtiska, lai ražotu specifiskus bioloģiski aktīvos savienojumus, kultivēšanas apstākļi un elicitori ir specifiski izmantotajām augus sugām, kā arī mērķa savienojumiem, kurus plānots iegūt.
[004] Augu šūnu biomasa līdz šim ir efektīvi izmantota, lai ražotu fenilpropanoīdus (šūnu kultūrās, kas iegūtas no Ajuga repens) un verbaskozīdu (šūnu kultūras, kas iegūtas no Olea europea, Syringa vulgaris vai Appia citrobara). Ekstraktu, kas standartizēti pēc verbascozīda satura, ražošana no Syringa vulgaris šūnu kultūrām tiek izmantota medicīnas un kosmētikas produktu izejvielu ražošanas vajadzībām un ir aprakstīta patenta pieteikumā EP1736167B1.
[005] Meristēmu šūnu kultūru ar augstu kafijskābes atvasinājumu saturu iegūšana no ģintīm Achillea, Ajuga, Buddleja, Centella, Cynaris, Echinacea, Forsythia, Gardenia, Glycyrrhiza, Hippeastrum, Hoodia, Lamium, Leontopodium, Lippia, Lonicera, Magnolia, Marrubium, Passiflora, Phytolacca, Plantago, Ruta, Stachys, Stapelia, Syringa, Teucriun vai Zanthoxylurn pārstāvjiem ir aprakstīta patenta pieteikumā EP2319914A1. Ekstraktiem, kas iegūti no šādām šūnu kultūrām, ir novērota augsta antioksidatīvā aktivitāte, kolagēna sintēzi stimulējoša aktivitāte un ādas pigmentāciju regulējošas īpašības (EP1736167B1).
[006] Kosmētikas, farmaceitisko produktu un pārtikas piedevu kompozīcijas, kas satur sastāvdaļas, kuras iegūtas no ģinšu Dendrobium, Phalaenolopsis, Aniseilia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya un Vanda šūnu kultūrām, ir aprakstītas patentā FR2978161B1.
[007] Echinacea ģints augu meristēmas šūnu izmantošana ādu atjaunojošam pielietojumam kosmētikā ir aprakstīta patentā FR2978044B1.
[008] Nediferencētas un dediferencētas Lentopodium alpinum šūnas tiek izmantotas pielietojumos kosmētikā, lai atjaunotu ādas homeostāzi, stimulētu ādas vielmaiņas aktivitāti (FR3031454A1).
[009] Specifiska ādas poru savelkoša aktivitāte tiek piedēvēta ekstraktam, kas iegūts no Marrubium vulgare dediferencētām šūnām un standartizēts pēc forsitozīda В satura (FR3049194A1).
[010] Patenta pieteikumā EP2817070A1 aprakstīta kombinēta lāceņu Rubus chamaemorus kallusu kultūras ekstrakta un lāceņu sēkliņu eļļas kā kosmētikas aktīvās vielas izmantošana.
[Oil] Patenta pieteikumā JP2015505312A tiek aprakstīta Rosa ģints augu dediferencētu šūnu un augu šūnu ekstraktu izmantošana ādas un matu kopšanas kosmētikas sastāvā, lai novērstu novecošanās pazīmes.
[012] Līdz šim vēl nav aprakstīta ekstrakta kā bioloģiski aktīvās vielas iegūšana no nediferencētu Dracocephalum ruyschiana šūnu biomasas izmantošanai kosmētikas produktos.
[013] Tāpat līdz šim vēl nav aprakstīta no Dracocephalum ģints augiem iegūtu šūnu kultūru izmantošana kafijskābes atvasinājumu ražošanai.
[014] Izgudrojuma izklāsts
Izgudrojuma kopsavilkums
Ādu atjaunojoša un kosmētiski aktīva sastāvdaļa, kas aizsargā ādu un ir standartizēts ekstrakts no in vitro pavairotas augu šūnu biomasas, kura sastāv no in vitro pavairotām nediferencētām Dracocephalum ruyschiana šūnām. Saskaņā ar atklājumu D.ruyschiana kallusus audzē uz cietas kultivēšanas vides tumsā vai 14-16 stundu gaismas fotoperiodā. Saskaņā ar citu papildus atklājumu D.ruyschiana šūnas audzē šķidrā kultivēšanas barotnē tumsā vai 14-16 stundu gaismas fotoperiodā.
[015] Tālāk tiek aprakstīta ādu atjaunojošas un aizsargājošas kosmētikas aktīvās vielas sagatavošanas metode, kas ietver šādus secīgas soļus: (i) in vitro pavairotu nediferencētu D.ruyschiana šūnu, kas audzētas uz cietas kultivēšanas vides vai šķidrā kultivēšanas barotnē, iegūšana, (ii) D.ruyschiana šūnu biomasas atdalīšana no kultivēšanas barotnes; (iii) šūnu biomasas ekstrakcija ar etanolu koncentrācijās no 30 līdz 70 % vai ar etanola, glicerīna un ūdens maisījumu, kur etanola, glicerīna un ūdens attiecības ir robežās no 20% / 20 % / 60 % līdz 50 % / 50 % / 0 % (tilpums / tilpums %). Šūnu biomasas un šķīdinātāja attiecības ir robežās no 1: 3 līdz 1:10 (masa / tilp.). Saskaņā ar izgudrojumu D.ruyschiana šūnu biomasa, kas atdalīta no kultivēšanas barotnes solī (ii), ir liofilizēta un tālāk ekstraģēta ar minēto šķīdinātāju, kā paskaidrots solī (iii), kur liofīlizētas biomasas un šķīdinātāja attiecība ir robežās no 1:50 līdz 1: 100 (masa / tilp.). In vitro pavairotās nediferencētās D.ruyschiana šūnas, kas minētas solī (i), ir šūnas, kas audzētas tumsas apstākļos vai 14-16 stundu gaismas fotoperiodā. Saskaņā ar izgudrojumu šī metode papildus ietver soli (iv) ekstraktu, kas iegūti no tumsā audzētām šūnām, kombinēšanu ar ekstraktiem, kas iegūti no šūnām, kas audzētas 14-16 stundu fotoperiodā - attiecībā no 1: 1 līdz 1: 5 (tilpums / tilpums). Izgudrotāji ierosina lietot minēto ādu atjaunojošo un aizsargājošo kosmētiski aktīvo izejvielu kosmētikas līdzekļu sastāvā. Rekomendētās izmantojamās sastāvdaļas koncentrācijas ir robežās no 0,25 % līdz 2 %. Aktīvā viela ir standartizēta attiecībā uz kafījskābes atvasinājumu saturu, jo šī savienojumu grupa veido 45-75 % no kopējā flavonoīdu daudzuma šūnu biomasas ekstraktā.
[016] īss zīmējumu apraksts
1. zīm. - hromatogramma, kas ilustrē dominējošos savienojumus un to relatīvo daudzumu D.ruyschiana šūnu biomasas ekstraktā.
2. zīm. - grafiks, kas parāda D.ruyschiana šūnu biomasas ekstrakta ietekmi uz ādas keratinocītu proliferāciju.
3. zīm. - grafiks, kas parāda D.ruyschiana šūnu biomasas ekstrakta ietekmi uz ādas dermālo fibroblastu proliferāciju.
4. zīm. - grafiks, kas parāda D.ruyschiana šūnu biomasas ekstrakta ietekmi uz melanīna sintēzi FM-55 un B16 melanocītos.
5. zīm. - grafiks, kas parāda D.ruyschiana šūnu biomasas ekstrakta ietekmi uz kolagēna I un MMP-1 gēnu ekspresiju ādas fibroblastos.
[017] Detalizēts izgudrojuma apraksts
Izgudrojuma pirmais posms ietver šūnu kultūru izveidi no D.ruyschiana virszemes vasas daļām. Tas tiek darīts, sagriežot savvaļas auga virszemes vasas daļas, nomazgājot ar ūdeni un apstrādājot tās ar balinātāju, lai iegūtu sterilus audus. Sasmalcinātie audu gabaliņi tiek novietoti uz cietas kultivēšanas barotnes. Saskaņā ar izgudrojumu kultivēšanas barotne satur mikroelementus (C0CI2X6H2O, CuSO4x5H2O, FeNaEDTA, H3BO3, KI, MnSO4xH2O, Na2MoO4.2H2O, ZnSO4.7H2O), makroelementus (CaCh, KH2PO4, KNO3, MgSO4, NH4NO3), glicīnu, mioinozitolu, nikotīnskābi, piridoksīnu, tiamīnu, saharozi, augu agaru un augšanas regulatorus (2,4-Dihlorfenoksietiķskābi, 6-Benzilaminopurīns), pH tiek noregulēts ar nātrija hidroksīdu līdz 5.6 - 5.8. Tomēr ir iespējama arī cita mikroelementu un makroelementu kombinācija. Kallusu veidošanās no nekontaminētiem augu audu eksplantiem tiek novērota pēc ilgāka laika perioda. Kallusi tiek pavairoti, tos sadalot un regulāri pārvietojot (pārsējot) uz svaigām audzēšanas platēm. Kallusi ar atbilstošām īpašībām (ātra un pastāvīga augšana, piemērota morfoloģija un ķīmiskais sastāvs] tiek izvēlēti pēc 10-15 audzēšanas cikliem (pārsējumiem).
[018] Suspensijas šūnu kultūras tiek izveidotas no atlasītiem kallusiem, tos pārnesot šķidrā audzēšanas barotnē. Atsaucoties uz izgudrojumu, kultivēšanas barotne sastāv no: mikroelementiem (C0CI2X6H2O, CuSO4x5H2O, FeNaEDTA, H3BO3, KI, МпЗСкхНгО, Na2MoŪ4.2H20, ZnSO4.7H2O], makroelementiem (CaCh, KH2PO4, KNO3, MgSCU, NH4NO3), glicīna, mioinozitola, nikotīnskābes, piridoksīna, tiamīna, saharozes un augšanas regulatoriem (2,4-Dihlorfenoksietiķskābi, 6-Benzilaminopurīns], pH tiek noregulēts ar nātrija hidroksīdu līdz 5.6 - 5.8, kallusu un barotnes attiecība ir robežās no 1:5 to 1:10 (masa/tilp.}. Tomēr ir iespējama arī cita mikroelementu un makroelementu kombinācija. Fermentācija šķidrajā kultivēšanas barotnē tiek veikta pie temperatūras, kas ir robežās no 18 līdz 25 °C, izmantojot orbitālo kratītāju ar pietiekamu aerāciju. Šūnas tiek regulāri monitorētas, nosakot to dzīvotspēju, dalīšanās aktivitāti, kā arī cukura līmeņa izmaiņas barotnē, un regulāri tiek pievienota svaiga kultivēšanas barotne.
[019] Ekstraktus gatavo no kallusu vai suspensijas šūnu kultūrām. Pēc pietiekama biomasas pieauguma sasniegšanas šūnas tiek mehāniski atdalītas no kultivēšanas barotnes (kallusu gadījumā] vai sedimentētas, izmantojot centrifugāciju (šūnu suspensijas kultūru gadījumā]. Šūnu biomasa no kallusu vai suspensijas kultūrām tiek ekstraģēta ar etanola un glicerīna maisījumu (etanols/glicerīns/ūdens attiecībās no 20 %/20 %/60 % līdz 50 %/50 %/0 %] vai arī tikai ar etanolu (koncentrācijas no 30 % līdz 70 %) (tilp./tilp.]. Ekstrakti var tikt pagatavoti gan no svaigas šūnu biomasas, kur biomasas un šķīdinātāja attiecība ir no 1:3 līdz 1:10 (masa/tilp.], vai arī no liofilizētas šūnu biomasas, kur sausās biomasas un šķīdinātāja attiecība ir no 1:50 līdz 1:100 (masa/tilp.).
[020] Ķīmiskais sastāvs
No D.ruyschiana šūnu biomasas iegūtā ekstrakta ķīmiskais sastāvs tika analizēts, izmantojot LC-TOF-HRMS metodi. Hromatogrāfijas analīzes tika veiktas, izmantojot modulāru UHPLC sistēmu Agilent 1290 Infinity series (Agilent Technologies, Germany). Šķidruma hromatogrāfija tika veikta, izmantojot C18, 2,1x50 mm, 2.6 pm kolonnu ar kustīgo fāzi, kas sastāv no 0,1 % skudrskābes (kanāls A] un acetonitrila (kanāls B] gradienta režīmā ar plūsmas ātrumu 0,3 mL/min. Injekcijas tilpums bija 20,0 pL Augstas izšķirtspējas masas spektri (HRMS] tika uzņemti, izmantojot Agilent 6230 TOF LC/MS sistēmu ar pozitīvu elektronu izkliedes jonizāciju (ESI). Avota parametri bija: pozitīvs jonizācijas režīms, žāvēšanas gāzes plūsma 12,0 L/min un temperatūra 320 °C, spiediens uz smidzinātāju 40 psi, kapilārais spriegums 3500 V un izmantotais fragmentors bija 130 V. Viens pilnas masas spektrs tika iegūts profila režīmā, masas diapazons bija no m/z 70 līdz 2000. Visu atdalīto un analizēto savienojumu dati tika iegūti, izmantojot atsevišķas savienojuma hromatogrammas ekstrakciju pie to individuālajām m/z vērtībām. Dati tika analizēti, izmantojot MassHunter B07.00 programmatūru.
[021] Pārsteidzoši ir tas, ka ķīmiskajās analīzēs augu šūnu biomasas ekstraktos uzrādījās augsta kafeiola atvasinājumu koncentrācija. Šī savienojumu grupa ir dominējošā ekstraktos, kas iegūti no šūnu kultūrām. Dominējošo kafeiola atvasinājumu relatīvais sastāvs ir 45-70 % no kopējā flavonoīdu daudzuma visā ekstraktā. Augsta kafeiola atvasinājumu koncentrācija apstiprina ekstraktu kā aktīvās sastāvdaļas izmantojamību ādu atjaunojošos un aizsargājošos kosmētikas līdzekļos.
[022] Antiradikālā aktivitāte
Antiradikālo aktivitāte (ARA) tika noteikta ar 2,2-difenil-l-pikrilhidrazil (DPPH) brīvo radikāļu saistīšanas metodi, izmantojot plaša skrīninga 96 lauciņu plašu metodi, ko iepriekš ir aprakstījis T. Heralds u.c. {T.J. Herald, P. Gadgil un M. Tilley, High-throughput micro plate assays for screening flavonoid content and DPPH-scavenging activity in sorghum bran and flour, Science of Food and Agriculture, izdevums. 92, Ip. 2326-2331, 2012) ar nelielām izmaiņām.
[023] Brīvo radikāļu saistīšanas aktivitātes mērījumi tika veikti, sajaucot 100 μΜ DPPH šķīdumu etanolā ar ekstraktu vai standartu paraugiem. Absorbcija tika nolasīta pie 517 nm viļņa garuma, kopā ar kontroles paraugiem. Visu ekstraktu brīvo radikāļu saistīšanas aktivitātes procentuālais daudzums tika aprēķināts pēc šādas formulas:
Sasaistīšana [DPPH]=[(Ao-Ai/Ao)]><1 00, kur
Ao bija tukšā parauga absorbcija;
Ai bija absorbcija ekstrakta klātbūtnē.
Antiradikalā aktivitāte tika izteikta Trolox ekvivalentos (Trolox μΜ/ml), balstoties uz kalibrācijas līkni (18,3 - 500 μΜ ml·1).
[024] Kopējais fenolu daudzums
Kopējais fenolu daudzums tika analizēts, izmantojot Folina-Čikalto metodi un 96 lauciņu liela paraugu daudzuma skrīninga plates kā aprakstījis Heralds u.c. ar nelielām, izmaiņām.
[025] Nolasījumi tika veikti, sajaucot darba Folin-Čikalto šķīdumu (1:1 ar ūdeni), nātrija bikarbonātu un etanola ekstraktu vai standarta šķīdumus. Absorbcijas nolasījumi tika veikti pie 765 nm viļņa garuma pēc 90 minūšu inkubācijas. Kopējais fenolu daudzums (TPC, total phenolic content) tika izteikts kā gallusskābes ekvivalenti (g GAE mg/ml ekstrakta), balstoties uz gallusskābes (GA, Gallic acid) kalibrācijas līkni (koncentrāciju diapazonā no 0,025 - 0,200 mg ml·1).
[026] Absorbcijas nolasījumi tika veikti, izmantojot iekārtu Infinite M200 PRO (Tecan), pie joslas platuma 9 mm, temperatūras 25 °C.
1. Tabula Antiradikāla aktivitāte un kopējais fenolu daudzums D.ruyschiana šūnu biomasas ekstraktā
| Antiradikālā aktivitāte (Trolox ekvivalenti, μΜ/ml) | Kopējais fenolu daudzums (Gailu skābes ekvivalenti pg/ml) | |
| D.ruyschiana šūnu biomasas ekstrakts | 500.6 ± 10.08 | 193 ± 9.67 |
[027] Ādas šūnu proliferācijas analīze
Lai novērtētu ekstakta, kas iegūts no D.ruyschiana biomasas, ietekmi uz HaCaT keratinocītu un dermas firbroblastu dalīšanās aktivitāti, tika izmantotas reālā laika dzīvu šūnu monitoringa un vizualizācijas sistēmas. HaCaT keratinocīti un primārie fibroblasti tika izsēti 96 lauciņu kultivēšanas platēs koncentrācijā 2000 šūnas/lauciņā. Šūnas tika inkubētas DMEM (Dulbeko modificēta īglsa vidē, Millipore) kultivēšanas vidē, kas papildināta ar 10 % liellopa fetālo serumu un 100 u/ml penicilīnu, 100 pg/ml я
streptomicīnu (Biochrom), 37 °C temperatūrā, 5 % CO2 atmosfērā. Kopējais kultivēšanas vides tilpums - 100 μΐ. Pēc 24 stundu pirmsinkubēšanas mikroplatēs HaCaT keratinocītiem un dermas fibroblastiem mikroplatēs tika pievienoti D.ruyschiana šūnu biomasas ekstrakti. Šūnu dalīšanās aktivitātes izmaiņas tika analizētas 72 stundu periodā HaCaT šūnu kultūrā un 48 stundu periodā dermas fibroblastu kultūrā. 0,25 % D.ruyschiana šūnu biomasas ekstrakta klātbūtnē proliferācija pieauga par 24 %, salīdzinot ar šķīdinātāja kontroli pirmo 24 kultivēšanas stundu laikā. Pozitīvā ietekme uz šūnu dalīšanos tika novērota arī pēc 48 stundām un 72 stundām. Dermas fibroblastu gadījumā ekstrakts stimulēja proliferāciju par 15 % 48 stundu kultivēšanas laikā.
[028] Melanīna satura analīze melanocītos
Melanīna satura izmaiņas tika analizētas FM-55 un B16 melanocītu šūnu līnijās. Šūnas tika inkubētas DMEM (Dulbeko modificēta īglsa vidē, Millipore) kultivēšanas vidē, kas papildināta ar 10 % liellopa fetālo serumu un 100 u/ml penicilīnu, 100 pg/ml streptomicīnu (Biochrom), 37 °C temperatūrā, 5 % CO2 atmosfērā. Melanīna produkcija tika stimulēta, 24 stundas pirms D.ruyschiana šūnu biomasas ekstrakta pievienošanas pievienojot melanocītiem 0,2 mM L-tirozīnu. Melanocīti tika inkubēti ar D.ruyschiana ekstraktiem 48 stundas. Pēc inkubācijas melanocīti tika lizēti ar 1N NaOH, un melanīna saturs tika noteikts spektrofotometriski pie viļņa garuma 405 nm. Izgudrotāji negaidīti novēroja, ka D.ruyschiana biomasas ekstrakta klātbūtnē melanīna saturs samazinājās par 41 % FM-55 šūnu līnijā un par 26 % B16 šūnu līnijā - šīs inhibējošās aktivitātes līmenis ir salīdzināms ar tādu, ko iegūst, šūnām pievienojot tīru kodžikskābi.
[029] Kollagēna I un matrices metalloproteināzes 1 (MMP-1} ekspresija
Kolagēna I un MMP-1 gēnu ekspresijas izmaiņas tika analizētas dermas šūnu kultūrā D.ruyschiana šūnu biomasas ekstrakta klātbūtnē. Dermas fibroblasti tika kultivēti DMEM (Dulbeko modificēta īglsa vidē, Millipore) kultivēšanas vidē, kas papildināta ar 10 % liellopa fetālo serumu un 100 u/ml penicilīnu, 100 pg/ml streptomicīnu (Biochrom), 37 °C temperatūrā, 5 % CO2 atmosfērā līdz konfluencei 70 %. D.ruyschiana šūnu biomasas ekstrakts tika pievienots dermas fibroblastu kultūrai un veikta inkubācija 48 stundu periodā. Pēc inkubācijas šūnas tika lizētas ar Trizol reaģentu RNS izdalīšanai. 1 pg RNS tika apstrādāts ar DNāzi I, kam sekoja komplementārās DNS (kDNS) sintēze. Tika veikta reālā laika kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcijas (RT-qPCR) analīze, lai relatīvi kvantitētu kolagēna I un MMP-1 gēnu ekspresijas izmaiņas. Relatīvā gēnu ekspresijas izmaiņu kvantitēšana tika veikta, izmantojot Livak, Schmittgen 2001 2’ длст metodi. Kolagēna I (collAl) un mmp-1 matricas RNS (mRNS) daudzums tika normalizēts pret pastāvīgi ekspresēto gēnu rpsl3 (ribosomālā proteīna 13) un hprtl (hipoksantīna fosforiboziltransferāzes) mRNS. Relatīvās kolagēna I un MMP-1 gēna ekspresijas izmaiņas paraugos, kam pievienots ekstrakts, tika salīdzināts ar katra gēna ekspresiju atbilstošajos kontroles paraugos (Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)J Method. Methods. 2001 Dec;25(4):402-8). Izgudrotājiem negaidīti D.ruyschiana šūnu biomasas ekstrakts stimulēja kolagēna I ekspresiju atkarībā no testētās devas, turklāt tika novērots ievērojams samazinājums (>65 %) kolagēna noārdošās matrices metalloproteināzes I ekspresijā. Kolagēna I ekspresijas pieaugums un MMP-1 ekspresijas nomākšana liecina par D.ruyschiana šūnu biomasas ekstrakta kā aktīvās vielas pielietojamību atjaunojošos ādas kopšanas produktos.
[030] D.ruyschiana šūnu biomasas ekstraktu saturošu kosmētikas produktu kompozīcju piemēri.
Zemāk norādīti piemēri sejas ādas kopšanas kosmētikas produktu gala kompozīcijām, kas satur D.ruyschiana šūnu biomasas ekstraktu.
[031] 1.Piemērs - atjaunojošs sejas krēms
| Sastāvdaļa | Tilpums % | |
| a) | Ūdens | 59,80% |
| b) | Vītis vinifera (Vīnogu) sēkliņu eļļa Kapril/kapric triglicerīdi Olivem-100 (ceateril-olivāts, sorbitān-olivāts) Cetilalkohols | 20% 12% 4% 2% |
| c) | D.ruyschiana šūnu biomasas ekstrakts Tokoferola acetāts Kālija sorbāts Glukonolaktors, nātrija benzoāts | 1% 0,5% 0,3% 0,4% |
Sastavdaļa a) tiek uzsildīta līdz 65 °C; b) tiek uzsildīta līdz 65 °C līdz emulgējošie vaski ir pilnībā izkusuši un tad, intensīvi maisot, tiek pievienoti a), lai izveidotos emulsija. Maisīšana tiek turpinātā hdz krēms ir atdzisis līdz temperatūrai 35 °C. Maisījumam tiek pievienots c), maisot, līdz krēms ir pilnībā homogenizēts.
[032] 2.piemers - reģenerejošs serums ādai ap acīm
| Sastāvdaļas | Tilpums, % | |
| a) | Ūdens | 73,53% |
| b) | Skvalēns Kokokaprilāts Olivem-100 (ceateril-olivāts, sorbitān-olivāts) Cetilalkohols | 10% 10% 3% 2% |
| c) | D.ruyschiana šūnu biomasas ekstrakts Tokoferola acetāts Kālija sorbāts Glukonolaktors, nātrija benzoāts Ubikvinons | 0,25% 0,5% 0,3% 0,4% 0,02% |
Sastāvdaļa a) tiek uzsildīta līdz 65 °C; b) tiek uzsildīta līdz 65 °C līdz emulgējošie vaski ir pilnībā izkusuši un tad, intensīvi maisot, tiek pievienoti a), lai izveidotos emulsija. Maisīšana tiek turpināta līdz krēms ir atdzisis līdz temperatūrai 35 °C. Maisījumam tiek pievienots c), maisot, līdz krēms ir pilnībā homogenizēts.
Claims (11)
- Pretenzijas1. Ādu atjaunojoša un aizsargājoša kosmētikas aktīvā viela, kas ir standartizēts šūnu biomasas ekstrakts, kurš iegūts no in vitro pavairotas augu šūnu biomasas, kur minētās in vitro pavairotās augu šūnas ir nediferencētas D.ruyschiana kallusa šūnas.
- 2. Aktīvā viela atbilstoši 1. pretenzijai, kur minētie kallusi ir audzēti uz cietas kultivēšanas barotnes virsmas vai nu tumsā, vai 14-16 stundu gaismas fotoperiodā.
- 3. Aktīvā viela atbilstoši 1. pretenzijai, kas ir iegūta no D.ruyschiana suspensijas šūnu kultūras, kur šūnas tiek audzētas šķidrā kultivēšanas barotnē vai nu tumsā, vai 14-16 stundu gaismas fotoperiodā.
- 4. Metode ādu atjaunojošas un aizsargājošas kosmētikas aktīvās vielas sagatavošanai atbilstoši jebkurai no iepriekšnorādītajām pretenzijām, kas sastāv no sekojošiem secīgiem soļiem:(i) in vitro pavairotas nediferencētas D.ruyschiana kallusa šūnas tiek audzētas uz cietas barotnes vai šķidrā kultivēšanas barotnē, (ii) D.ruyschiana kallusa šūnu biomasa tiek atdalīta no kultivēšanas vides, (iii) Šūnu biomasa tiek ekstraģēta ar etanolu koncentrāciju diapazonā no 30 % līdz 70 %, vai arī ar etanola, glicerīna un ūdens maisījumu, kur etanola, glicerīna un ūdens attiecības ir diapazonā no 20 %/20 %/60 % līdz 50 %/50 %/0 % (v/v/v), un biomasas attiecība pret šķīdinātāju ir diapazonā no 1:3 līdz 1:10 (w/v).
- 5. Metode atbilstoši 4. pretenzijai, kur šūnas atbilstoši solim (i) tiek audzētas tumsā.
- 6. Metode atbilstoši 4. pretenzijai, kur šūnas atbilstoši solim (i) tiek audzētas 14-16 stundu gaismas fotoperiodā.
- 7. Metode atbilstoši 5. un 6. pretenzijai, kur metode papildus ietver soli (iv) ekstraktu, kas iegūts no šūnām, kas kultivētas tumsā un ekstraktu, kas iegūts no šūnām, kas kultivētas 14-16 stundu gaismas fotoperiodā, kombinēšanu, kur ekstraktu savstarpējā attiecība ir diapazonā no 1:1 līdz 1:5 (v/v).
- 8. Metode atbilstoši jebkurai no iepriekšminētajām pretenzijām, kur D.ruyschiana biomasa, kas atdalīta no kultivēšanas vides solī (ii), tiek liofilizēta un sekojoši ekstraģēta kā aprakstīts solī (iii) ar etanolu koncentrāciju diapazonā no 30 % līdz 70 %, vai arī ar etanola, glicerīna un ūdens maisījumu, kur etanola, glicerīna un ūdens attiecības ir diapazonā no 20 %/20 %/60 % līdz 50 %/50 %/0 % (v/v/v), un liofilizētās biomasas attiecība pret šķīdinātāju ir diapazonā no 1:50 līdz 1:100 (w/v).
- 9. Aktīvās vielas izmantošana atbilstoši no 1. līdz 3. pretenzijai kosmētisko kompozīciju sagatavošanā.
- 10. Aktīvās vielas izmantošana atbilstoši 9. pretenzijai koncentrāciju diapazonā no 0,25 % līdz 2 %.
- 11. Aktīvās vielas izmantošana atbilstoši 9. vai 10. pretenzijai, kur kafijskābes atvasinājumu saturs aktīvajā vielā ir diapazonā no 45 % līdz 70 % no kopējā flavonoīdu satura ekstraktā.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LVP-18-20A LV15436B (lv) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | Ādu atjaunojoša un aizsargājoša kosmētikas aktīvā viela no dracocephalum ruyschiana ģints nediferencētu šūnu biomasas un tās sagatavošanas paņēmiens |
| PCT/IB2019/052083 WO2019175829A1 (en) | 2018-03-16 | 2019-03-14 | A skin regenerating and skin protecting cosmetic active ingredient from undifferentiated cell biomass from genus dracocephalum ruyschiana and a method for its preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LVP-18-20A LV15436B (lv) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | Ādu atjaunojoša un aizsargājoša kosmētikas aktīvā viela no dracocephalum ruyschiana ģints nediferencētu šūnu biomasas un tās sagatavošanas paņēmiens |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LV15436A LV15436A (lv) | 2019-09-20 |
| LV15436B true LV15436B (lv) | 2020-02-20 |
Family
ID=62598011
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LVP-18-20A LV15436B (lv) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | Ādu atjaunojoša un aizsargājoša kosmētikas aktīvā viela no dracocephalum ruyschiana ģints nediferencētu šūnu biomasas un tās sagatavošanas paņēmiens |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| LV (1) | LV15436B (lv) |
| WO (1) | WO2019175829A1 (lv) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BG67493B1 (bg) | 2020-03-19 | 2023-01-31 | "Инова Бм" Оод | Стандартизиран растителен екстракт от биомаса на инвитро култури, метод за неговото получаване и използване |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107382729A (zh) * | 2017-08-11 | 2017-11-24 | 四川省中医药科学院 | 一种从唇形科植物中提取迷迭香酸的方法及制备的药物 |
-
2018
- 2018-03-16 LV LVP-18-20A patent/LV15436B/lv unknown
-
2019
- 2019-03-14 WO PCT/IB2019/052083 patent/WO2019175829A1/en active Application Filing
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| "No Dracocephalum ruyschiana L. iegutu biologiski aktivo vielu adu balinoso ipasibu novertejums in vitro", 2 July 2016, article ELZA KAKTINA: "No Dracocephalum ruyschiana L. iegutu biologiski aktivo vielu adu balinoso ipasibu novertejums in vitro", XP055492412 * |
| C. MAGNANI ET AL: "Caffeic acid: a review of its potential use in medications and cosmetics", ANALYTICAL METHODS, vol. 6, no. 10, 1 January 2014 (2014-01-01), GBR, pages 3203 - 3210, XP055492429, ISSN: 1759-9660, DOI: 10.1039/C3AY41807C * |
| ERDENECHIMEG SELENGE ET AL: "Flavone Tetraglycosides and Benzyl Alcohol Glycosides from the Mongolian Medicinal Plant Dracocephalum ruyschiana", JOURNAL OF NATURAL PRODUCTS., vol. 76, no. 2, 28 January 2013 (2013-01-28), US, pages 186 - 193, XP055492237, ISSN: 0163-3864, DOI: 10.1021/np300609u * |
| GAH BOR JANICSAH ET AL: "Comparative studies of the rosmarinic and ca!eic acid contents of Lamiaceae species", BIOCHEMICAL SYSTEMATICS AND ECOLOGY, vol. 27, 1 January 1999 (1999-01-01), pages 733 - 738, XP055492690 * |
| SONIA TREHAN ET AL: "Plant stem cells in cosmetics: current trends and future directions", FUTURE SCIENCE OA, vol. 3, no. 4, 1 November 2017 (2017-11-01), pages FSO226, XP055492446, DOI: 10.4155/fsoa-2017-0026 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2019175829A1 (en) | 2019-09-19 |
| LV15436A (lv) | 2019-09-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chaudhary et al. | Syzygium cumini (L.) Skeels: A potential source of nutraceuticals | |
| Saiman et al. | Induction, characterization, and NMR-based metabolic profiling of adventitious root cultures from leaf explants of Gynura procumbens | |
| EP2319914A1 (en) | Preparation and use of plant meristem cells with a high content of caffeic acid derivatives | |
| Sahraroo et al. | In-vitro callus induction and rosmarinic acid quantification in callus culture of Satureja khuzistanica Jamzad (Lamiaceae) | |
| CN102821750B (zh) | 从去分化的、非诱发的刺阿甘树细胞的体外培养物产生的制剂、其用于治疗皮肤老化、炎症和疤痕的用途及其生产 | |
| Yusuf et al. | Existence of bioactive flavonoids in rhizomes and plant cell cultures of'Boesenbergia rotund'(L.) Mansf. Kulturpfl. | |
| Wang et al. | Influence of attenuated reflected solar radiation from the vineyard floor on volatile compounds in Cabernet Sauvignon grapes and wines of the north foot of Mt. Tianshan | |
| Serrano-Díaz et al. | Cytotoxic effect against 3T3 fibroblasts cells of saffron floral bio-residues extracts | |
| Levine et al. | Physiologic and metabolic responses of wheat seedlings to elevated and super-elevated carbon dioxide | |
| Trentini et al. | Elicitation of phenylpropanoids in maqui (Aristotelia chilensis [Mol.] Stuntz) plants micropropagated in photomixotrophic temporary immersion bioreactors (TIBs) | |
| Solis-Castañeda et al. | Identification and quantitative determination of feruloyl-glucoside from hairy root cultures of Turbinicarpus lophophoroides (Werderm.) Buxb. & Backeb.(Cactaceae) | |
| LV15436B (lv) | Ādu atjaunojoša un aizsargājoša kosmētikas aktīvā viela no dracocephalum ruyschiana ģints nediferencētu šūnu biomasas un tās sagatavošanas paņēmiens | |
| Sequeida et al. | Production of phenolic metabolites by Deschampsia antarctica shoots using UV-B treatments during cultivation in a photobioreactor | |
| Suryawanshi et al. | Systematic enhancement of l-DOPA and secondary metabolites from Mucuna imbricata: Implication of precursors and elicitors in Callus culture | |
| Frassanito et al. | On-line identification of secondary metabolites in freshwater microalgae and cyanobacteria by combined liquid chromatography–photodiode array detection-mass spectrometric techniques | |
| Thakore et al. | Yield enhancement strategies for enhancement of indole alkaloids in hairy root cultures of Catharanthus roseus | |
| EP3897683B1 (en) | Cosmetic, pharmaceutical and nutraceutical use of an extract derived from cannabis sativa cell cultures | |
| Jain et al. | In Vitro Production of Essential Oil from Proliferating Shoots of Rosmarinus officinalis1 | |
| Zagoskina et al. | The effects of cold acclimation of winter wheat plants on changes in CO 2 exchange and phenolic compound formation | |
| JP6957529B2 (ja) | オジギソウの未分化細胞の抽出物および皮膚科学的組成物におけるその使用 | |
| Gercek et al. | Comparison of polyphenolic profile and antioxidant capacity of Prunus subgenus Cerasus L. species from Turkey | |
| Khashan et al. | Vinblastine and vincristine alkaloids production from callus of Catharanthus roseus (L.) G. Don under some abiotic factors | |
| O Osuji et al. | Biotechnological induction of shikimate-based antioxidant accumulation in Phyla dulcis | |
| KR20090115070A (ko) | 식물체 다니엘리아 올리베리의 삼출물의 추출물의 화장품 분야, 특히 항주름제로서의 용도 | |
| Mynarski et al. | Phenolic acid LC/MS profile of Chenopodium rubrum and evaluation of cytotoxic activity |