CN102401812A - 一种室内检测杂交玉米种子纯度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种室内检测杂交玉米种子纯度的方法。通过配制电极缓冲液、样品提取液、分离胶缓冲液、分离胶溶液、浓缩胶缓冲液、浓缩胶溶液和3％的过氧化氢、染色液试剂，制备选用杂交玉米种子的样品和过凝胶制备，通过采用电泳、卸板、染色、洗板，计算电泳测定值，保存胶板，计算出杂交玉米的纯度值。本发明取分离胶和浓缩胶缓冲液定容的步骤，简化胶溶液配制程序，缓冲液不定容，待溶解完药品后将溶液一次性定容，这样配出来的浓缩胶溶液和分离胶溶液用于试验丝毫不会影响谱带的清晰性和完整性，而且配溶液过程减少了两个定容环节，更易操作，具有广泛的应用价值。

Description

一种室内检测杂交玉米种子纯度的方法
发明领域
本发明涉及玉米种子检测的技术领域。具体的说，本发明涉及一种室内检测杂交玉米种子纯度的技术领域。
背景技术
利用玉米盐溶蛋白电泳法测定杂交玉米种子纯度的方法已经在全国各地得到广泛应用，取得了较好的经济和社会效应，但是，目前普遍存在的试验过程比较繁琐，对于初学者来说难以快速掌握并得出清晰的谱带的技术缺陷。在现有技术提供的标准的试验方法里，浓缩胶和分离胶缓冲液需要在调好PH值后先定容，再用定容好的缓冲液来溶解丙烯酰胺等药品，然后再定容。在实际操作中试验人员很容易忘记给两种缓冲液定容，经常会直接拿未定容的缓冲液来溶解药品，结果就是前功尽弃，从头再来。如何简化或进一步研究一种快速简易适用于实验室检测杂交玉米种子纯度的方法具有广泛的实用性和重要性。
发明内容
针对现有技术目前普遍存在的试验过程比较繁琐，对于初学者来说难以快速掌握并得出清晰的谱带的技术缺陷，本发明旨在一种室内检测杂交玉米种子纯度的方法，该方法在传统试验方法的基础上加以简化，显著提高试验效率，比常规的试验操作时间节约2-3小时，操作实用简易，实用特性突显。
本发明的技术方案：通过配制电极缓冲液、样品提取液、分离胶缓冲液、分离胶溶液、浓缩胶缓冲液、浓缩胶溶液和催化剂溶液、染色液试剂，制备选用杂交玉米种子的样品和凝胶制备，通过采用电泳、卸板、染色、洗板，计算电泳测定值，保存胶板，计算出杂交玉米的纯度值。本发明采用一个分离胶和浓缩胶溶液配制的简便又不影响试验效果的方法，即取分离胶和浓缩胶缓冲液定容的步骤，简化胶溶液配制程序，缓冲液不定容，待溶解完药品后将溶液一次性定容，这样配出来的浓缩胶溶液和分离胶溶液用于试验丝毫不会影响谱带的清晰性和完整性，而且配溶液过程减少了两个定容环节，更易操作。
具体的，本发明提供一种室内检测杂交玉米种子纯度的方法，具体步骤如下：
1.按照常规配制方法，制备电极缓冲液、样品提取液、催化剂、染色液溶液备用。
2.分离胶溶液：取1.43ml乳酸钠于1000ml烧杯中，加去离子水900ml，用乳酸调至PH3.0，备用，取消常用的定容步骤；称取丙烯酰胺112.5g，甲叉双丙烯酰胺3.75g，抗坏血酸0.25g，硫酸亚铁8.0mg，用分离胶缓冲液溶解，定容至1000ml，过滤于棕色瓶中，放入4℃冰箱保存。
3.浓缩胶溶液：取0.30乳酸钠于200ml烧杯中，加去离子水90ml，用乳酸调至PH5.2，备用，取消常用的定容步骤；称取丙烯酰胺6.00g，甲叉双丙烯酰胺1.00g，抗坏血酸0.03g，硫酸亚铁0.8mg，用浓缩胶缓冲液溶解，定容至100ml，贮于棕色瓶中，放入4℃冰箱保存。
4.从送验样品中随机数取玉米种子100粒，用单籽粒粉碎器逐粒粉碎，放入1.5ml离心管中，按体积比1∶1.2的量用滴管加入样品提取液，摇匀，放置5min后再摇一次，静置30min后备用，取消了常用的样品提取液的离心步骤。
5.凝胶的制备：装槽、封底的操作采用常用的方法；
灌分离胶采用：底缝封住后，吸去因凝胶而析出的水，量取分离胶溶液，加入过氧化氢或过硫酸铵溶液，迅速摇匀；倾斜电泳槽，将分离胶溶液倒入两玻璃板之间，高度距短玻璃板上沿1.2cm，放平电泳槽并在试验台上振动后静置于桌面10min，取消了常用正丁醇镇压分离胶液面的步骤。
灌浓缩胶：量取浓缩胶溶液，加入过氧化氢或过硫酸铵溶液，迅速摇匀，倒入两玻璃板之间，马上插好样品梳，样品梳底部距分离胶顶部0.5cm。
6.点样、电泳、卸板、染色的操作采用常用的方法。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下技术效果：
1.本发明提供了室内检测杂交玉米种子纯度的简易方法。在常用的试验方法里，浓缩胶和分离胶缓冲液需要在调好PH值后先定容，再用定容好的缓冲液来溶解丙烯酰胺等药品，然后再定容。在实际操作中试验人员很容易忘记给两种缓冲液定容，经常会直接拿未定容的缓冲液来溶解药品，结果就是前功尽弃，从头再来。采用本发明，缓冲液不定容，待溶解完药品后将溶液一次性定容，这样配出来的浓缩胶溶液和分离胶溶液用于试验丝毫不会影响谱带的清晰性和完整性，而且配溶液过程减少了两个定容环节，更易操作，减少试验时间30min。
2.本发明取消常规方法中样品蛋白提取液的离心程序。在现有常用的试验方法里，粉碎后的籽粒在加入样品提取液提取30-40分钟后需要再放入离心机离心5分钟后静置，然后提取上清液电泳。以一份样品来说，100粒种子离心需要的时间至少是1个小时。如果取消离心，将提取液静置5-10分钟后上下摇匀，再静置20-30分钟，取上清液电泳，谱带也十分清晰，不影响实验效果。
3.本发明取消常规方法中用正丁醇镇压分离胶液面的步骤。在本发明中，往胶室中灌好分离胶后立即在桌面上振动几下电泳槽，胶面就可以非常平整，即使略微不平也不会影响电泳后的谱带整齐度，且减少试验时间30min。如果按常规操作方法，分离胶灌好后再用正丁醇镇压液面，再用去离子水清洗2-3次，不仅过程复杂，正丁醇还会挥发出对人体有害的气味，且用去离子水清洗时容易损伤胶面。
附图说明
图1所示为室内检测杂交玉米种子纯度的工艺流程图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有：
主要原辅材料：杂交玉米种子都可以通过市场购买获得。
主要试剂：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、乳酸、乳酸钠、甘氨酸、抗坏血酸、硫酸亚铁、氯化钠、蔗糖、甲基绿、三氯乙酸、过氧化氢(或过硫酸铵)、考马斯亮蓝R250、无水乙醇、丙三醇等，所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水。
主要仪器：电泳仪(500V±5V连续可调、0-400mA连续可调、额定输出功率200W)、电泳槽(垂直板夹心式)、单籽粒粉碎器、天平(感量0.01g、0.001g、0.0001g)各一台)、酸度计、磁力搅拌器、电冰箱、电炉、离心管(1.5ml)、离心管架、移液管(10ml、5ml、2ml各两支)、微量进样器(5-100μl)、恒温箱、观片灯等。
本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：室内检测杂交玉米种子纯度的方法
(一)试剂配制：按照常规配制方法，制备电极缓冲液、样品提取液、催化剂、染色液备用。
(二)样品制备
从送验样品中随机数取玉米种子100粒。用单籽粒粉碎器逐粒粉碎，放入1.5ml离心管中，按体积比约1∶1.2的量用滴管加入样品提取液，摇匀，放置5min后再摇一次，静置30min后备用。
(三)凝胶制备
1.将预先洗净晾干的玻璃板装入胶条中，并将胶条固定在垂直板电泳槽内，保持水平，短板向正极，拧紧螺栓，备用。
2.封底缝：根据电泳槽的大小，取适量分离胶溶液于烧杯中，用微量进样器加入适量3％的过氧化氢或过硫酸铵溶液，一般每15ml分离胶液加20μl3％的过氧化氢溶液，迅速摇匀并从长玻璃板外侧沿玻璃板倒入，放入电泳槽振动几下，约5min后胶液凝固，封住底缝。
3.灌分离胶：底缝封住后，用滤纸条插入两玻璃板之间，吸去因凝胶而析出的水，量取分离胶溶液适量，加入3％的过氧化氢或过硫酸铵溶液，一般每15ml胶液加20μl3％的过氧化氢溶液，迅速摇匀；倾斜电泳槽，将分离胶溶液倒入两玻璃板之间，高度距短玻璃板上沿1.2cm，放平电泳槽并在试验台上振动几下后，静置。5～10min后胶凝固，吸出胶面上析出的水，并用去离子水冲洗胶面2-3次，用滤纸条吸干。
4.灌浓缩胶：量取适量浓缩胶溶液，加入适量3％过氧化氢或过硫酸铵溶液，一般每5ml浓缩胶液加40μl3％的过氧化氢溶液，迅速摇匀，倒入两玻璃板之间，马上插好样品梳，样品梳底部距分离胶顶部0.5cm，
5.点样：浓缩胶凝胶后，小心拔出样品梳并将样品槽用滤纸条或注射器吸干，用微量进样器在每个样品槽中加入不同籽粒的样品上清液25-30μl，每点一粒样后要用去离子水清洗进样器2-3次。
(四)电泳
加样完毕后，小心倒入电极缓冲液，上槽电极缓冲液面要高于短玻璃板，下槽电极缓冲液面要高于铂金丝；将电源线正极接上槽，负极接下槽，接通电源，采用500V稳压进行电泳，待甲基绿指示剂下移至距胶底部边缘0.5-1.0cm处时关闭电源。
(五)卸板
倒出电极液，从电泳槽内取出胶室，卸下胶条，启开玻璃板，取出胶片，浸入染色液中。
(六)染色
在30℃恒温条件下染色2-4h。
(七)洗板
取出胶片，用0.5％的洗衣粉水洗净。
(八)结果鉴定
在观片灯上鉴定胶板上电泳谱带的特征和一致性，计算被检样品中异品种粒数和本品种粒数，并计算电泳测定值。
(九)胶板保存
可用照相和扫描的方法将图谱记录保存，也可进行干板保存。干板保存的方法是：用50％甘油水溶液将玻璃纸浸透，取出后在玻璃纸下垫1块平板玻璃，将洗净的胶板平铺纸上，除去气泡，再盖上1张甘油浸过的玻璃纸，除去气泡，四周压实，贴上标签，自然干燥或进行低温(＜40℃)烘干。
(十)结果计算
将电泳测定值代入回归方程(Y＝52.9+0.461X，其中X为样品的电泳测定值，Y为样品纯度值)，计算出样品纯度值。
实施例二：室内检测四单十九杂交玉米种子纯度的方法
(一)试剂配制：按照常规配制方法，制备电极缓冲液、样品提取液、催化剂、染色液备用。
(二)样品制备
从送验样品中随机数取四单十九杂交种玉米种子100粒。用单籽粒粉碎器逐粒粉碎，放入1.5ml离心管中，按体积比约1∶1.2的量用滴管加入样品提取液，摇匀，放置5min后再摇一次，静置30min后备用。
(三)凝胶制备
1.将预先洗净晾干的玻璃板装入胶条中，并将胶条固定在垂直板电泳槽内，保持水平，短板向正极，拧紧螺栓，备用。
2.封底缝：根据电泳槽的大小，取适量分离胶溶液于烧杯中，用微量进样器加入适量3％的过氧化氢或过硫酸铵溶液，一般每15ml分离胶液加20μl3％的过氧化氢溶液，迅速摇匀并从长玻璃板外侧沿玻璃板倒入，放入电泳槽振动几下，约5min后胶液凝固，封住底缝。
3.灌分离胶：底缝封住后，用滤纸条插入两玻璃板之间，吸去因凝胶而析出的水，量取分离胶溶液适量，加入3％的过氧化氢或过硫酸铵溶液，一般每15ml胶液加20μl3％的过氧化氢溶液，迅速摇匀；倾斜电泳槽，将分离胶溶液倒入两玻璃板之间，高度距短玻璃板上沿1.2cm，放平电泳槽并在试验台上振动几下后，静置。5～10min后胶凝固，吸出胶面上析出的水，并用去离子水冲洗胶面2-3次，用滤纸条吸干。
4.灌浓缩胶：量取适量浓缩胶溶液，加入适量3％过氧化氢或过硫酸铵溶液，一般每5ml浓缩胶液加40μl3％的过氧化氢溶液，迅速摇匀，倒入两玻璃板之间，马上插好样品梳，样品梳底部距分离胶顶部0.5cm。
5.点样：浓缩胶凝胶后，小心拔出样品梳并将样品槽用滤纸条或注射器吸干，用微量进样器在每个样品槽中加入四单十九样品不同籽粒的样品上清液25-30μl，每点一粒样后要用去离子水清洗进样器2-3次。
(四)电泳
加样完毕后，小心倒入电极缓冲液，上槽电极缓冲液面要高于短玻璃板，下槽电极缓冲液面要高于铂金丝；将电源线正极接上槽，负极接下槽，接通电源，采用500V稳压进行电泳，待甲基绿指示剂下移至距胶底部边缘0.5-1.0cm处时关闭电源。
(五)卸板
倒出电极液，从电泳槽内取出胶室，卸下胶条，启开玻璃板，取出胶片，浸入染色液中。
(六)染色
在30℃恒温条件下染色2-4h。
(七)洗板
取出胶片，用0.5％的洗衣粉水洗净。
(八)结果鉴定
在观片灯上鉴定胶板上电泳谱带的特征和一致性，其中本品种粒数97粒，异品种粒数3粒，因此此四单十九样品电泳测定纯度为97.0％。
(九)胶板保存
可用照相和扫描的方法将图谱记录保存，也可进行干板保存。干板保存的方法是：用50％甘油水溶液将玻璃纸浸透，取出后在玻璃纸下垫1块平板玻璃，将洗净的胶板平铺纸上，除去气泡，再盖上1张甘油浸过的玻璃纸，除去气泡，四周压实，贴上标签，自然干燥或进行低温(＜40℃)烘干。
(十)结果计算
将电泳测定值97.0％
代入回归方程(Y＝52.9+0.461X，其中X为样品的电泳测定值，Y为样品纯度值)，计算出此样品纯度值为97.6％。
真实性及品种纯度室内鉴定记载表
                                                  No.
实施例三：室内检测KX1568杂交玉米种子纯度的方法
(一)试剂配制：按照常规配制方法，制备电极缓冲液、样品提取液、催化剂、染色液备用。
(二)样品制备
从送验样品中随机数取KX1568杂交种玉米种子100粒。用单籽粒粉碎器逐粒粉碎，放入1.5ml离心管中，按体积比约1∶1.2的量用滴管加入样品提取液，摇匀，放置5min后再摇一次，静置30min后备用。
(三)凝胶制备
1、2、3、4的装槽、封底缝、灌分离胶、浓缩胶的操作方法同实施例二。
5、点样：浓缩胶凝胶后，小心拔出样品梳并将样品槽用滤纸条或注射器吸干，用微量进样器在每个样品槽中加入KX1568样品不同籽粒的样品上清液25-30μl，每点一粒样后要用去离子水清洗进样器2-3次。
(四)(五(六(七)的电泳、卸板、染色、洗板的操作方法同实施例二。
(八)结果鉴定
在观片灯上鉴定胶板上电泳谱带的特征和一致性，其中本品种粒数97粒，异品种粒数4粒，因此此KX1568样品的电泳测定纯度为96.0％。
(九)胶板保存
同实施例二。
(十)结果计算
将电泳测定值96.0％代入回归方程(Y＝52.9+0.461X，其中X为样品的电泳测定值，Y为样品纯度值)，计算出此KX1568样品纯度值为97.2％。
真实性及品种纯度室内鉴定记载表
                                                No.
Figure BSA00000558538700101
通过以上实施例，实际的试验时间为5个小时，如果按照标准方法操作，则试验时间为7-8小时，因此采用本发明可以缩短试验时间2-3个小时，而且对谱带清晰度和试验结果没有影响。

Claims (1)

1.一种室内检测杂交玉米种子纯度的方法，通过配制电极缓冲液、样品提取液、分离胶缓冲液、分离胶溶液、浓缩胶缓冲液、浓缩胶溶液、过氧化氢和染色液试剂，制备选用杂交玉米种子的样品和凝胶制备，通过采用电泳、卸板、染色、洗板，计算电泳测定值，保存胶板，计算出杂交玉米的纯度值，其特征在于，所述的方法具体包括如下步骤：
(1)分离胶溶液：取1.43ml乳酸钠于1000ml烧杯中，加去离子水980ml，用乳酸调至PH3.0，备用，取消常用的定容步骤；称取丙烯酰胺112.5g，甲叉双丙烯酰胺3.75g，抗坏血酸0.25g，硫酸亚铁8.0mg，用分离胶缓冲液溶解，定容至1000ml，过滤于棕色瓶中，放入4℃冰箱保存；
(2)浓缩胶溶液：取0.30乳酸钠于200ml烧杯中，加去离子水90ml，用乳酸调至PH5.2，定容至100ml，备用，取消常用的定容步骤；称取丙烯酰胺6.00g，甲叉双丙烯酰胺1.00g，抗坏血酸0.03g，硫酸亚铁0.8mg，用浓缩胶缓冲液溶解，定容至100ml，贮于棕色瓶中，放入4℃冰箱保存；
(3)从送验样品中随机数取玉米种子100粒，用单籽粒粉碎器逐粒粉碎，放入1.5ml离心管中，按体积比1∶1.2的量用滴管加入样品提取液，摇匀，放置5min后再摇一次，30min后用离心机在5000r/min条件下离心15min，取消了常用的样品提取液的离心步骤，备用；
(4)灌分离胶采用：底缝封住后，吸去因凝胶而析出的水，量取分离胶溶液，加入过氧化氢或过硫酸铵溶液，迅速摇匀；倾斜电泳槽，将分离胶溶液倒入两玻璃板之间，高度距短玻璃板上沿1.2cm，放平电泳槽并在试验台上振动后静置于桌面10min，取消了常用正丁醇镇压分离胶液面的步骤；
灌浓缩胶：量取浓缩胶溶液，加入过氧化氢或过硫酸铵溶液，迅速摇匀，倒入两玻璃板之间，马上插好样品梳，样品梳底部距分离胶顶部0.5cm。
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