BR112012024630B1

BR112012024630B1 - processos para o tratamento cosmético de envelhecimento da pele

Info

Publication number: BR112012024630B1
Application number: BR112012024630-5A
Authority: BR
Inventors: Nicolas Steward; Anne Mandeau; Nathalie Castex-Rizzi
Original assignee: Pierre Fabre Dermo-Cosmetique
Priority date: 2010-03-31
Filing date: 2011-03-30
Publication date: 2021-03-09
Also published as: JP5964288B2; AU2011234469A1; CA2794115C; TW201201864A; NZ603282A; PL2552401T3; RU2559579C2; AR080816A1; EP2552401A2; AU2011234469B2; WO2011121051A3; CN102821750B; FR2958163A1; KR101838309B1; TWI513474B; KR20130010904A; IL222201A0; FR2958163B1; CN102821750A; ES2648058T3

Abstract

PREPARAÇÃO CRIADA A PARTIR DE UMA CULTURA IN VITRO DE CÉLULAS NÃO ELICITADAS, DESDIFERENCIADAS DA ÁRVORE ARGÂNIA, USO DA MESMA PARA TRATAMENTO DE ENVELHECIMENTO, INFLAMAÇÃO E CICATRIZAÇÃO DA PELE E PRODUÇÃO DA MESMA. A invenção refere-se a uma preparação criada a partir de uma cultura in vitro de células não elicitadas, desdiferenciadas, da árvore de Argânia.

Description

[001] O propósito da presente invenção é uma preparação deri vada de uma cultura in vitro de células de argânia não elicitadas desdi- ferenciadas, uma composição cosmética ou dermatológica compreendendo a dita preparação e seus usos para o tratamento de envelhecimento, inflamação e cicatrização da pele.

[002] A argânia é uma árvore que pertence à família botânica Sapotacea e seu nome científico é Argania spinosa (L.) Scelles.

[003] Seu hábito é similar ao da árvore de oliva; ela tem um tron co curto e torcido. A madeira é muito dura e densa. Os galhos são muito espinhosos e eles têm folhas pequenas, em formato de lança, alternadas, curtas (cerca de 2 cm de comprimento) e estreitas que são frequentemente agrupadas em pencas. As folhas são sempre verdes, mas elas morrem e caem sempre que há uma seca severa. As flores são hermafroditas e pentaméricas. Elas são agrupadas em glomérulos e abrem em maio e junho. Elas são amarelo-acinzentadas.

[004] Uma árvore de argânia pode produzir fruta a partir dos 5 anos de idade. A fruta é uma baga séssil oval, amarela, de cerca de 4 a 5 cm de comprimento. Ela é composta de polpa circundando uma noz contendo 2 a 3 sementes chatas grudadas, cada uma encerrando uma amêndoa rica em óleo.

[005] A Argânia é endêmica do Marrocos e está localizada princi palmente no sudoeste do Marrocos entre Essaouira e Agadir. A flores-ta de argânia cobre cerca de 830 000 ha.

[006] As populações do Marrocos primeiro exploraram a Argânia pela sua madeira particularmente dura como um fornecimento de combustível. O outro uso tradicional principal é óleo inicialmente manualmente extraído, mas agora extraído usando uma prensa. O primei- ro uso deste óleo é para alimento; outra aplicação importante agora é para cosméticos. A polpa e a torta residual derivadas desta produção de óleo são normalmente usadas para ração animal.

[007] Muitos produtos de cosmetologia foram desenvolvidos a partir da Argânia. Há várias patentes de invenção para óleo derivado das sementes, por exemplo, óleo obtido através de solvente (Patente Fr 2 553 788), óleo de argânia enriquecido com matéria não saponifi- cável (Patente Fr 2 724 663).

[008] Substâncias outras que não óleo foram também patentea das, por exemplo, peptídeos derivados de torta de semente obtida após extração de óleo; combinação de óleo e peptídeos da torta para o tratamento de problemas relacionados com envelhecimento da pele (Patente Fr 2 756 183). Há também uma patente de invenção para folhas, proteínas e saponinas de Argânia de torta = Extratos de folhas (Patente EP 1 213 025), proteínas de torta (Patente EP 1 213 024), saponinas de torta (Patente EP 1 430 900). Mais recentemente, o pedido de patente EP 1 968 536 foi depositado revelando o uso de um extrato de polpa de fruta de argânia em cosméticos antienvelhecimen- to.

[009] Desta maneira, a composição da árvore de argânia inteira é interessante para uso dermatológico e/ou cosmético.

[010] A Argânia é uma planta de recurso importante, primeiro ecologicamente porque ela é uma planta de "ecossistema". Ela é per-feitamente adaptada a áreas com secas, ela protege o solo contra erosão pela água e pelo vento e então previne avanço do deserto no Marrocos. Mas também economicamente, porque ela é uma árvore com usos múltiplos.

[011] Ela é a principal cultura do Marrocos. Desta maneira, a flo resta de Argânia foi protegida pelo dahir (decreto) expedido em 1925, declarando que a Nação tem os direitos superiores sobre a floresta de argânia, mas que as populações locais têm os usufrutos (fruto, madeira morta, culturas sob as árvores de argânia). A UNESCO recentemente classificou a floresta de argânia como uma reserva da bioesfe- ra.

[012] Este é o motivo pelo qual o uso de sua madeira ou folhas para uso cosmético poderia ter sérias consequências sobre esta planta protegida.

[013] Outro meio de obtenção de moléculas de interesse a partir de uma planta é preparar culturas de célula desdiferenciada totipoten- te. O uso de células de planta desdiferenciadas pode também evitar alguns problemas de industrialização encontrados durante o desenvolvimento de produtos cosméticos. Com cultura de célula, a diferença na concentração de substâncias de interesse entre bateladas ou colheitas de planta diferentes desaparece. Ela é também uma técnica não destrutiva relativamente fácil e barata de executar. Finalmente, ela elimina a necessidade de extração uma vez que as células estão em um meio de cultura e os compostos ativos estão ou no meio de cultura ou no líquido intracelular. Desta maneira, trituração simples torna esses compostos disponíveis.

[014] O Pedido de Patente WO03077881 revela uma composição para aplicação tópica contendo pelo menos um homogenato de células de planta desdiferenciadas e elicitadas em uma cultura in vitro para sintetizar pelo menos uma fitoalexina. O material de planta é preferivelmente derivado de uma vinha.

[015] Desta maneira, este documento revela a aplicação cosmé tica de células de planta que poderiam ser desdiferenciadas e elicita- das, elicitação levando a uma quantidade suficiente de metabolitos secundários para permitir atividade biológica em uso tópico.

[016] Surpreendentemente e inesperadamente, a Requerente demonstrou que uma preparação derivada de uma cultura in vitro de células de argânia desdiferenciadas, mas não elicitadas, tem atividades cosméticas e/ou dermatológicas boas nos campos de antienvelhe- cimento, inflamação e cicatrização.

[017] Os resultados obtidos mostram que no caso específico de argânia, outra aplicação de culturas de célula de argânia (células não elicitadas neste caso) é possível dentro do contexto mencionado aci-ma.

[018] Ainda, obtenção da preparação conforme revelado na pre sente invenção pode eliminar a necessidade da etapa de elicitação que é uma etapa industrialmente difícil e cara; elicitação leva a um rendimento de biomassa muito menor devido à diminuição de cresci-mento celular.

[019] O Pedido WO03077881 menciona várias maneiras de reali zar esta elicitação, por exemplo, radiação UV por 3 dias; dióxido de carbono por 24 horas a 2 dias; radiação UV e dióxido de carbono por 5 dias.

[020] O processo realizado dentro da estrutura da presente in venção, consistindo em desdiferenciação de célula a partir de material de planta derivado de argânia e então cultura de células em suspensão, pode rapidamente resultar em uma biomassa fina, abundante, homogênea e estéril desta planta. Cultura de célula torna possível aplicar cursos para biossíntese desta planta diretamente em escala celular.

[021] Desta maneira, a presente invenção tem como objetivo uma preparação derivada de uma cultura in vitro de células de argânia não elicitadas desdiferenciadas, uma composição cosmética ou dermatológica incluindo a dita preparação e seus usos em cosmetologia e/ou dermatologia, e preferivelmente para o tratamento de envelhecimento, inflamação e cicatrização de pele.

[022] Com mais frequência, culturas in vitro de tecidos de planta em suspensão provê um meio de produção de compostos orgânicos ativos derivados diretamente do metabolismo primário ou secundário de células.

[023] Células de planta em suspensão estão em um estado de desdiferenciação similar ao estado de células-tronco para culturas de célula animal. Desta maneira, essas células de planta são teoricamen-te capazes de produção de todos os metabolitos observados na planta inteira. Desdiferenciação causa um distúrbio genético ou epigenético de cursos de biossíntese de maneira que os perfis químicos são quantitativamente e qualitativamente diferentes entre a planta inteira e as linhagens de célula resultantes. Desta maneira, teoricamente, intermediários reacionais não observados na planta inteira podem aparecer em suspensão celular. Isto provê uma nova oportunidade de maneira que biodiversidade química "inativa" pode ser acessada.

[024] No presente estado da técnica, em geral as elicitações (química, física, biológica) de cultura de célula podem estimular e produzir mais metabolitos secundários. No processo da requerente de acordo com a invenção, será mostrado agora que, diferente da maioria dos casos, e surpreendentemente, elicitação não é necessária, mas é prejudicial para crescimento da biomassa e para as atividades biológicas requeridas.

[025] Um dos propósitos da presente invenção refere-se à prepa ração derivada de cultura in vitro de células de argânia não elicitadas desdiferenciadas.

[026] "Células de planta desdiferenciadas" refere-se a qualquer célula de planta sem nenhuma natureza de especialização particular, em outras palavras em um estado fisiológico similar a tecidos meris- temáticos da planta no estado natural. Essas células são capazes de viver por si só e não dependem de outras células.

[027] Células de Argania spinosa desdiferenciadas são obtidas de material de planta vivo pego da árvore ou um broto jovem, consistindo em folhas, talos de folha, caule, casca, raiz, fruto, semente, flor e órgãos de flor ou o botão, e mais particularmente de folhas.

[028] O processo para obtenção das culturas de célula desdife- renciada é obtido in vitro através de qualquer método conhecido da-queles versados na técnica, por exemplo, refere-se a Murashige, T., Skoog, F, 1962. "A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures". Physiol. Plant 15: 473-496. / Plant Culture Media, Vol-1 Formulations and Uses E.F. George, D.J.M. Puttock e H.J. George (1987) Exegetics Ltd. Edington, Westbury, Wilts, BA134QG Inglaterra.

[029] A preparação de acordo com a presente invenção pode ser obtida através da realização das etapas que seguem em sequência: a) esterilização do material de planta, b) desdiferenciação das células, c) pôr as células em suspensão com um meio de cultura sem elicitador, d) cultura de propagação e produção de biomassa com um meio de cultura sem elicitador,

[030] e obtenção da preparação.

[031] A preparação pode ser feita em um frasco Erlenmeyer se o objetivo for produzir quantidades pequenas de biomassa ou em um biorreator para quantidades maiores. Por exemplo, a quantidade mé-dia coletada em um Erlenmeyer com 500 ml de suspensão celular são 100 g de biomassa seca (a saber 200 g de biomassa/L de suspensão celular) enquanto a massa seca média coletada em um biorreator de 10 L são 3000 g (300 g/L de biomassa).

[032] Três modos principais são encontrados para a cultura de célula de planta em um biorreator: 1. cultura descontínua ou em batelada, 2. cultura de recarga/coleta ou alimentação em batelada, e 3. cultura contínua. a. Etapa de esterilização de material de planta:

[033] Explantes de Argania spinosa e mais particularmente ex plantes de folha são pegos e descontaminados com soluções de hipo- clorito de sódio ou cálcio ou soluções de cloreto de mercúrio em temperatura ambiente por vários minutos. Os tecidos são enxaguados com água destilada estéril e são então lavados pelo menos uma vez com água destilada estéril no final da descontaminação. b. Etapa de desdiferenciação de célula

[034] Os explantes descontaminados são postos sob uma capela de fluxo laminar em contato com um meio nutriente de ágar Murashige & Skoog ao qual sacarose e fatores de crescimento (ou hormônios) foram adicionados. Esses hormônios do crescimento vão controlar o maquinário celular dos explantes de maneira a causar divisões celulares e causar agrupamentos celulares ou calos diferenciados (calogê- nese). Os calos obtidos serão transferidos para um novo meio nutriente de diferenciação a cada 3 a 4 semanas. Alguns constituintes ricos em ágar deste meio podem ser metabolizados pelos calos ou degradar pela ação do ar.

[035] Em geral, uma composição hormonal baseada em auxina (ácido 2-4 dicloro-fenoxiacético) e citocina (quinetina) foi testada com sucesso para obter desdiferenciação rápida e completa de tecidos na forma de calos friáveis (calogênese) e facilitar a transferência para um meio líquido. Os explantes de folha estéreis podem ser depositados na face adaxial em contato com o meio de ágar composto de um meio Murashige e Skoog (Murashige, T., Skoog, F. 1962. "A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures". Physiol. Plant 15: 473-496) com 30 g/L de sacarose, 8 g/L de ágar, com 0,5 mg/L de quinetina e 0,75 mg/L de aditivos ácido 2-4 dicloro- fenoxiacético (24D) e ajustados para pH 6 antes de 20 minutos na au-toclave a 121° C (1 bar). Placas de Petri contendo explantes são dei-xadas incubar no escuro a 28° C. Os primeiros calos aparecem após 2 semanas. Os calos obtidos são transferidos para um novo meio a cada 3-4 semanas, dividindo os calos com um escalpe para manter um tamanho de 2 a 3 cm. Essas transferências continuam por 2 a 6 meses até que calos friáveis sejam obtidos. c. Etapa para criar suspensão celular em meio de cultura sem elicita- dor

[036] Desdiferenciação celular para transferências sucessivas de calos em um meio de ágar leva à formação de calos friáveis. Esta queda na coesão entre as células é uma consequência da desdiferen- ciação que pode ocorrer entre dois e seis meses dependendo da plan-ta. Este estado é favorável para a transferência para um meio líquido porque ele garante desintegração do calo em suspensão de célula en-quanto minimizando os estresses mecânicos induzidos. Desta manei-ra, um acúmulo de calos friáveis é introduzido (10-20% em volume) no meio de nutriente líquido preparado usando a mesma formulação que o meio de diferenciação de ágar, mas sem um agente de geleificação.

[037] Os calos friáveis são então desintegrados em um meio lí quido pela ação de uma mesa de agitação por 2 a 3 dias e a suspen-são celular obtida é livrada de todas as partes do calo não desintegra-das, desta maneira formando uma suspensão de célula homogênea. Esta suspensão é mantida em cultura para obter uma população de célula suficientemente densa. Neste estágio, a suspensão é (subcultu- rada) ou diluída no meio nutriente novo e a cultura é iniciada da mesma maneira.

[038] Uma suspensão de célula inicial pode ser iniciada através da deposição de cerca de 20 a 40 g de calos friáveis em um Erlenme- yer de 500 ml contendo 200 ml de meio. Os calos friáveis são então desintegrados em um meio líquido pela ação de uma mesa de agita-ção por 2 a 3 dias a 115 rpm no escuro a 29° C. O material flutuante de célula é então coletado usando uma pipeta, deixando os agrupa-mentos de calos residuais não desintegrados separados. O material flutuante de célula então forma uma suspensão de célula homogênea. Esta suspensão é mantida em cultura para obter uma população de célula "suficientemente" densa. A suspensão de célula obtida é cultivada por 15 dias e é então propagada pela diluição 1:5 em um novo meio com a mesma duração. Ajustes na composição do meio de cultura (nutrientes, fatores de crescimento, etc) foram feitos de maneira a maximizar a produtividade da biomassa. O resultado é o meio de propagação de biomassa ARGMS (vide Tabela 1) otimizado para a suspensão de célula líquida. Este meio é uma versão modificada do meio Murashige & Skoog para calogênese. Este meio é ajustado para pH 6 através da adição de KOH seguido por 20 minutos na autoclave a 121° C (p=1 bar) ou uma filtragem com esterilização a 0,2 μm. Tabela 1: Meio ARGMS que é uma versão modificada do meio Muras- hige & Skoog (ARGMS) usado para cultura de células de argânia em suspensão em Erlenmeyer ou biorreator sob condições ótimas.

d. Cultura de propagação e produção de biomassa com um meio de cultura sem elicitador

[039] Após absorver várias de tais subculturas, a suspensão celu lar é estabilizada quando a densidade de célula obtida durante o período é constante. Ajustes da composição do meio de cultura (nutrientes, fatores de crescimento, etc) são então possíveis a fim de maximizar a produtividade da biomassa. Em uma modalidade particular da invenção, o meio otimizado usado como o meio de produção de biomassa é o meio descrito na Tabela 1.

[040] A suspensão de célula é filtrada para separá-la do meio ex- tracelular ou material flutuante de cultura e a biomassa coletada é posta de volta em suspensão em água destilada e triturada a 0o C. O ho- mogenato obtido é seco por congelamento ou centrifugado de maneira a clarificá-lo antes de ser seco por congelamento.

[041] A cultura celular sob condição "ótima" então criada é estabi lizada e é mantida em um Erlenmeyer (cultura de propagação) com uma diluição 1:5 da suspensão celular a cada 15 dias, isto é equiva-lente a uma cultura de célula de cerca de 60 g/L de biomassa fresca inoculada que produz uma suspensão de célula de cerca de 300 g/L após 15 dias de cultura, ou inoculada em um biorreator dependendo das necessidades.

[042] A preparação obtida ou em Erlenmeyer ou em um biorrea- tor pode consistir em: - uma suspensão de célula (para os propósitos da presente invenção, "suspensão de célula" refere-se a células (a saber biomassa) em seu meio de cultura); - biomassa (para os propósitos da presente invenção, "bio-massa" significa um agrupamento celular separado do meio de cultura, a saber a suspensão de célula após filtragem); - moer a biomassa depois de pôr de volta (ou não pôr de volta) em suspensão em água destilada; - um suco clarificado ou material de flutuação de biomassa moído através de centrifugação ou filtragem; - um material de flutuação de cultura (para os propósitos da presente invenção, um "material de flutuação de cultura" é o meio de cultura onde as células permaneceram em residência durante a cultura, ou meio extracelular).

[043] Sem importar se a suspensão de célula, biomassa ou mate rial de flutuação de biomassa moído está envolvido, ele pode ser mantido sem modificação em forma congelada ou através da adição de substâncias de conservação tal como fenoxi-2-etanol, álcool benzílico ou qualquer outro produto de conservação que apareça no Apêndice VI na instrução EU de produtos cosméticos intitulada "Lista de agentes de conservação que podem estar presentes em cosméticos". Eles podem ser também diluídos em um meio cosmetologicamente aceitável tal como glicol (propileno glicol, butileno glicol, polietileno glicol, etc) em proporções variando de 10 a 60%. A suspensão celular ou a biomassa pode também ser moída e então conservada congelada ou através da adição de substâncias ou meio de conservação conforme descrito acima.

[044] Moído ou não, a suspensão de célula, a biomassa ou o ma terial de flutuação de biomassa pode ser também seco através de se-cagem por congelamento ou atomização e mantido desta maneira ou seco em um meio tipo maltodextrina, lactose ou sílica ou qualquer outro meio cosmetologicamente aceitável.

[045] Finalmente, a suspensão de célula pode ser enriquecida com compostos úteis através de cromatografia por afinidade: absorção em resina (copolímeros de poliestireno tipo Amberlite® XAD®-21a, etc) e eluição com um solvente apropriado tal como etanol.

[046] Biomassa fresca obtida com o processo de acordo com a presente invenção representa cerca de 100 a 500 g por litro de sus-pensão, e mais preferivelmente entre 200 e 350 g por litro de suspensão nos dados de coleta ótimos (a saber cerca de 15 dias em média).

[047] A tabela que segue expressa os rendimentos obtidos (ren dimento em gramas de produto obtido/L de suspensão de célula):

[048] A presente invenção refere-se também a uma composição cosmética ou dermatológica compreendendo uma preparação derivada de uma cultura de células de argânia desdiferenciadas não elicita- das como o constituinte ativo, conforme acima descrito.

[049] Preferivelmente, a quantidade da dita preparação está entre 0,1 e 10% do peso total da composição. E com mais preferência ainda, a dita quantidade de extrato é entre 0,2% e 5%.

[050] A composição cosmética de acordo com a presente inven ção pode estar vantajosamente em qualquer forma galênica normalmente usada nos cosméticos para uma aplicação tópica ou oral, e preferivelmente uma aplicação tópica. Para uma administração através do curso tópico, a forma galênica pode ser um creme, um gel, um unguento ou um spray. A fórmula oral é escolhida a partir do grupo compreendendo comprimidos, cápsulas e pós para suspensões para beber.

[051] A composição cosmética de acordo com a invenção tam bém compreende os excipientes cosmeticamente compatíveis co-muns.

[052] Os excipientes comuns compatíveis com a composição cosmética podem ser qualquer excipiente dentre aqueles conhecidos daqueles versados na técnica, de maneira a obter uma composição cosmética para uma aplicação tópica em formas tais como aquelas descritas acima.

[053] A composição cosmética e/ou dermatológica de acordo com a invenção também pode conter em particular aditivos e auxiliares de formulação tais como tensoativos tipo emulsificante, de limpeza, de formação de espuma, etc, agentes de complexação, espessantes, agentes de geleificação, estabilizadores, agentes de conservação incluindo antimicrobianos e antioxidantes, condicionadores, acidificado- res, agentes de alcalinização, amaciantes, solventes, agentes de colo- ração e fragrâncias.

[054] Os inventores também mostraram que preparações deriva das de células de argânia não elicitadas desdiferenciadas podem ter as atividades que seguem: - atividade antioxidante, anti-radical livre para limitar o processo de oxidação relacionado com envelhecimentos intrínseco e extrínseco e os processos inflamatórios. - atividade sobre a matriz extracelular para aperfeiçoar as propriedades mecânicas da pele madura (firmeza, elasticidade, tonicidade) através da inibição de metaloproteases de degradação de colá- geno.

[055] Finalmente, a presente invenção refere-se a uma composi ção revelada aqui para o tratamento de envelhecimento, inflamação e cicatrização da pele.

[056] Os exemplos que seguem são dados como exemplos não limitantes.

[057] Exemplos para produção da preparação de acordo com a presente invenção:

Exemplo 1: biomassa fresca / processo feito em um Erlenmeyer

[058] Folhas de argânia de preferivelmente 3 a 4 meses de vida são esterilizadas através de vários banhos em sequência: álcool 70% por 1 minuto; hipoclorito de sódio 2% por 3 minutos e então enxaguadas com dois banhos de água desmineralizada sucessivos durando 8 minutos e 10 minutos.

[059] Explantes de folha esterilizada são depositados em uma face adaxial em contato com o meio de ágar composto de um meio Murashige e Skoog (Murashige, T., Skoog, F. 1962. "A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures". Physiol. Plant 15: 473-496) com 30 g/L de sacarose, 8 g/L de ágar, complementado com 0,5 mg/L de quinetina e 0,75 mg/L de ácido 2,4 dicloro- fenoxiacético (2.4-D) e ajustado para pH 6 antes de 20 minutos de autoclave a 121° C (1 bar). As placas de Petri contendo explantes são deixadas incubar no escuro a 28° C e propagadas até calos friáveis e estabilizados serem obtidos.

[060] A suspensão de célula inicial é criada através de deposição de cerca de 40 g de calos friáveis em um frasco Erlenmeyer de 500 ml contendo 200 ml de meio de autoclave, para o qual a composição é descrita na Tabela 1 mencionada acima.

[061] A cultura é deixada por uma semana em uma mesa de agi tação a 115 RPM no escuro a 29° C. O material flutuante da célula é então coletado com a pipeta, deixando agrupamentos residuais de calos. A suspensão de célula obtida é cultivada por 15 dias e é então propagada por diluição 1:5 no meio novo com a mesma duração.

[062] A suspensão é então filtrada sob um vácuo e a biomassa é recuperada. O rendimento de biomassa fresca obtida é 168 g/L.

[063] A biomassa é mantida a -20° C.

Exemplo 2: biomassa seca Exemplo 2a: biomassa seca / processo feito em biorreator em cultura de batelada

[064] Quatro Erlenmeyers de suspensão de célula de 500 ml ob tidos conforme descrito no Exemplo 1 são postos juntos em um dispositivo de inoculação e formam um inóculo de 2 L que é despejado estéril em um biorreator de 10 L. Este biorreator é cheio com 8 L de meio ótimo (vide Tabela 1), complementado por 30 mg/L de antiespumante previamente esterilizado, então esfriado e mantido a 29,5° C através de circulação de água controlada por termostato em um circuito fechado no alojamento do biorreator.

[065] Uma sonda de oxigênio é calibrada através de saturação e insere dados em um dispositivo de regulagem de pO2 computadorizado em tempo real. Este dispositivo mantém o pO2 a 80% através de injeção de oxigênio puro estéril no sistema de aeração. Este biorreator é também equipado com um dispositivo de medição on line de CO2 nos gases efluentes (head space) que ao mesmo tempo insere dados em um dispositivo de regulagem de pCO2 computadorizado para manter pCO2 a 6%. Isto é feito através de injeção de ar atmosférico estéril no dispositivo de aeração misturado com oxigênio. O biorreator é também equipado com um sistema de agitação tipo propelente girando a 75 RPM, para agitar a suspensão de célula e prevenir que ela sedimente. Um dispositivo automático é instalado no lado externo do bior- reator, para permitir amostragem e monitoramento estéreis da biomassa.

[066] A cultura de batelada é mantida sob essas condições de temperatura constante e gás dissolvido por 15 a 17 dias, para atingir uma densidade de célula de 280 a 320 g/L de biomassa fresca. O bior- reator é esvaziado após esta cultura de batelada ser completada, e a biomassa é coletada através de filtragem em um filtro usando um funil Büchner.

[067] A biomassa fresca coletada dissolvida no mesmo volume de água destilada é moída fria usando um "limpador ultrassônico", e então seca por congelamento. Exemplo 2b: biomassa seca / processo feito em biorreator em cultura de alimentação em batelada 10.0.0.1

[068] Quatro Erlenmeyers de suspensão de célula de 500 ml fo ram usados como inóculo conforme descrito no Exemplo 2a. O bior- reator é preparado conforme indicado no Exemplo 2a. Sistemas de regulação de gás dissolvido, temperatura e agitação são preparados conforme indicado no Exemplo 2a.

[069] A cultura inicial é mantida sob essas condições de tempera tura constante e gás dissolvido por 15 a 17 dias até que uma densidade de célula de 280 a 320 g/L de biomassa fresca seja obtida. 80% do teor do biorreator de 10L são removidos após esta cultura inicial ser completada. 8 L de suspensão de célula são então coletados. A biomassa nesta suspensão é coletada através de filtragem em um filtro usando um funil Büchner. 2240 g a 2560 g de biomassa fresca são coletados. A biomassa fresca coletada dissolvida no mesmo volume de água destilada é moída quando fria usando um limpador ultrassônico e é então seca por congelamento. 100 a 130 g de biomassa seca por congelamento são obtidos.

[070] Ao mesmo tempo que a coleta parcial de 80% é feita, 8 L de meio ARGMS previamente autoclavado e esfriado são despejados no biorreator então contendo 2 L de suspensão de célula, de maneira a restaurar o volume de cultura para 10 L. A cultura de alimentação em batelada é mantida sob essas condições de temperatura constante e gás dissolvido por 5 a 7 dias até que uma densidade de célula de 280 a 320 g/L de biomassa fresca seja atingida. Esta cultura é mais rápida (maior produtividade) do que a cultura inicial porque a biomassa está em um estado de divisão de célula fisiológico sustentado de maneira que despejo de meio nutriente novo é caracterizado por uma fase de latência de menos do que 24 horas e uma expansão imediata da biomassa. No final desta cultura de alimentação em batelada, 80% do biorreator de 10 L são removidos. 8 L de suspensão de célula são então coletados. A biomassa desta suspensão é coletada através de filtragem em um filtro usando um funil Büchner. A cultura é então reiniciada como antes. Exemplo 2c: biomassa seca / processo realizado em biorreator de cultura contínua

[071] Quatro Erlenmeyers de suspensão de célula de 500 ml são usados como inóculo conforme descrito no Exemplo 2a. O biorreator é preparado conforme indicado no Exemplo 2a. Os dispositivos de regu- lagem de gás dissolvido, temperatura e agitação são preparados con- forme descrito no Exemplo 2a.

[072] A cultura inicial é mantida sob essas condições de tempera tura constante e gás dissolvido por 10 dias, até uma densidade de célula de 150 g/L e uma taxa de crescimento de biomassa fresca instantânea de 0,2 d-1 serem atingidas. Neste estágio, 1,2% do teor do bior- reator de 10 L é removido a cada 1 hora e 20 minutos. Essas amostras são automaticamente compensadas despejando o mesmo volume de meio ARGMS novo no biorreator. Este método mantém as células em estado fisiológico e densidade de célula constantes.

[073] 100 a 120 ml de suspensão de célula são então coletados. A biomassa nesta suspensão é então coletada através de filtragem em um filtro usando um funil Büchner. 15 g a 18 g de biomassa fresca são coletados para cada amostra. A biomassa fresca coletada dissolvida no mesmo volume de água destilada é moída fria usando um limpador ultrassônico e então seca por congelamento. O resultado obtido é 0,71 a 0,85 g de biomassa seca por congelamento para cada retirada. A cultura é então mantida por pelo menos 60 dias. É teoricamente possível mantê-la sem nenhum limite de tempo.

[074] A vantagem de cultura contínua sobre os modos anteriores é que não há nenhuma necessidade de preparar o biorreator novamente requerendo limpeza e esterilização, e não há nenhuma fase de latência de célula. Retirada de 1 a 1,5% da suspensão de célula automaticamente seguido por compensação com um meio novo no biorrea- tor causa variações mínimas na composição do meio de cultura em progresso no biorreator. Desta maneira, a população de célula não faz quaisquer reajustes metabólicos para a fase de latência responsável por uma perda de produtividade de volume de biomassa observada em outros modos de cultura. Exemplo 3: matéria flutuante de biomassa fresca, a dita biomassa sendo obtida conforme descrito no Exemplo 2a

[075] 20 g de biomassa moída fresca obtida conforme descrito no Exemplo 2a são centrifugados a 10000 g por 15 minutos e então o material flutuante é coletado. Ele é então seco por congelamento.

[076] O rendimento médio é 30 mg de material flutuante seco por congelamento por g de biomassa fresca. Exemplos de composições cosméticas: Exemplo 4: Fórmula H/E

Exemplo 6: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE Quimioluminescência

[077] Este método gera radicais livres (radical superóxido O2o-) através de um sinal fotoquímico. A intensidade de oxidação é 1000 vezes maior do que aquela obtida sob condições normais. Detecção é feita através de quimioluminescência e é usada para avaliar extratos ou moléculas de antioxidação lipo ou hidrossolúveis. Os resultados são expressos como uma quantidade equivalente de vitamina C ou Trolox (ácido 6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico). A sensibilidade é da ordem de um nanomole.

[078] A análise dos resultados depende de dois critérios, a saber o formato da curva (integração) e o valor numérico dado pelo software em nanomoles. (Igor Popov e Gudrun Lewin. Methods in enzymology [44] vol. 300. 437-456; Maibach I Howard e col. Journal of Cosmetic Dermatology Vol. 7(2) 96-100 (2008)).

[079] Os resultados serão expressos em μg de amostra necessá rio para obter uma atividade equivalente à atividade detectada para 1 μg de padrão (=trolox). (Kit ACL). Resultados:

[080] A atividade antioxidante estudada neste teste representa a habilidade em especificamente aprisionar ânions de superóxido através de quimioluminescência.

[081] A biomassa seca por congelamento preparada de acordo com o Exemplo 2a e o material flutuante de biomassa seca por congelamento moída preparada de acordo com o Exemplo 3 têm uma atividade de aprisionamento anti-radical globalmente equivalente.

[082] 278 μg de biomassa seca por congelamento são necessá rios para obter uma atividade equivalente à atividade detectada para 1 μg de trolox: atividade equivalente à co-enzima Q10, a molécula antio- xidante de referência.

[083] 171 μg de matéria flutuante de biomassa seca por conge lamento moída são necessários para obter uma atividade equivalente à atividade detectada para 1 μg de trolox.

[084] Radicais livres, para os quais produção é aumentada como um resultado de agressões externas (frio, poluição, tabaco, UV), são responsáveis por dano ao DNA da célula da pele, mas também DNA das membranas celular e mitocondrial. Esses radicais livres também desempenham um papel muito importante no processo de inflamação. Esses metabolitos muito reativos são segundos mensageiros de sinalização de estresse de oxidação celular e então mediadores precoces de inflamação (A. Van Der Vliet e col., Chem. Biol. Interaction 85: 95116, 1992).

[085] A atividade anti-radical das preparações descritas nos Exemplos 2a e 3 ajuda a resistir a envelhecimentos da pele intrínseco e extrínseco e inflamação.

Exemplo 7: AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DA ATIVIDADE METALO- PROTEÁSICA SOBRE FORMAÇÃO DE COLÁGENO DA MATRIZ EXTRACELULAR

[086] A matriz extracelular (ECM) (Extra-cellular Matriz) é uma estrutura dinâmica com papéis estrutural e de regulagem para tecidos. Ela dá à pele suas propriedades de turgescência e mecânicas. Na epiderme, ela ocupa o espaço intercelular e provê apoio para a estrutura epidérmica. Ela também controla trocas entre as células da epiderme e desempenha um papel em atividade celular. Ela é composta de fibras, particularmente colágeno e substâncias fundamentais (água, sais, gli- coproteínas, glicosaminoglicanos). Colágenos são proteínas fibrosas, formadas de três cadeias polipeptídicas que podem ser idênticas ou diferentes, conectadas por ligações de hidrogênio covalentes. Coláge- nos formam o componente essencial da rede fibrosa e desempenham um papel mecânico provendo resistência e elasticidade à pele.

[087] Quando uma célula é senescente, a maioria dos compo nentes da ECM é degradada por enzimas tipo endopeptidase ricas em zinco chamadas Metaloproteinases de Matriz (MMPs) (Hideaki Nagase § e J. Frederick Woessner. J Biol Chem, Vol. 274, Issue 31, 2149121494, 30 de julho, 1999). Elas são membranosas ou secretadas. Todas as MMPs têm uma homologia de sequência e estrutura forte, mas diferem na especificidade do substrato. MMP1 ou "colagenase intersticial" predominantemente degrada colágeno tipo I (80% do teor na derme de pele normal) e também degrada colágenos tipos II, VII, VIII e X.

[088] Em um modelo de uma enzima de recombinação humana usando um substrato peptídico específico Mca - Lys-Pro-Leu-Gly-Leu- DPA- Ala-Arg-NH2, a requerente analisou o efeito de extratos sobre atividade enzimática direta através de quantificação fluorimétrica (David Leppertd and coll, Analytical Biochemistry 328 (2004) 166-17).

[089] A enzima ativada é pré-incubada com as preparações dife rentes e é então posta na presença do substrato. A enzima cliva o peptídeo separando o fluoróforo Mca (7 metoxicumarin-4-il) acetila) do extintor Dpa (N - 3 - (2,4-Dinitrofenil) - L-2,3-diaminopropionila). O peptídeo então emite fluorescência com um comprimento de onda de 405 nm quando ele é excitado a 320 nm. Então, a atividade da enzima de MMP-1 é medida e é proporcional à fluorescência emitida.

[090] Com este teste in tubo, é possível detectar inibidores de atividade de MMP-1 potenciais, uma enzima com um papel crucial na iniciação da degradação de colágeno. Foram medidas as porcentagens de inibição de atividade de MMP-1.

[091] Cálculo da porcentagem de inibição enzimática relacionada com o inibidor ou o produto:

Resultados:

[092] O material flutuante preparado de acordo com o Exemplo 3 inibe significantemente a atividade de MMP-1 e dependente da dose de 60 a 500 μg/ml.

[093] A biomassa seca por congelamento preparada de acordo com o Exemplo 2a foi testada de 60 a 1000 μg/ml. Devido à interferência físico-química da biomassa como um todo, a requerente não foi capaz de medir a atividade de inibição. No entanto, um extrato muito similar foi testado e mostrou inibições significantes de 60 μg/ml a 1000 μg/ml.

[094] O extrato preparado de acordo com o Exemplo 3 pode re sistir à atividade aumentada de MMPs quando senescência ocorre e pode contribuir para manutenção do papel mecânico do colágeno, desta maneira provendo resistência e elasticidade à pele.

Exemplo 8: Medição da síntese de TGF-β1 em queratinócitos HaCaT

[095] TGF-β1 (Fator de Crescimento Transformante beta-1) per- tence à superfamília de TGF-β secretado por tipos de célula diferentes e que desempenham um papel importante no controle de crescimento de célula e regulagem de respostas de célula e processos biológicos múltiplos. As atividades principais de citocinas nesta superfamília são que elas modulam proliferação da maioria das células, elas estimulam a proliferação de fibroblastos e aumentam a formação da matriz extra- celular (Lawrence, 1996). TGF-β1 está também envolvido no reparo de lesões, processos de cicatrização (Cullen e outros, 1997) particularmente através da indução de reorganização do citoesqueleto da célula (actina) e promoção da migração de células epiteliais (Boland e outros, 1996). A população de célula mais representada no tecido da pele é a população de queratinócito. Ela forma uma fonte importante de fatores de crescimento que controlariam e influenciariam o comportamento de células da pele, a saber fibroblastos (Ghahary e outros, 2001). Aparelhos e Métodos Produção de biomassa não elicitada: de acordo com o Exemplo 2a Preparação de biomassa elicitada

[096] Meio Murashige & Skoog é preparado sem fatores de cres cimento (quinetina e 24D). Este meio é ajustado para pH 6 através da adição de KOH seguido por autoclave por 20 minutos a 121° C (p = 1 bar). Este meio é então inoculado a 1:5 do volume usando uma suspensão celular derivada de uma cultura de propagação. Condições de elicitação são criadas imediatamente em seguida através da adição estéril de uma solução concentrada de 6-benzilaminopurina (BAP ou (N-(fenilmetil)-7H-purin-6-amina) e agentes de elicitação (ácido acetil- salicílico e metil-jasmonato) no DMSO de quinetina. O resultado é um meio de elicitação EMS (vide Tabela 4). A cultura elicitada é então mantida por 15 dias em uma mesa de agitação no escuro a 115 RPM e a 29° C. A biomassa fresca é então coletada e seca em um funil Buchner antes de ser moída e centrifugada, e o material flutuante é esta- bilizado através de secagem por congelamento. Tabela 4. Meio EMS, a saber o meio modificada Murashige & Skoog usado para a cultura sob condições elicitadas de células de argânia em suspensão em um Erlenmeyer.

[097] Queratinócitos HaCaT são tratados por 5 horas com os ex tratos diferentes e as células são então incubadas por 24 horas em DMEM a 37° C. TGF-β1 é dosado nos materiais de flutuação de cultura com um estojo de ELISA.

[098] Os efeitos de biomassa de argânia não elicitada preparada de acordo com o Exemplo 2a e da biomassa de argânia obtida após elicitação sobre a síntese de TGF-β1 em queratinócitos HaCaT humanos são mostrados na Figura 1 em anexo. Eles mostram que em que- ratinócitos HaCaT, a biomassa de argânia não elicitada preparada de acordo com o Exemplo 2a (50 μg/mL) estimula a síntese de TGF-β1 em 48%, enquanto a biomassa de argânia elicitada inibe a síntese de TGF-β1 em 26%

Exemplo 9: Medição da proliferação e da migração de célula de quera- tinócitos humanos Exemplo 9.a: Medição de proliferação de célula de queratinócitos humanos

[099] Cicatrização de lesões é um processo biológico complexo e dinâmico que envolve a interação de muitos fatores locais e sistêmicos no reparo normal de tecidos. Progresso de cicatrização compreende quatro fases interdependentes: hemóstase, inflamação, proliferação e remodelagem. Proliferação implica em três processos claramente observáveis, a saber, granulação, contração e reepitelização.

[0100] Durante a granulação, proliferação de células que estarão envolvidas no resto do processo de reparo é observada, com migração dessas células em direção ao leito da lesão. Essas células incluem macrófagos, fibroblastos e células endoteliais. Macrófagos continuamente liberam fatores quimiotáticos e fatores de crescimento. Os fi- broblastos constroem a nova matriz celular necessária para o crescimento de células no fundo da lesão. Esta base facilita migração celular.

[0101] Contração da lesão é um mecanismo para redução do ta manho da lesão e fibroblastos desempenham um papel principal nesta contração.

[0102] Reepitelização consiste em regeneração de uma epiderme que cobre uma lesão para reformar uma barreira eficaz contra o ambiente externo, capaz de ser pigmentada e restaurando suas funções sensorial e de imunidade. Desta maneira ela implica em processos de migração e proliferação de célula de queratinócito, mas também diferenciação deste neo-epitélio e restauração de uma membrana de base reconectando a derme e a epiderme. Quando a migração de células basais em direção ao centro da lesão permite que os dois lados da lesão se unam, uma onda de mitose de célula ocorre para preencher os espaços deixados pela migração e fornecer células para o tecido epite- lial em regeneração tridimensional.

[0103] Etapas de proliferação de células de queratinócito, fi- broblastos e células endoteliais podem ser consideradas como sendo um dos fenômenos funcionais que confirmam a atividade de cicatriza- ção de um constituinte ativo. Um aumento na proliferação de fibroblas- tos e células endoteliais participaria da cicatrização da derme, enquanto um aumento na proliferação de queratinócitos participaria da reepi- telização.

Aparelhos e métodos: proliferação de célula

[0104] A técnica usada mede a incorporação de um nucleotídeo, 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU), um análogo de timidina, no DNA de células na fase S.

[0105] Queratinócitos, isolados de pele descartada após cirurgia, são cultivados em um KSFM completo (BPE 25 μg/ml; EGF 1,5 mg/ml). As células são incubadas na presença de moléculas a serem avaliadas por 48 horas a 37° C em uma atmosfera com CO2 5%.

[0106] Incorporação de BrdU proporcional à taxa de proliferação celular é avaliada por um sistema de anticorpos anti-BrdU acoplados à peroxidase. A adição de um substrato de peroxidase desenvolve uma reação colorida (Biotrak Elisa System). A absorbância correspondente (DO) é medida a 450 nm. Desta maneira esse dado é proporcional à ta- xa de proliferação de célula.

[0107] A porcentagem de proliferação é então determinada usando a fórmula que segue: I

Nota: Controlemin = células incubadas com o meio mínimo Controlemax = células incubadas com o meio completo Desta maneira, Controlemin corresponde à proliferação de 0% e Controlemax corresponde à proliferação de 100%.

[0108] Os resultados sobre proliferação celular são mostrados na Figura 2 que ilustra o efeito da biomassa de argânia preparada de acordo com o Exemplo 2a sobre a proliferação de queratinócitos humanos.

[0109] Eles mostram que a biomassa de argânia preparada de acordo com o Exemplo 2a a 0,1 μg/mL estimula a proliferação de que- ratinócitos humanos em 25%. Nenhum efeito é medido quando a biomassa é testada a 0,01 μg/mL.

Exemplo 9.b: Medição de migração de célula de queratinócitos humanos Aparelho e Métodos: migração de célula de queratinócitos HaCaT

[0110] O protocolo usado para estudar a migração de célula é ba seado no uso de um estojo de 96 cavidades. O princípio deste teste consiste no estudo da migração de células em direção ao centro da cavidade (placa de 96 cavidades). Para conseguir isso, uma rolha é posta no centro de cada cavidade, de maneira a criar uma zona de detecção de diâmetro de 2 mm. As células de HaCaT são então semeadas em torno desta rolha. As rolhas são retiradas assim que as células estiverem bem ligadas à superfície em torno das rolhas, e as células podem então migrar para a zona de detecção. As placas sem as rolhas e com constituintes ativos são incubadas a 37° C por 24 horas em DMEM SVF 0%. A quantidade de células localizadas na zona onde a rolha está localizada é então analisada, a fim de avaliar a migração de células. As células são marcadas com Hoechst 33342 e um cache é usado para ver e contar apenas as células localizadas nesta zona. Uma média de oito cavidades é feita para cada condição.

[0111] Os resultados são expressos - como uma intensidade de fluorescência (IF - proporcional à quantidade de células que migraram); - como uma porcentagem de atividade com relação ao controle SVF 0%: IF tratadas - IF 0%mig A 1 ÜU IF t controleO% SVF - IF 0% mig Nota: IF (0% mig) corresponde à IF (intensidade de fluorescência) de cavidades contendo as rolhas e então ao ruído de base.

[0112] A Figura 3 mostra os resultados de migração de célula e ilustra o efeito de biomassa da argânia preparada de acordo com o Exemplo 2a sobre migração de queratinócitos HaCaT.

[0113] Eles mostram que a biomassa de argânia preparada de acordo com o Exemplo 2a, a 0,01 ou 0,03 μg/mL, estimula a migração de queratinócitos HaCaT em 79% e 73%, respectivamente.

Claims

1. Processo para tratamento cosmético de envelhecimento da pele, caracterizado pelo fato de que envolve o uso de uma composição compreendendo como o constituinte ativo, uma preparação derivada de uma cultura de células de argânia não elicitadas desdiferenci- adas em associação com um excipiente cosmético ou dermatológico aceitável.

2. Processo para tratamento cosmético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma suspensão de célula, biomassa, biomassa moída, matéria flutuante de biomassa moída ou matéria flutuante de cultura.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a quantidade da preparação está entre 0,1 e 10% do peso total da composição.

4. Processo para obtenção da preparação tal como definida na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que ele inclui as etapas que seguem: a) esterilização do material de planta b) desdiferenciação das células c) pôr em suspensão de célula com um meio de cultura sem elicitadoryour d) cultura de propagação e produção de biomassa com um meio de cultura sem elicitador, e obtenção da preparação.