BR112012024630A2 - preparação criada a partir de uma cultura in vitro de células não elicitadas, desdiferenciadas da árvore argânia, uso da mesma para tratamento de envelhecimento, inflamação e cicatrização da pele e produção da mesma - Google Patents

Abstract

PREPARAÇÃO CRIADA A PARTIR DE UMA CULTURA IN VITRO DE CÉLULAS NÃO ELICITADAS, DESDIFERENCIADAS DA ÁRVORE ARGÂNIA, USO DA MESMA PARA TRATAMENTO DE ENVELHECIMENTO, INFLAMAÇÃO E CICATRIZAÇÃO DA PELE E PRODUÇÃO DA MESMA. A invenção refere-se a uma preparação criada a partir de uma cultura in vitro de células não elicitadas, desdiferenciadas, da árvore de Argânia.

Description

. Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PREPARA- ÇÃO CRIADA A PARTIR DE UMA CULTURA /N VITRO DE CÉLULAS - NÃO ELICITADAS, DESDIFERENCIADAS DA ÁRVORE ARGÂNIA, USO DA MESMA PARA TRATAMENTO DE ENVELHECIMENTO, INFLAMA- ÇÃOECICATRIZAÇÃO DA PELE E PRODUÇÃO DA MESMA".

O propósito da presente invenção é uma preparação derivada de uma cultura in vitro de células de argânia não elicitadas desdiferenciadas, uma composição cosmética ou dermatológica compreendendo a dita prepa- ração e seus usos para o tratamento de envelhecimento, inflamação e cica- trizaçãoda pele. - A argânia é uma árvore que pertence à família botânica Sapota- cea e seu nome científico é Argania spinosa (L.) Scelles, ' Seu hábito é similar ao da árvore de oliva; ela tem um tronco curto e torcido. A madeira é muito dura e densa. Os galhos são muito espi- —nhosos e eles têm folhas pequenas, em formato de lança, alternadas, curtas (cerca de 2 cm de comprimento) e estreitas que são frequentemente agru- padas em pencas. As folhas são sempre verdes, mas elas morrem e caem sempre que há uma seca severa. As flores são hermafroditas e pentaméri- cas. Elas são agrupadas em glomérulos e abrem em maio e junho. Elas são amarelo-acinzentadas.

Uma árvore de argânia pode produzir fruta a partir dos 5 anos de idade. A fruta é uma baga séssil oval, amarela, de cerca de 4 a 5 cm de comprimento. Ela é composta de polpa circundando uma noz contendo 2 a 3 sementes chatas grudadas, cada uma encerrando uma amêndoa rica em óleo A Argânia é endêmica do Marrocos e está localizada principal- mente no sudoeste do Marrocos entre Essaouira e Agadir. A floresta de ar- gânia cobre cerca de 830 000 ha.

As populações do Marrocos primeiro exploraram a Argânia pela sua madeira particularmente dura como um fornecimento de combustível. O outro uso tradicional principal é óleo inicialmente manualmente extraído, mas agora extraído usando uma prensa. O primeiro uso deste óleo é para alimen-

. to; outra aplicação importante agora é para cosméticos. A polpa e a torta residual derivadas desta produção de óleo são normalmente usadas para . ração animal.

Muitos produtos de cosmetologia foram desenvolvidos a partir da Argânia. Há várias patentes de invenção para óleo derivado das sementes, por exemplo, óleo obtido através de solvente (Patente Fr 2 553 788), óleo de argânia enriquecido com matéria não saponificável (Patente Fr 2 724 663). Substâncias outras que não óleo foram também patenteadas, por exemplo, peptídeos derivados de torta de semente obtida após extração deóleo; combinação de óleo e peptídeos da torta para o tratamento de pro- - blemas relacionados com envelhecimento da pele (Patente Fr 2 756 183). Há também uma patente de invenção para folhas, proteínas e saponinas de " Argânia de torta = Extratos de folhas (Patente EP 1 213 025), proteínas de torta (Patente EP 1 213 024), saponinas de torta (Patente EP 1 430 900).

Mais recentemente, o pedido de patente EP 1 968 536 foi depositado reve- lando o uso de um extrato de polpa de fruta de argânia em cosméticos anti- envelhecimento.

Desta maneira, a composição da árvore de argânia inteira é inte- ressante para uso dermatológico e/ou cosmético.

A Argânia é uma planta de recurso importante, primeiro ecologi- camente porque ela é uma planta de "ecossistema". Ela é perfeitamente a- daptada a áreas com secas, ela protege o solo contra erosão pela água e pelo vento e então previne avanço do deserto no Marrocos. Mas também economicamente, porque ela é uma árvore com usos múltiplos.

Ela é a principal cultura do Marrocos. Desta maneira, a floresta de Argânia foi protegida pelo dahir (decreto) expedido em 1925, declarando que a Nação tem os direitos superiores sobre a floresta de argânia, mas que as populações locais têm os usufrutos (fruto, madeira morta, culturas sob as árvores de argânia). A UNESCO recentemente classificou a floresta de ar- gâniacomo uma reserva da bioesfera.

Este é o motivo pelo qual o uso de sua madeira ou folhas para uso cosmético poderia ter sérias consequências sobre esta planta protegida.

Outro meio de obtenção de moléculas de interesse a partir de : uma planta é preparar culturas de célula desdiferenciada totipotente. O uso - de células de planta desdiferenciadas pode também evitar alguns problemas de industrialização encontrados durante o desenvolvimento de produtos cosméticos. Com cultura de célula, a diferença na concentração de substân- cias de interesse entre bateladas ou colheitas de planta diferentes desapa- rece. Ela é também uma técnica não destrutiva relativamente fácil e barata de executar. Finalmente, ela elimina a necessidade de extração uma vez que as células estão em um meio de cultura e os compostos ativos estão ou nomeio de cultura ou no líquido intracelular. Desta maneira, trituração sim- a ples torna esses compostos disponíveis. O Pedido de Patente WO03077881 revela uma composição para " aplicação tópica contendo pelo menos um homogenato de células de planta desdiferenciadas e elicitadas em uma cultura in vitro para sintetizar pelo me- nos uma fitoalexina. O material de planta é preferivelmente derivado de uma vinha.

Desta maneira, este documento revela a aplicação cosmética de células de planta que poderiam ser desdiferenciadas e elicitadas, elicitação levando a uma quantidade suficiente de metabolitos secundários para permi- tiratividade biológica em uso tópico.

Surpreendentemente e inesperadamente, a Requerente de- monstrou que uma preparação derivada de uma cultura in vitro de células de argânia desdiferenciadas, mas não elicitadas, tem atividades cosméticas e/ou dermatológicas boas nos campos de antienvelhecimento, inflamação e cicatrização.

Os resultados obtidos mostram que no caso específico de argã- nia, outra aplicação de culturas de célula de argânia (células não elicitadas neste caso) é possível dentro do contexto mencionado acima.

Ainda, obtenção da preparação conforme revelado na presente invenção pode eliminar a necessidade da etapa de elicitação que é uma eta- pa industrialmente difícil e cara; elicitação leva a um rendimento de biomas- sa muito menor devido à diminuição de crescimento celular.

: O Pedido WOO03077881 menciona várias maneiras de realizar esta elicitação, por exemplo, radiação UV por 3 dias; dióxido de carbono por - 24 horas a 2 dias; radiação UV e dióxido de carbono por 5 dias. O processo realizado dentro da estrutura da presente invenção, consistindo em desdiferenciação de célula a partir de material de planta deri- vado de argânia e então cultura de células em suspensão, pode rapidamente resultar em uma biomassa fina, abundante, homogênea e estéril desta plan- ta. Cultura de célula torna possível aplicar cursos para biossíntese desta planta diretamente em escala celular. Desta maneira, a presente invenção tem como objetivo uma - preparação derivada de uma cultura in vitro de células de argânia não elici- tadas desdiferenciadas, uma composição cosmética ou dermatológica inclu- " indo a dita preparação e seus usos em cosmetologia e/ou dermatologia, e preferivelmente para o tratamento de envelhecimento, inflamação e cicatri- zaçãode pele.

Com mais frequência, culturas in vitro de tecidos de planta em suspensão provê um meio de produção de compostos orgânicos ativos deri- vados diretamente do metabolismo primário ou secundário de células.

Células de planta em suspensão estão em um estado de desdi- ferenciação similar ao estado de células-tronco para culturas de célula ani- mal. Desta maneira, essas células de planta são teoricamente capazes de produção de todos os metabolitos observados na planta inteira. Desdiferen- ciação causa um distúrbio genético ou epigenético de cursos de biossintese de maneira que os perfis químicos são quantitativamente e qualitativamente diferentes entre a planta inteira e as linhagens de célula resultantes. Desta maneira, teoricamente, intermediários reacionais não observados na planta inteira podem aparecer em suspensão celular. Isto provê uma nova oportu- nidade de maneira que biodiversidade química "inativa" pode ser acessada.

No presente estado da técnica, em geral as elicitações (química, física, biológica) de cultura de célula podem estimular e produzir mais meta- bolitos secundários. No processo da requerente de acordo com a invenção, será mostrado agora que, diferente da maioria dos casos, e surpreendente-

. mente, elicitação não é necessária, mas é prejudicial para crescimento da biomassa e para as atividades biológicas requeridas. - Um dos propósitos da presente invenção refere-se à preparação derivada de cultura in vitro de células de argânia não elicitadas desdiferenci- adas "Células de planta desdiferenciadas" refere-se a qualquer célula de planta sem nenhuma natureza de especialização particular, em outras palavras em um estado fisiológico similar a tecidos meristemáticos da planta no estado natural.

Essas células são capazes de viver por si só e não de- pendem de outras células. - Células de Argania spinosa desdiferenciadas são obtidas de ma- terial de planta vivo pego da árvore ou um broto jovem, consistindo em fo- : lhas, talos de folha, caule, casca, raiz, fruto, semente, flor e órgãos de flor ou o botão, e mais particularmente de folhas.

O processo para obtenção das culturas de célula desdiferencia- da é obtido in vitro através de qualquer método conhecido daqueles versa- dos na técnica, por exemplo, refere-se a Murashige, T., Skoog, F, 1962. "A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultu- res". Physiol.

Plant 15: 473-496. / Plant Culture Media, Vol-1 Formulations and UsesE.F.

George, D.J.M.

Puttock e H.J.

George (1987) Exegetics Ltd.

Edington, Westbury, Wilts, BA134QG Inglaterra.

A preparação de acordo com a presente invenção pode ser obti- da através da realização das etapas que seguem em sequência: a) esterilização do material de planta, b) desdiferenciação das células, c) pôr as células em suspensão com um meio de cultura sem e- licitador, d) cultura de propagação e produção de biomassa com um meio de cultura sem elicitador, eobtençãoda preparação.

A preparação pode ser feita em um frasco Erlenmeyer se o obje- tivo for produzir quantidades pequenas de biomassa ou em um biorreator

' para quantidades maiores. Por exemplo, a quantidade média coletada em um Erlenmeyer com 500 ml! de suspensão celular são 100 g de biomassa - seca (a saber 200 g de biomassa/L de suspensão celular) enquanto a massa seca média coletada em um biorreator de 10 L são 3000 g (300 g/L de bio- massa) Três modos principais são encontrados para a cultura de célula de planta em um biorreator:

1. cultura descontínua ou em batelada,

2. cultura de recarga/coleta ou alimentação em batelada, e

3. cultura contínua. - a. Etapa de esterilização de material de planta: Explantes de Argania spinosa e mais particularmente explantes ' de folha são pegos e descontaminados com soluções de hipoclorito de sódio ou cálcio ou soluções de cloreto de mercúrio em temperatura ambiente por vários minutos. Os tecidos são enxaguados com água destilada estéril e são então lavados pelo menos uma vez com água destilada estéril no final da descontaminação. b. Etapa de desdiferenciação de célula Os explantes descontaminados são postos sob uma capela de fluxolaminar em contato com um meio nutriente de ágar Murashige & Skoog ao qual sacarose e fatores de crescimento (ou hormônios) foram adiciona- dos. Esses hormônios do crescimento vão controlar o maquinário celular dos explantes de maneira a causar divisões celulares e causar agrupamentos celulares ou calos diferenciados (calogênese). Os calos obtidos serão trans- feridos para um novo meio nutriente de diferenciação a cada 3 a 4 semanas. Alguns constituintes ricos em ágar deste meio podem ser metabolizados pe- los calos ou degradar pela ação do ar. Em geral, uma composição hormona! baseada em auxina (ácido 2-4 dicloro-fenoxiacético) e citocina (quinetina) foi testada com sucesso para — obter desdiferenciação rápida e completa de tecidos na forma de calos friá- veis (calogênese) e facilitar a transferência para um meio liquido. Os explan- tes de folha estéreis podem ser depositados na face adaxial em contato com

' o meio de ágar composto de um meio Murashige e Skoog (Murashige, T., Skoog, F. 1962. “A revised medium for rapid growth and bio assays with to- - bacoco tissue cultures". Physiol.

Plant 15: 473-496) com 30 g/L de sacarose, 8 g/L de ágar, com 0,5 mg/L de quinetina e 0,75 mg/L de aditivos ácido 2-4 —dicloro-fenoxiacético (24D) e ajustados para pH 6 antes de 20 minutos na autoclave a 121º C (1 bar). Placas de Petri contendo explantes são deixadas incubar no escuro a 28º C.

Os primeiros calos aparecem após 2 semanas.

Os calos obtidos são transferidos para um novo meio a cada 34 semanas, dividindo os calos com um escalpe para manter um tamanho de 2 a 3 cm.

Essas transferências continuam por 2 a 6 meses até que calos friáveis sejam - obtidos. c.

Etapa para criar suspensão celular em meio de cultura sem elicitador ' Desdiferenciação celular para transferências sucessivas de ca- los em um meio de ágar leva à formação de calos friáveis.

Esta queda na coesão entre as células é uma consequência da desdiferenciação que pode ocorrer entre dois e seis meses dependendo da planta.

Este estado é favo- rável para a transferência para um meio líquido porque ele garante desinte- gração do calo em suspensão de célula enquanto minimizando os estresses mecânicos induzidos.

Desta maneira, um acúmulo de calos friáveis é intro- duzido (10-20% em volume) no meio de nutriente líquido preparado usando a mesma formulação que o meio de diferenciação de ágar, mas sem um a- gente de geleificação.

Os calos friáveis são então desintegrados em um meio líquido pela ação de uma mesa de agitação por 2 a 3 dias e a suspensão celular —obtidaélivradade todas as partes do calo não desintegradas, desta maneira formando uma suspensão de célula homogênea.

Esta suspensão é mantida em cultura para obter uma população de célula suficientemente densa.

Nes- te estágio, a suspensão é (subculturada) ou diluída no meio nutriente novo e a cultura é iniciada da mesma maneira.

Uma suspensão de célula inicial pode ser iniciada através da deposição de cerca de 20 a 40 g de calos friáveis em um Erlenmeyer de 500 ml! contendo 200 ml! de meio.

Os calos friáveis são então desintegrados em um meio líquido pela ação de uma mesa de agitação por 2 a 3 dias a 115 i rpm no escuro a 29º C. O material flutuante de célula é então coletado usan- - do uma pipeta, deixando os agrupamentos de calos residuais não desinte- grados separados. O material flutuante de célula então forma uma suspen- sãode célula homogênea. Esta suspensão é mantida em cultura para obter uma população de célula "suficientemente" densa. A suspensão de célula obtida é cultivada por 15 dias e é então propagada pela diluição 1:5 em um novo meio com a mesma duração. Ajustes na composição do meio de cultu- ra (nutrientes, fatores de crescimento, etc) foram feitos de maneira a maxi- mizara produtividade da biomassa. O resultado é o meio de propagação de - biomassa ARGMS (vide Tabela 1) otimizado para a suspensão de célula líquida. Este meio é uma versão modificada do meio Murashige & Skoog Í para calogênese. Este meio é ajustado para pH 6 através da adição de KOH seguido por 20 minutos na autoclave a 121º C (p=1 bar) ou uma filtragem com esterilização a 0,2 um. Tabela 1: Meio ARGMS que é uma versão modificada do meio Murashige & Skoog (ARGMS) usado para cultura de células de argânia em suspensão em Erlenmeyer ou biorreator sob condições ótimas. = === <P Macroslementos 62

0.025 Ei male

Vitaminas Fatores (hormônios do CEEE a — tr d. Cultura de propagação e produção de biomassa com um meio de cultura ' sem elicitador Após absorver várias de tais subculturas, a suspensão celular é estabilizada quando a densidade de célula obtida durante o período é cons- tante. Ajustes da composição do meio de cultura (nutrientes, fatores de cres- cimento, etc) são então possíveis a fim de maximizar a produtividade da bi- omassa. Em uma modalidade particular da invenção, o meio otimizado usa- do como o meio de produção de biomassa é o meio descrito na Tabela 1.

A suspensão de célula é filtrada para separá-la do meio extrace- lular ou material flutuante de cultura e a biomassa coletada é posta de volta em suspensão em água destilada e triturada a 0º C. O homogenato obtido é seco por congelamento ou centrifugado de maneira a clarificá-lo antes de ser seco por congelamento.

A cultura celular sob condição "ótima" então criada é estabiliza- da e é mantida em um Erlenmeyer (cultura de propagação) com uma dilui- ção 1:5 da suspensão celular a cada 15 dias, isto é equivalente a uma cultu- ra de célula de cerca de 60 g/L de biomassa fresca inoculada que produz uma suspensão de célula de cerca de 300 g/L após 15 dias de cultura, ou —inoculada em um biorreator dependendo das necessidades.

A preparação obtida ou em Erlenmeyer ou em um biorreator po- de consistir em: - uma suspensão de célula (para os propósitos da presente in- venção, "suspensão de célula" refere-se a células (a saber biomassa) em

' seu meio de cultura); - biomassa (para os propósitos da presente invenção, "biomas- ” sa" significa um agrupamento celular separado do meio de cultura, a saber a suspensão de célula após filtragem); - moer a biomassa depois de pôr de volta (ou não pôr de volta) em suspensão em água destilada; - um suco clarificado ou material de flutuação de biomassa moí- do através de centrifugação ou filtragem; - um material de flutuação de cultura (para os propósitos da pre- sente invenção, um "material de flutuação de cultura" é o meio de cultura - onde as células permaneceram em residência durante a cultura, ou meio extracelular).

' Sem importar se a suspensão de célula, biomassa ou material de flutuação de biomassa moido está envolvido, ele pode ser mantido sem modificação em forma congelada ou através da adição de substâncias de conservação tal como fenoxi-2-etanol, álcool benzílico ou qualquer outro produto de conservação que apareça no Apêndice VI na instrução EU de produtos cosméticos intitulada "Lista de agentes de conservação que podem estar presentes em cosméticos", Eles podem ser também diluídos em um meio cosmetologicamente aceitável tal como glicol (propileno glicol, butileno glicol, polietileno glicol, etc) em proporções variando de 10 a 60%. A sus- pensão celular ou a biomassa pode também ser moída e então conservada congelada ou através da adição de substâncias ou meio de conservação conforme descrito acima.

Moído ou não, a suspensão de célula, a biomassa ou o material de flutuação de biomassa pode ser também seco através de secagem por congelamento ou atomização e mantido desta maneira ou seco em um meio tipo maltodextrina, lactose ou sílica ou qualquer outro meio cosmetologica- mente aceitável.

Finalmente, a suspensão de célula pode ser enriquecida com compostos úteis através de cromatografia por afinidade: absorção em resina (copolímeros de poliestireno tipo Amberlite? XADº-21a, etc) e eluição com

. um solvente apropriado tal como etanol.

Biomassa fresca obtida com o processo de acordo com a pre- . sente invenção representa cerca de 100 a 500 g por litro de suspensão, e mais preferivelmente entre 200 e 350 g por litro de suspensão nos dados de coletaótimos (a saber cerca de 15 dias em média). A tabela que segue expressa os rendimentos obtidos (rendimen- to em gramas de produto obtido/L de suspensão de célula):

3 & vs Ps O 3 EB Zgeí 2 7. o 8/8 EL E ra uu gs o/8 Bo a. ra 3 E Z ST a A To Z 1] é [ES Po E TS ESBERT Te 2 E ss Sho IS az Ss sa El lo oo oz Z | - sv az o E "a EL E à e HEIN Co õ = E 7, 8 78 2 88 FE ? SToco DP So Ss ==) o — o To o 3. 22 2 Fra RBS UÊ ES RE RST Sano Se ss ELE E se - o o ' Ss E se oa E o pd 283 pel é pPst pt w anjo < e K És = o Ps E | 2 o EE Ss 2&S és ' & EEE us a ão 2 E8Sr T, au a E [ES2O 4 Ss ss é [E$597 SS 2 2 - s 2 oe = SR 8 s/8 Ss | zo Fã 2 8 x joºL Sql 2a 8 & os eo pe o go Ss FE = i E E z = o 7 — 38 Se E E 5 = nR65S8 ÃãSs 2 2 DT xl cs FE ESTE grudar sc E as E 2 ol — 8 BRO: S|8edS S8S=3E Ê St Fe 2?Ne2s es o8: E | TB | l8Es RE õ 8 2 = o & a . = o = fe) ã ro = e x e 8 2& 2 x 1, O BEER ER Ee BR PEL us EE ad E Bus 15 a 2 Es Ss a o os so S$8 o 3 Ss E. 8 BENS AS * e TE é | SR EE az 8

FA u 3 o 1 3 Z " S e TF 7 o E E é ço A uES Lê; 8 |& ls8&5 SÉ ECS. ESSO B Cass gesso geuiçê FTSo;, Ton E 8 2288 E 8 EB o 27 Ss 52 SETE EE 35, = 8 83 à SS 858 ses ST 3 j|B6S $ºS 288 83 8 [BS 88 $ < q E 2/28 is s= 58/82, 8 28 e SToT/588o a S à ELSON 3 BE 33 |[SSS sv B [BEE ss SKESESST £ jégsils 82 a É s|5: KR 2 o * > e mo [=]

. A presente invenção refere-se também a uma composição cos- mética ou dermatológica compreendendo uma preparação derivada de uma - cultura de células de argânia desdiferenciadas não elicitadas como o consti- tuínte ativo, conforme acima descrito. Preferivelmente, a quantidade da dita preparação está entre 0,1 e 10% do peso total da composição. E com mais preferência ainda, a dita quantidade de extrato é entre 0,2% e 5%. A composição cosmética de acordo com a presente invenção pode estar vantajosamente em qualquer forma galênica normalmente usada nos cosméticos para uma aplicação tópica ou oral, e preferivelmente uma - aplicação tópica. Para uma administração através do curso tópico, a forma galênica pode ser um creme, um gel, um unguento ou um spray. A fórmula Í oral é escolhida a partir do grupo compreendendo comprimidos, cápsulas e pós para suspensões para beber. A composição cosmética de acordo com a invenção também compreende os excipientes cosmeticamente compatíveis comuns.

Os excipientes comuns compatíveis com a composição cosméti- ca podem ser qualquer excipiente dentre aqueles conhecidos daqueles ver- sados na técnica, de maneira à obter uma composição cosmética para uma aplicação tópica em formas tais como aquelas descritas acima.

A composição cosmética e/ou dermatológica de acordo com a invenção também pode conter em particular aditivos e auxiliares de formula- ção tais como tensoativos tipo emulsificante, de limpeza, de formação de espuma, etc, agentes de complexação, espessantes, agentes de geleifica- ção, estabilizadores, agentes de conservação incluindo antimicrobianos e antioxidantes, condicionadores, acidificadores, agentes de alcalinização, amaciantes, solventes, agentes de coloração e fragrâncias.

Os inventores também mostraram que preparações derivadas de células de argânia não elicitadas desdiferenciadas podem ter as atividades que seguem: - atividade antioxidante, anti-radical livre para limitar o processo de oxidação relacionado com envelhecimentos intrínseco e extrínseco e os processos inflamatórios. - atividade sobre a matriz extracelular para aperfeiçoar as pro- - priedades mecânicas da pele madura (firmeza, elasticidade, tonicidade) a- través da inibição de metaloproteases de degradação de colágeno.

Finalmente, a presente invenção refere-se a uma composição revelada aqui para o tratamento de envelhecimento, inflamação e cicatriza- ção da pele.

Os exemplos que seguem são dados como exemplos não limi- tantes.

Exemplos para produção da preparação de acordo com a pre- BR sente invenção: Exemplo 1: biomassa fresca / processo feito em um Erlenmeyer 7 Folhas de argânia de preferivelmente 3 a 4 meses de vida são esterilizadas através de vários banhos em sequência: álcool 70% por 1 mi- nuto; hipoclorito de sódio 2% por 3 minutos e então enxaguadas com dois banhos de água desmineralizada sucessivos durando 8 minutos e 10 minu- tos, Explantes de folha esterilizada são depositados em uma face adaxial em contato com o meio de ágar composto de um meio Murashige e Skoog (Murashige, T., Skoog, F. 1962. "A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures". Physiol. Plant 15: 473-496) com 30 g/L de sacarose, 8 9/L de ágar, complementado com 0,5 ma/L de quinetina e 0,75 mg/L de ácido 2,4 dicloro-fenoxiacético (2.4-D) e ajustado para pH 6 antes de 20 minutos de autoclave a 121º C (1 bar). As placas de Petricontendo explantes são deixadas incubar no escuro a 28º C e propa- gadas até calos friáveis e estabilizados serem obtidos.

A suspensão de célula inicial é criada através de deposição de cerca de 40 g de calos friáveis em um frasco Erlenmeyer de 500 ml! conten- do 200 ml de meio de autoclave, para o qual a composição é descrita na Ta- belaimencionada acima.

A cultura é deixada por uma semana em uma mesa de agitação a 115 RPM no escuro a 29º C. O material flutuante da célula é então coleta-

do com a pipeta, deixando agrupamentos residuais de calos. A suspensão de célula obtida é cultivada por 15 dias e é então propagada por diluição 1:5 - no meio novo com a mesma duração. A suspensão é então filtrada sob um vácuo e a biomassa é re- cuperada O rendimento de biomassa fresca obtida é 168 g/L. A biomassa é mantida a -20º C. Exemplo 2: biomassa seca Exemplo 2a: biomassa seca / processo feito em biorreator em cultura de ba- telada Quatro Erlenmeyers de suspensão de célula de 500 ml! obtidos - conforme descrito no Exemplo 1 são postos juntos em um dispositivo de ino- culação e formam um inóculo de 2 L que é despejado estéril em um biorrea- Í tor de 10 L. Este biorreator é cheio com 8 L de meio ótimo (vide Tabela 1), complementado por 30 mg/L de antiespumante previamente esterilizado, então esfriado e mantido a 29,5º C através de circulação de água controlada por termostato em um circuito fechado no alojamento do biorreator.

Uma sonda de oxigênio é calibrada através de saturação e inse- re dados em um dispositivo de regulagem de pO2 computadorizado em tem- po real. Este dispositivo mantém o pO2 a 80% através de injeção de oxigê- nio puro estéril no sistema de aeração. Este biorreator é também equipado com um dispositivo de medição on line de CO2 nos gases efluentes (head space) que ao mesmo tempo insere dados em um dispositivo de regulagem de pCO2 computadorizado para manter pCO2 à 6%. Isto é feito através de injeção de ar atmosférico estéril no dispositivo de aeração misturado com oxigênio. O biorreator é também equipado com um sistema de agitação tipo propelente girando a 75 RPM, para agitar a suspensão de célula e prevenir que ela sedimente. Um dispositivo automático é instalado no lado externo do biorreator, para permitir amostragem e monitoramento estéreis da biomassa.

A cultura de batelada é mantida sob essas condições de tempe- ratura constante e gás dissolvido por 15 a 17 dias, para atingir uma densida- de de célula de 280 a 320 g/L de biomassa fresca. O biorreator é esvaziado após esta cultura de batelada ser completada, e a biomassa é coletada atra-

vês de filtragem em um filtro usando um funil Buchner. A biomassa fresca coletada dissolvida no mesmo volume de á- . gua destilada é moida fria usando um "limpador ultrassônico", e então seca por congelamento. Exemplo2b: biomassa seca / processo feito em biorreator em cultura de ali- mentação em batelada 10.0.0.1 Quatro Erlenmeyers de suspensão de célula de 500 ml foram usados como inóculo conforme descrito no Exemplo 2a. O biorreator é pre- parado conforme indicado no Exemplo 2a. Sistemas de regulação de gás dissolvido, temperatura e agitação são preparados conforme indicado no : Exemplo 2a.

A cultura inicial é mantida sob essas condições de temperatura Í constante e gás dissolvido por 15 a 17 dias até que uma densidade de célula de 280 a 320 g/L de biomassa fresca seja obtida. 80% do teor do biorreator de 10L são removidos após esta cultura inicial ser completada. 8 L de sus- pensão de célula são então coletados. A biomassa nesta suspensão é cole- tada através de filtragem em um filtro usando um funil Búchner. 2240 g a 2560 g de biomassa fresca são coletados. A biomassa fresca coletada dis- solvida no mesmo volume de água destilada é moida quando fria usando um limpador ultrassônico e é então seca por congelamento. 100 a 130 g de bio- Massa seca por congelamento são obtidos.

Ao mesmo tempo que a coleta parcial de 80% é feita, 8 L de meio ARGMS previamente autoclavado e esfriado são despejados no bior- reator então contendo 2 L de suspensão de célula, de maneira a restaurar o volume de cultura para 10 L. A cultura de alimentação em batelada é manti- da sob essas condições de temperatura constante e gás dissolvido por 5 a 7 dias até que uma densidade de célula de 280 a 320 g/L de biomassa fresca seja atingida. Esta cultura é mais rápida (maior produtividade) do que a cul- tura inicial porque a biomassa está em um estado de divisão de célula fisio- lógico sustentado de maneira que despejo de meio nutriente novo é caracte- rizado por uma fase de latência de menos do que 24 horas e uma expansão imediata da biomassa. No final desta cultura de alimentação em batelada,

: 80% do biorreator de 10 L são removidos. 8 L de suspensão de célula são então coletados. A biomassa desta suspensão é coletada através de filtra- - gem em um filtro usando um funil Búchner. A cultura é então reiniciada como antes.

Exemplo 2c: biomassa seca / processo realizado em biorreator de cultura contínua Quatro Erlenmeyers de suspensão de célula de 500 ml são usa- dos como inóculo conforme descrito no Exemplo 2a. O biorreator é prepara- do conforme indicado no Exemplo 2a. Os dispositivos de regulagem de gás dissolvido, temperatura e agitação são preparados conforme descrito no E- - xemplo 2a. . A cultura inicial é mantida sob essas condições de temperatura : constante e gás dissolvido por 10 dias, até uma densidade de célula de 150 g/L e uma taxa de crescimento de biomassa fresca instantânea de 0,2 dº serem atingidas. Neste estágio, 1,2% do teor do biorreator de 10 L é removi- do a cada 1 hora e 20 minutos. Essas amostras são automaticamente com- pensadas despejando o mesmo volume de meio ARGMS novo no biorreator. Este método mantém as células em estado fisiológico e densidade de célula constantes, 100 a 120 ml de suspensão de célula são então coletados. A bi- omassa nesta suspensão é então coletada através de filtragem em um filtro usando um funil Búchner. 15 g a 18 g de biomassa fresca são coletados pa- ra cada amostra. A biomassa fresca coletada dissolvida no mesmo volume de água destilada é moída fria usando um limpador ultrassônico e então se- ca por congelamento. O resultado obtido é 0,71 a 0,85 g de biomassa seca por congelamento para cada retirada. A cultura é então mantida por pelo menos 60 dias. É teoricamente possível mantê-la sem nenhum limite de tempo.

A vantagem de cultura contínua sobre os modos anteriores é que não há nenhuma necessidade de preparar o biorreator novamente re- querendo limpeza e esterilização, e não há nenhuma fase de latência de cé- lula. Retirada de 1 a 1,5% da suspensão de célula automaticamente seguido por compensação com um meio novo no biorreator causa variações mínimas na composição do meio de cultura em progresso no biorreator.

Desta manei- - ra, a população de célula não faz quaisquer reajustes metabólicos para a fase de latência responsável por uma perda de produtividade de volume de biomassa observada em outros modos de cultura.

Exemplo 3: matéria flutuante de biomassa fresca, a dita biomassa sendo obtida conforme descrito no Exemplo 2a 20 g de biomassa moída fresca obtida conforme descrito no E- xemplo 2a são centrifugados a 10000 g por 15 minutos e então o material flutuante é coletado.

Ele é então seco por congelamento. - O rendimento médio é 30 mg de material flutuante seco por con- gelamento por g de biomassa fresca. ' Exemplos de composições cosméticas: Exemplo 4: Fórmula HE Biomassa fresca (Exemplo 1) EDTA Nã2 Goma xantana C12-C15 alquil benzoato Palmítato de octla Agentes de conservação Fss Álcool estearílico Monoestearato de glicerol Ceil fosfato de potássio Água desmineralizada QSP 100 Exemplo 5: fórmula Material flutuante (Exemplo 3) [o os rear O e Bs to | Goma xantama C12-C15 alquil benzoato o fagentesdecamenação o [TS [Esteres de poligicera e serbtano 40 ' Exemplo 6: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE Quimioluminescência Este método gera radicais livres (radical superóxido 02º) através de um sinal fotoquímico. A intensidade de oxidação é 1000 vezes maior do que aquela obtida sob condições normais. Detecção é feita através de qui- mioluminescência e é usada para avaliar extratos ou moléculas de antioxi- - dação lipo ou hidrossolúveis. Os resultados são expressos como uma quan- 7 tidade equivalente de vitamina C ou Trolox (ácido 6-Hidroxi-2,5,7,8- ' tetrametilcroman-2-carboxílico). A sensibilidade é da ordem de um nanomo- le A análise dos resultados depende de dois critérios, a saber o formato da curva (integração) e o valor numérico dado pelo software em na- nomoles. (Igor Popov e Gudrun Lewin. Methods in enzymology [44] vol. 300. 437-456; Maibach | Howard e col. Joumal of Cosmetic Dermatology Vol. 7(2) 96-100(2008)).

Os resultados serão expressos em pg de amostra necessário para obter uma atividade equivalente à atividade detectada para 1 ug de pa- drão (=trolox). (Kit ACL).

Resultados: A atividade antioxidante estudada neste teste representa a habi- lidade em especificamente aprisionar ânions de superóxido através de qui- mioluminescência.

. Tabela 2: Avaliação e quantificação do poder antioxidante em equivalente de trolox. : m dante de referência A biomassa seca por congelamento preparada de acordo com o Exemplo 2a e o material flutuante de biomassa seca por congelamento moi- da preparada de acordo com o Exemplo 3 têm uma atividade de aprisiona- : mento anti-radical globalmente equivalente.

- 278 ug de biomassa seca por congelamento são necessários pa- ra obter uma atividade equivalente à atividade detectada para 1 ug de trolox: atividade equivalente à co-enzima Q10, a molécula antioxidante de referên- cia 171 ug de matéria flutuante de biomassa seca por congelamento moída são necessários para obter uma atividade equivalente à atividade de- tectada para 1 ug de trolox. Radicais livres, para os quais produção é aumentada como um resultado de agressões externas (frio, poluição, tabaco, UV), são responsá- veis por dano ao DNA da célula da pele, mas também DNA das membranas celular e mitocondrial. Esses radicais livres também desempenham um papel muito importante no processo de inflamação. Esses metabolitos muito reati- vos são segundos mensageiros de sinalização de estresse de oxidação celu- lare então mediadores precoces de inflamação (A. Van Der Viiet e col., Chem. Biol. Interaction 85: 95-116, 1992). A atividade anti-radical das preparações descritas nos Exemplos 2a e 3 ajuda a resistir a envelhecimentos da pele intrinseco e extrínseco e inflamação. —Exemplo7: AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DA ATIVIDADE METALOPROTEÁ-

SICA SOBRE FORMAÇÃO DE COLÁGENO DA MATRIZ EXTRACELULAR

. A matriz extracelular (ECM) (Extra-cellular Matriz) é uma estrutu- ra dinâmica com papéis estrutural e de regulagem para tecidos. Ela dá à pe- - le suas propriedades de turgescência e mecânicas. Na epiderme, ela ocupa o espaço intercelular e provê apoio para a estrutura epidérmica. Ela também controla trocas entre as células da epiderme e desempenha um papel em atividade celular. Ela é composta de fibras, particularmente colágeno e subs- tâncias fundamentais (água, sais, glicoproteínas, glicosaminoglicanos). Co- lágenos são proteínas fibrosas, formadas de três cadeias polipeptídicas que podem ser idênticas ou diferentes, conectadas por ligações de hidrogênio covalentes. Colágenos formam o componente essencial da rede fibrosa e - desempenham um papel mecânico provendo resistência e elasticidade à * pele.

: Quando uma célula é senescente, a maioria dos componentes da ECM é degradada por enzimas tipo endopeptidase ricas em zinco cha- madas Metaloproteinases de Matriz (MMPs) (Hideaki Nagase $ e J. Frede- rick Woessner, J Biol Chem, Vol. 274, Issue 31, 21491-21494, 30 de julho, 1999). Elas são membranosas ou secretadas, Todas as MMPs têm uma homologia de sequência e estrutura forte, mas diferem na especificidade do substrato. MMP1 ou "colagenase intersticial" predominantemente degrada colágeno tipo | (80% do teor na derme de pele normal) e também degrada colágenos tipos Il, VII, Vill e X.

Em um modelo de uma enzima de recombinação humana usan- do um substrato peptídico específico Mca - Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA- Ala- Arg-NH2, a requerente analisou o efeito de extratos sobre atividade enzimá- tica direta através de quantificação fluorimétrica (David Leppertd and coll, Analytical Biochemistry 328 (2004) 166-17).

A enzima ativada é pré-incubada com as preparações diferentes e é então posta na presença do substrato. A enzima cliva o peptídeo sepa- rando o fluoróforo Mca (7 metoxicumarin-4-il) acetila) do extintor Dpa (N — 3 — (2,4-Dinitrofenil) - L-2,3-diaminopropionila), O peptídeo então emite fluo- rescência com um comprimento de onda de 405 nm quando ele é excitado a 320 nm. Então, a atividade da enzima de MMP-1 é medida e é proporcional à fluorescência emitida. Com este teste in tubo, é possível detectar inibidores de atívida- - de de MMP-1 potenciais, uma enzima com um papel crucial na iniciação da degradação de colágeno. Foram medidas as porcentagens de inibição de atividade de MMP-1.

Cálculo da porcentagem de inibição enzimática relacionada com o inibidor ou o produto: % de inibição = 100 x (Atividade enzimática pura máxima-Atividade enzimática pura na presença de inibidon) Atividade enzimática pura máxima Resultados: O material flutuante preparado de acordo com o Exemplo 3 inibe ' significantemente a atividade de MMP-1 e dependente da dose de 60 a 500 É vom.

Tabela 3: Material flutuante de biomassa moída seca por congelamento (preparada de acordo com o Exemplo 3), resultados de inibição da MMP-1 em porcentagem (%).

CN — RN. Nu...

E

LA A biomassa seca por congelamento preparada de acordo com o Exemplo 2a foi testada de 60 a 1000 upa/ml. Devido à interferência físico- química da biomassa como um todo, a requerente não foi capaz de medir a atividade de inibição. No entanto, um extrato muito similar foi testado e mos- trouinibições significantes de 80 pg/ml a 1000 pg/ml.

O extrato preparado de acordo com o Exemplo 3 pode resistir à atividade aumentada de MMPs quando senescência ocorre e pode contribuir para manutenção do papel mecânico do colágeno, desta maneira provendo resistência e elasticidade à pele.

—Exemplo8: Medição da síntese de TGF-B1 em queratinócitos HaCaT TGF-B1 (Fator de Crescimento Transformante beta-1) pertence à superfamília de TGF-B secretado por tipos de célula diferentes e que de- sempenham um papel importante no controle de crescimento de célula e

. regulagem de respostas de célula e processos biológicos múltiplos.

As ativi- dades principais de citocinas nesta superfamília são que elas modulam proli- - feração da maioria das células, elas estimulam a proliferação de fibroblastos e aumentam a formação da matriz extracelular (Lawrence, 1996). TGF-B1 estátambém envolvido no reparo de lesões, processos de cicatrização (Cul- len e outros, 1997) particularmente através da indução de reorganização do citoesqueleto da célula (actina) e promoção da migração de células epiteliais (Boland e outros, 1996). A população de célula mais representada no tecido da pele é a população de queratinócito.

Ela forma uma fonte importante de fatores de crescimento que controlariam e influenciariam o comportamento . de células da pele, a saber fibroblastos (Ghahary e outros, 2001). =, Aparelhos e Métodos ' Produção de biomassa não elicitada: de acordo com o Exemplo 2a Preparação de biomassa elicitada Meio Murashige & Skoog é preparado sem fatores de crescimen- to (quinetina e 24D). Este meio é ajustado para pH 6 através da adição de KOH seguido por autoclave por 20 minutos a 121º C (p = 1 bar). Este meio é então inoculado a 1:5 do volume usando uma suspensão celular derivada de uma cultura de propagação.

Condições de elicitação são criadas imediata- mente em seguida através da adição estéril de uma solução concentrada de 6-benzilaminopurina (BAP ou (N-(fenilmetil)-7 H-purin-6-amina) e agentes de elicitação (ácido acetilsalicílico e metil-jasmonato) no DMSO de quinetina.

O resultado é um meio de elicitação EMS (vide Tabela 4). A cultura elicitada é então mantida por 15 dias em uma mesa de agitação no escuro à 115 RPM ea2z9ºC.A biomassa fresca é então coletada e seca em um funil Buchner antes de ser moída e centrifugada, e o material flutuante é estabilizado atra- vés de secagem por congelamento.

. Tabela 4. Meio EMS, a saber o meio modificada Murashige & Skoog usado para a cultura sob condições elicitadas de células de argânia em suspensão - em um Erlenmeyer.

Meio EMS- meio de elicitação NH,NOz 1,650 1900 | gm CaCl.2H0 0,44 Macroelementos MgSO,a.7H20 0,37 [= KtPos om | ar [Ko | ma | NMRSO,AHZO . ZnSO4.1H;0 mg/L - NazMoO,.2H;0 mg/L Microelementos i CuSO4.5H20 0,025 CoCh.6HzO 0,025 FeSsOs 7HZO Na2EDTA 2150 mio-Inositol mg/L 05 | mal Piridoxina-HCI 0,5 Vitaminas TamíaHol — | 05 | mae | Glcina 6-benzilaminopurina (BAP) 1 Fatores (hormônios do [oem | TT [mel | — crescimento) Ácido acetilsalicílico upM ss.

Agent: Matil jasmonato [too | um | gentes de elicitação Piruvato de Na Fontes carbonadas Queratinócitos HaCaT são tratados por 5 horas com os extratos diferentes eas células são então incubadas por 24 horas em DMEM a 37º C.. TGF-B1 é dosado nos materiais de flutuação de cultura com um estojo de ELISA.

Os efeitos de biomassa de argânia não elicitada preparada de acordo com o Exemplo 2a e da biomassa de argânia obtida após elicitação sobre a síntese de TGF-B1 em queratinócitos HaCaT humanos são mostra- dos na Figura 1 em anexo.

Eles mostram que em queratinócitos HaCaT, a

. biomassa de argânia não elicitada preparada de acordo com o Exemplo 2a (50 ug/mL) estimula a síntese de TGF-B1 em 48%, enquanto a biomassa de ' argânia elicitada inibe a síntese de TGF-B1 em 26% Exemplo 9: Medição da proliferação e da migração de célula de queratinóci- toshumanos Exemplo 9.a: Medição de proliferação de célula de queratinócitos humanos Cicatrização de lesões é um processo biológico complexo e di- nâmico que envolve a interação de muitos fatores locais e sistêmicos no re- paro normal de tecidos.

Progresso de cicatrização compreende quatro fases interdependentes: hemóstase, inflamação, proliferação e remodelagem.

Pro- : liferação implica em três processos claramente observáveis, a saber, granu- ” lação, contração e reepitelização. : Durante a granulação, proliferação de células que estarão envol- vidas no resto do processo de reparo é observada, com migração dessas células em direção ao leito da lesão.

Essas células incluem macrófagos, fi- broblastos e células endoteliais.

Macrófagos continuamente liberam fatores quimiotáticos e fatores de crescimento.

Os fibroblastos constroem a nova matriz celular necessária para o crescimento de células no fundo da lesão.

Esta base facilita migração celular.

Contração da lesão é um mecanismo para redução do tamanho da lesão e fibroblastos desempenham um papel principal nesta contração.

Reepitelização consiste em regeneração de uma epiderme que cobre uma lesão para reformar uma barreira eficaz contra o ambiente exter- no, capaz de ser pigmentada e restaurando suas funções sensorial e de i- —munidade.

Desta maneira ela implica em processos de migração e prolifera- ção de célula de queratinócito, mas também diferenciação deste neo-epitélio e restauração de uma membrana de base reconectando a derme e a epi- derme.

Quando a migração de células basais em direção ao centro da lesão permite que os dois lados da lesão se unam, uma onda de mitose de célula ocorre para preencher os espaços deixados pela migração e fornecer células para o tecido epitelial em regeneração tridimensional.

Etapas de proliferação de células de queratinócito, fibroblastos e

. células endoteliais podem ser consideradas como sendo um dos fenômenos funcionais que confirmam a atividade de cicatrização de um constituinte ati- ' vo. Um aumento na proliferação de fibroblastos e células endoteliais partici- paria da cicatrização da derme, enquanto um aumento na proliferação de queratinócitos participaria da reepitelização.

Aparelhos e métodos: proliferação de célula A técnica usada mede a incorporação de um nucleotídeo, 5- bromo-2'-desoxiuridina (BrdU), um análogo de timidina, no DNA de células na fase S.

Queratinócitos, isolados de pele descartada após cirurgia, são - cultivados em um KSFM completo (BPE 25 pg/ml; EGF 1,5 mg/ml). As célu- - las são incubadas na presença de moléculas a serem avaliadas por 48 horas Ú a 37º C em uma atmosfera com CO, 5%.

Incorporação de BrdU proporcional à taxa de proliferação celular é avaliada por um sistema de anticorpos anti-BrdU acoplados à peroxíidase. A adição de um substrato de peroxidase desenvolve uma reação colorida (Bio- trak Elisa System). A absorbância correspondente (DO) é medida a 450 nm. Desta maneira esse dado é proporcional à taxa de proliferação de célula.

A porcentagem de proliferação é então determinada usando a fórmula que segue: % de proliferação= =— DOtratado)-DO (teontrolemin) x100 DO (tcontrolemax) — (DO (controlemin) Nota: Controlenmin = células incubadas com o meio mínimo Controlemax = células incubadas com o meio completo Desta maneira, Controlemin corresponde à proliferação de 0% e Controlema, corresponde à proliferação de 100%. Os resultados sobre proliferação celular são mostrados na Figu- ra 2 que ilustra o efeito da biomassa de argânia preparada de acordo com o Exemplo 2a sobre a proliferação de queratinócitos humanos. Eles mostram que a biomassa de argânia preparada de acordo com o Exemplo 2a a 0,1 pa/mL estimula a proliferação de queratinócitos humanos em 25%. Nenhum efeito é medido quando a biomassa é testada a

- 0,01 po/mL. Exemplo 9.b: Medição de migração de célula de queratinócitos humanos 7 Aparelho e Métodos: migração de célula de queratinócitos HaCaT O protocolo usado para estudar a migração de célula é baseado nousode um estojo de 96 cavidades. O princípio deste teste consiste no estudo da migração de células em direção ao centro da cavidade (placa de 96 cavidades). Para conseguir isso, uma rolha é posta no centro de cada cavidade, de maneira a criar uma zona de detecção de diâmetro de 2 mm. As células de HaCaT são então semeadas em torno desta rolha. As rolhas são retiradas assim que as células estiverem bem ligadas à superfície em . torno das rolhas, e as células podem então migrar para a zona de detecção. - As placas sem as rolhas e com constituintes ativos são incubadas a 37º C : por 24 horas em DMEM SVF 0%. A quantidade de células localizadas na zona onde a rolha está localizada é então analisada, a fim de avaliar a mi- graçãode células. As células são marcadas com Hoechst 33342 e um cache é usado para ver e contar apenas as células localizadas nesta zona. Uma média de oito cavidades é feita para cada condição. Os resultados são expressos - como uma intensidade de fluorescência (IF — proporcional à quantidade de células que migraram); - como uma porcentagem de atividade com relação ao controle SVF 0%: 1F tratadas — IF 0%mia X100 1Ft controle0% SVF — IF 0% mig Nota: IF (0% mig) corresponde à IF (intensidade de fluorescência) de cavidades contendo as rolhas e então ao ruído de base.

A Figura 3 mostra os resultados de migração de célula e ilustra o efeito de biomassa da argânia preparada de acordo com o Exemplo 2a so- bre migração de queratinócitos HaCaT.

Eles mostram que a biomassa de argânia preparada de acordo com o Exemplo 2a, a 0,01 ou 0,03 pa/mL, estimula a migração de queratinó- citos HaCaT em 79% e 73%, respectivamente.

Claims (7)

, REIVINDICAÇÕES

1. Preparação derivada de uma cultura in vitro de células de ar- * gânia não elicitadas desdiferenciadas para uso no tratamento de envelheci- mento, inflamação e cicatrização da pele.

2. Preparação de acordo com a reivindicação 1 na forma de uma suspensão de célula, biomassa, biomassa moída, matéria flutuante de bio- massa moída ou matéria flutuante de cultura.

3. Composição cosmética ou dermatológica compreendendo uma preparação derivada de uma cultura de células de argânia desdiferen- ciadas não elicitadas tal como definido na reivindicação 1 ou 2 como o cons- . tituinte ativo, em associação com um excipiente cosmético ou dermatológico ' s aceitável. ' .

4. Composição de acordo com a reivindicação 3 caracterizada pelo fato de que a quantidade da preparação está entre 0,1 e 10% do peso totalda composição.

5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 e 4 para seu uso no tratamento de envelhecimento, inflamação e cicatriza- ção da pele.

6. Processo para obtenção da preparação tal como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que ele inclui as etapas que seguem: a) esterilização do material de planta b) desdiferenciação das células c) pôr em suspensão de célula com um meio de cultura sem eli- citador d) cultura de propagação e produção de biomassa com um meio de cultura sem elicitador, e obtenção da preparação.

7. Processo para tratamento cosmético de envelhecimento da —pelecompreendendo o uso de uma composição conforme definido em qual- quer uma das reivindicações 3 a 5.