JP2013523691A - アルガンの木の脱分化した誘発されていない細胞のインビトロ培養物から生成される調製物、皮膚老化、炎症および瘢痕を処置するためのその使用、ならびにその製造 - Google Patents
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Abstract
Description
a)植物材料の滅菌、
b)細胞の脱分化、
c)エリシターを含まない培養培地での細胞懸濁液の調製
d)エリシターを含まない培養培地でのバイオマスの増殖および生産培養、
ならびに調製物の取得。
1.非連続培養またはバッチ培養、
2.再投入/回収または流加培養、および
3.連続培養。
Argania spinosaの外植片、より詳細には葉外植片を採取し、次亜塩素酸ナトリウムもしくは次亜塩素酸カルシウムの溶液または塩化水銀の溶液を用いて、外界温度において数分間除染する。その組織を、滅菌蒸留水ですすぎ、次いで、除染の終わりに滅菌蒸留水で少なくとも1回洗浄する。
除染された外植片を、層流フード下において、スクロースおよび成長因子(またはホルモン)が添加されたMurashige&Skoog寒天栄養培地と接触させて置く。これらの成長ホルモンは、細胞分裂を引き起こすため、および細胞クラスターまたは脱分化したカルス(カルス形成)を引き起こすために外植片の細胞機構を調節する。得られたカルスは、3〜4週間ごとに新しい脱分化栄養培地に移される。この培地のいくつかの寒天が豊富な成分は、カルスによって代謝されることがあるか、または空気の作用によって分解されることがある。
寒天培地上のカルスをその後移動させるための細胞の脱分化によって、もろいカルスが形成する。この細胞間の接着の低下は、植物に応じて2〜6ヶ月間に起き得る、脱分化の結果である。この状態は、誘導される機械的ストレスを最小にしつつ、細胞懸濁液中でのカルスの崩壊を保証するものであるので、液体培地に移すのに好ましい。したがって、もろいカルスの一群が、脱分化寒天培地と同じであるがゲル化剤を含まない処方を用いて調製された液体栄養培地中に導入される(10〜20体積%)。
いくつかのそのような継代培養物を取り出した後、その期間にわたって得られた細胞密度が一定になると、その細胞懸濁液は安定化される。次いで、バイオマスの生産率を最大にするために、培養培地の組成(栄養分、成長因子など)の調整が可能である。本発明の1つの特定の実施形態において、バイオマス生成手段として使用される最適化された培地は、表1に記載された培地である。
−細胞懸濁液(本発明の場合、「細胞懸濁液」とは、その培養培地中の細胞(すなわちバイオマス)のことを指す);
−バイオマス(本発明の場合、「バイオマス」とは、培養培地から分離された細胞クラスター、すなわち、濾過後の細胞懸濁液のことを意味する);
−蒸留水中の懸濁液に戻された後(または戻されない)の粉砕バイオマス;
−粉砕バイオマスの遠心分離または濾過によって精製された液または浮遊物;
−培養浮遊物(本発明の場合、「培養浮遊物」は、培養中の細胞が残存したままの培養培地または細胞外の培地である)
からなり得る。
−内因性および外因性の加齢に関する酸化プロセスならびに炎症性プロセスを制限する抗酸化抗ラジカル活性
−コラーゲンを分解するメタロプロテアーゼの阻害によって、成熟した皮膚の力学的特性(堅さ、弾性、張度)を改善する、細胞外マトリックスに対する活性
を有し得ることも示した。
実施例1:新鮮バイオマス/エルレンマイヤー内で行われるプロセス
好ましくは3〜4月齢のアルガン葉を、いくつかの槽によって順に滅菌する:1分間の70%アルコール、3分間の2%次亜塩素酸ナトリウム、次いで2つの連続する脱塩水槽で8分間および10分間にわたってすすぐ。
実施例2a:乾燥バイオマス/バッチ培養におけるバイオリアクター内で行われるプロセス
実施例1に記載されたように得られた4つの500ml細胞懸濁液エルレンマイヤーを、接種デバイス内でひとまとめにし、それらは、10Lのバイオリアクターに無菌的に注ぎ込まれる2Lの接種材料を形成する。このバイオリアクターは、30mg/Lの予め滅菌された消泡剤によって補完された8Lの最適培地(表1を参照のこと)で満たされ、次いで、冷却され、バイオリアクターケーシング内の閉鎖経路におけるサーモスタット制御型水循環によって29.5℃で維持される。
4つの500ml細胞懸濁液エルレンマイヤーを、実施例2aに記載されたような接種材料として使用した。バイオリアクターは、実施例2aに示されたように調製される。溶解ガス、温度および撹拌制御システムは、実施例2aに示されたように調製される。
4つの500ml細胞懸濁液エルレンマイヤーを、実施例2aに記載されたような接種材料として使用する。バイオリアクターは、実施例2aに示されたように調製される。溶解ガス、温度および撹拌制御デバイスは、実施例2aに示されたように調製される。
実施例2aに記載されたように得られる20gの新鮮粉砕バイオマスを、15分間にわたって10000gで遠心分離し、浮遊物を回収する。次いで、それを凍結乾燥する。
実施例4:H/E処方
化学発光
この方法は、光化学的シグナルによってフリーラジカル(スーパーオキシドラジカルO2 O−)を発生する。酸化の強度は、通常の条件下で得られる強度よりも1000倍高い。検出は、化学発光によって行われ、それを用いることにより、脂溶性または水溶性の抗酸化抽出物または抗酸化分子が評価される。結果は、等量のビタミンCまたはトロロクス(6−ヒドロキシ−2,5,7,8−テトラメチルクロマン−2−カルボン酸)として表される。感度は、1ナノモルの程度である。
本研究における抗酸化活性は、化学発光によってスーパーオキシドアニオンを特異的に捕捉する能力に相当する。
細胞外マトリックス(ECM)は、組織に対して構造的な役割および制御する役割を有する動的構造である。細胞外マトリックスは、皮膚に張りおよび力学的特性を与える。表皮では、細胞外マトリックスは、細胞間隙を占め、表皮構造に対して支持を提供する。細胞外マトリックスはまた、表皮細胞間の交換を調節し、細胞活性に関与する。細胞外マトリックスは、繊維(特にコラーゲン)および基本的な物質(水、塩類、糖タンパク質、グリコサミノグリカン)から構成される。コラーゲンは、共有結合性の水素結合によって接続される3つのポリペプチド鎖(同一であっても異なっていてもよい)から形成される繊維状タンパク質である。コラーゲンは、繊維状のネットワークの必須の構成要素を形成し、皮膚に抵抗性および弾性を提供する力学的役割を果たす。
%阻害=100×((最大正味酵素活性−阻害剤の存在下における正味酵素活性)/最大正味酵素活性)
実施例3に従って調製された浮遊物は、60〜500μg/mlにおいて用量依存的にMMP1活性を有意に阻害する。
TGF−β1(トランスフォーミング成長因子−ベータ1)は、種々の細胞型によって分泌され、細胞の成長の調節ならびに複数の細胞反応および生物学的プロセスの制御において重要な役割を果たす、TGF−βのスーパーファミリーに属する。このスーパーファミリーのサイトカインの主な活性は、それらが、ほとんどの細胞の増殖を調節すること、線維芽細胞の増殖を刺激すること、および細胞外マトリックスの形成を増加させることである(Lawrence,1996)。TGF−β1は、特に、細胞骨格(アクチン)の再編成を誘導すること、および上皮細胞の移動を促進すること(Boland et al.,1996)によって、瘢痕形成プロセスである損傷の修復にも関わる(Cullen et al.,1997)。皮膚組織を最も代表する細胞集団は、ケラチノサイト集団である。それは、皮膚細胞すなわち線維芽細胞の挙動を調節し得、それに影響し得る成長因子の重要な供給源を形成する(Ghahary et al.,2001)。
実施例2aに係る誘発されていないバイオマスの生成
誘発されたバイオマスの調製物
成長因子(カイネチンおよび24D)を含まないMurashige&Skoog培地を調製する。KOHを加えることによってこの培地をpH6に調整した後、121℃(p=1bar)で20分間オートクレーブする。次いで、この培地を、増殖培養物に由来する細胞懸濁液を用いて1:5の体積で接種する。その直後に、カイネチンDMSOに6−ベンジルアミノプリン(BAPまたは(N−(フェニルメチル)−7H−プリン−6−アミン)およびエリシター剤(アセチルサリチル酸およびジャスモン酸メチル)の濃縮溶液を無菌的に加えることによって、誘発条件をもたらす。結果は、EMS誘発培地である(表4を参照のこと)。次いで、その誘発された培養物を、115RPMおよび29℃、暗黒下の振盪台上で15日間維持する。次いで、新鮮バイオマスを回収し、ブフナー漏斗上で乾燥した後、粉砕および遠心分離を行い、浮遊物を凍結乾燥することによって安定化する。
実施例9.a:ヒトケラチノサイトの細胞増殖の測定
損傷の瘢痕形成は、組織の正常な修復における多くの局所的および全身性の因子の相互作用を含む複雑かつダイナミックな生物学的プロセスである。瘢痕形成の進行は、4つの相互依存的な段階:止血、炎症、増殖およびリモデリングを含む。増殖は、3つの明らかに観察可能なプロセス、すなわち、肉芽化、収縮および再上皮化を包含する。
用いられる手法は、S期の細胞のDNAへのヌクレオチドチミジンのアナログである5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdU)の取り込みを測定する。
%増殖=(DO(処置)−DO(tコントロールmin))/(DO(tコントロールmax)−DO(tコントロールmin))×100
〔ここで:
コントロールmin=最少培地とともにインキュベートされた細胞
コントロールmax=完全培地とともにインキュベートされた細胞
したがって、コントロールminは、0%増殖に対応し、コントロールmaxは、100%増殖に対応する。〕
装置および方法:HaCaTケラチノサイトの細胞移動
細胞移動を調べるために使用されるプロトコルは、96ウェルキットの使用に基づく。この試験の原理は、ウェル(96ウェルプレート)の中心への細胞の移動を調べることからなる。これを行うために、直径2mmの検出ゾーンが得られるように、各ウェルの中心に妨害物を置く。次いで、HaCaT細胞をこの妨害物の周りに播種する。細胞がその妨害物の周りの表面に十分に結合したら、その妨害物を取り除き、それにより、細胞は検出ゾーンに移動できる。妨害物なし活性成分ありの状態でプレートを、DMEM0%SVF中において37℃で24時間インキュベートする。次いで、細胞の移動を評価するために、妨害物が位置していたゾーンに存在する細胞の量を解析する。その細胞をHoechst33342で標識し、カバーを用いてこのゾーンに存在する細胞だけを観察し、計数する。各条件について、8ウェルを平均する。結果は、
−蛍光強度(IF、移動した細胞の量に比例する)
−コントロール0%SVFに対する活性パーセント:
((IF処理−IF0%移動)/(IFtコントロール0%SVF−IF0%移動))×100
として表され、
ここで:
IF(0%移動)は、妨害物を含むウェルのIF(蛍光強度)、ゆえにバックグラウンドノイズに対応する。
Claims (7)
- 皮膚老化、炎症および瘢痕の処置において使用するための、脱分化した誘発されていないアルガン細胞のインビトロ培養物に由来する調製物。
- 細胞懸濁液、バイオマス、粉砕バイオマス、粉砕バイオマス浮遊物または培養浮遊物の形態の、請求項1に記載の調製物。
- 活性成分として、請求項1または2に記載の誘発されていない脱分化したアルガン細胞の培養物に由来する調製物を、美容上または皮膚科学的に許容される賦形剤とともに含んでなる、美容組成物または皮膚科学的組成物。
- 前記調製物の量が、組成物の総重量の0.1〜10%である、請求項3に記載の組成物。
- 皮膚老化、炎症および瘢痕の処置において使用するための、請求項3または4に記載の組成物。
- 前記調製物を得るための方法であって、以下の工程:
a)植物材料の滅菌
b)細胞の脱分化
c)エリシターを含まない培養培地での細胞懸濁液の調製
d)エリシターを含まない培養培地を用いた、バイオマスの増殖および生産培養、
ならびに前記調製物の取得
を含んでなる、方法。 - 請求項3〜5のいずれか一項に記載の組成物の使用を含む、皮膚老化の美容的処置のための方法。
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