CN103399076A - 一种玉米种子纯度鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种玉米种子纯度鉴定方法。与传统技术相比，本发明（1）通过对丙烯酸胺和N，N’一亚甲基双丙烯酰胺的浓度进行调整，分离胶胶片的韧性和硬度得到大幅度提高；（2）删除浓缩胶，并通过降低电压降低电泳速度，分子量大小不同的蛋白质在进入分离胶之前能聚集在同一水平线上；（3）本发明筛选出了甲基绿AR-0721，其迁移速度与蛋白质分子迁移速度同步，便于查看试验程序是否完成；（4）改进了样品提取温度和染色条件，大大缩短了提取和鉴定时间，提高了鉴定效率，同时还简化了分离胶的固定程序。（5）增加了胶片的清洗和保存程序，研制出清洗液和保存液，既方便了试验结果鉴定又便于凝胶胶片保存。
Description
技术领域
本发明涉及一种玉米种子纯度鉴定方法，具体应用于种子纯度快速鉴定及种质资源鉴定领域。
背景技术
品种纯度是玉米种子的主要质量指标，对玉米的质量和产品品质都有直接而显著的影响。我国玉米生产因种子纯度低造成的损失惊人，仅仅由于纯度低而导致的减产有可能抵消一个新品种的增产潜力。
玉米种子纯度鉴定技术是当前我国种子检验工作的重点和难点之一，也是种子管理工作中迫切需要解决的问题。目前，种子纯度鉴定的方法主要有：形态鉴定法、蛋白质电泳法和以DNA分子多态性为依据的分子标记鉴定法等。其中，蛋白质电泳技术（如中华人民共和国农业行业标准《玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法NY/T449-2001》）鉴定玉米种子纯度目前已广泛应用于生产实践中，由于该方法鉴定结果准确可靠，逐渐成为玉米种子纯度和品种真实性室内鉴定的一种快速有效的方法，可快速有效地预控生产中假劣玉米种子坑农害农现象。但传统的电泳技术在操作过程中存在以下问题：蛋白提取耗时长、胶片韧性和硬度不够、制胶程序繁琐、染色效率低等缺点，降低了检验的效率。
发明内容
为克服原有电泳技术的不足，本发明在溶液配制、样品提取、凝胶制备、电泳、染色等过程做了大量技术改进，具有工艺流程简洁、操作简单、耗时短等特点。
本发明的技术方案是：一种玉米种子纯度鉴定方法，包括溶液配制、样品提取、凝胶制备、点样、电泳、卸板、凝胶染色和结果计算，其特征是，所凝胶染色后还需要清洗凝胶胶片；其中：
（1）溶液配制
包括配制电极缓冲液、样品提取液、分离胶溶液、3%的过氧化氢溶液、染色液和凝胶胶片清洗液；
所述样品提取液中采用甲基绿AR-0721为指示剂；
所述分离胶溶液为：取1.43mL乳酸钠加去离子水980mL；然后加入丙烯酸胺129.38g，N，N’一亚甲基双丙烯酰胺4.31g，抗坏血酸0.25g，硫酸亚铁8.0mg；溶解后，用乳酸调至pH3.0，再加去离子水定容至1000mL，过滤于棕色瓶中，在4℃条件下保存；
所述凝胶胶片清洗液为：取碳酸钠6.0g，十二烷基苯磺酸2.0g，羧甲基纤维素（CMC）0.6g，三聚磷酸钠1.0g，40wt%的硅酸钠溶液0.4g，用水溶解，定容至500ml备用；
（2）样品提取
将粉碎后的玉米种子加入样品提取液在30℃恒温箱静置提取20分钟，取上清液用于电泳；
（3）凝胶制备
将预先洗净晾干的玻璃板装入胶条中，平放在桌面上；取分离胶溶液于烧杯中，用微量进样器加入3%的过氧化氢溶液，迅速摇匀，沿长玻璃板边缘均匀倒入，马上插好样品梳，放平；
（4）点样
分离胶聚合后，拔出样品梳并将样品槽清理干净，用微量进样器在每个样品槽中加入不同籽粒的样品上清液；
（5）电泳、卸板
加样完毕后，倒入电极缓冲液；接通电源，采用300V稳压进行电泳，待甲基绿AR-0721指示剂下移至胶底部边缘时，关闭电源；卸板；
（6）凝胶染色、清洗凝胶胶片
在35℃恒温条件下胶片染色30分钟，将胶片取出置于凝胶胶片清洗液中，并轻轻振荡3分钟；清洗完毕后，用水清洗三次后观察电泳图谱并进行结果计算。
本发明的进一步技术方案是：对最终的凝胶胶片进行保存：把保鲜膜摊平于平整桌面，将染色后的电泳胶片置于凝胶片保存液中湿润5分钟；取浸润的胶片置于保鲜膜上，排除气泡后将胶片密封。所述凝胶片保存液为：取甘油300ml，用水稀释定容至1000ml备用。
本发明在下述几个方面进行了技术改进：
（1）溶液配制
针对分离胶胶片的硬度和韧度不够等缺点，通过对分离胶组成成分丙烯酸胺和N，N’一亚甲基双丙烯酰胺的浓度进行了调整，韧性和硬度得到大幅度提高，便于试验操作和观察。根据试剂的不同特点，对15种试剂进行了混合配制，目前只需配制7种混合母液即可涵盖整个试验流程。
（2）凝胶制备
传统电泳技术的胶片分为浓缩胶和分离胶，本技术经改进删除浓缩胶后，通过降低电压（原电泳技术采用500V电压），采用300V电压，降低电泳速度，同样也能起到浓缩胶的作用，分子量大小不同的蛋白质在进入分离胶之前能聚集在同一水平线上。通过技术创新，试验效果没有受到影响，简化了操作程序，降低了成本。
（3）电泳指示剂的筛选
不同种类甲基绿指示剂由于分子量大小不同，迁移速度也不同，传统电泳技术是根据甲基绿的迁移时间推算蛋白质电泳过程是否结束，通过试验，本技术筛选出了甲基绿AR-0721（分子量为608.75），其迁移速度与蛋白质分子迁移速度同步，便于查看试验程序是否完成。
（4）样品提取和胶片染色
传统的电泳技术样品提取在室温（25℃）下，提取时间为60分钟，改进温度后，在30℃恒温箱提取时间只需20分钟。原电泳技术胶片染色需要2-4小时，改进后在35℃恒温箱内染色30分即可达到相同效果，本技术改进大大缩短鉴定时间，提高了鉴定效率。同时还简化了分离胶的固定程序。
（5）胶片观察与保存
本创新技术增加了胶片的清洗和保存程序，研制出清洗液和保存液，把胶片在清洗液清洗后，胶片背景清晰，然后置于保存液中湿润，用保鲜膜将胶片的两面密封，既方便了试验结果鉴定又便于凝胶胶片保存。
本发明的有益效果是：本发明在溶液配制、凝胶制备、电泳指示剂的筛选、染色及胶片的清洗及保存等过程做了大量技术改进，具有工艺流程简洁、操作简单、耗时短等特点。传统的电泳技术整个流程需要24小时，经过改进后的鉴定技术只需4小时就能完成整个流程，大大提高了效率。
附图说明
图1为本发明实施1的电泳图谱；
图2为使用NY/T449-2001方法的电泳图谱。
具体实施方式
实施例1
1、溶液配制
（1）电极缓冲液
称取甘氨酸6.00g，倒入2000mL烧杯中，加入1800mL去离子水溶解，用2.0ml乳酸调至pH3.3，再加去离子水定客至2000mL，混匀。
（2）样品提取液
称取氯化钠5.80g，蔗糖200.00g，甲基绿AR-0721（分子量为608.75）0.1515g，倒入1000mL烧杯中，加去离子水800ml。溶解，加热至微沸，放至室温，再用去离子水定容至1000mL。在4℃条件下保存。
（3）分离胶溶液
取1.43mL乳酸钠加去离子水980mL，然后加入丙烯酸胺129.38g，N，N’一亚甲基双丙烯酰胺4.31g，抗坏血酸0.25g，硫酸亚铁8.0mg，溶解后，用乳酸调至pH3.0，再加去离子水定容至1000mL，过滤于棕色瓶中，在4℃条件下保存。
（4）3%的过氧化氢溶液
取30%的过氧化氢lmL，加9mL去离子水，贮于棕色瓶中，在4℃条件下保存。
（5）染色液
称取考马斯亮蓝（R250）2.00g，在研钵中用100mL无水乙醇研磨溶解。过滤于棕色瓶中。取10mL该溶液，加入到200ml的10%（W／V）三氯乙酸溶液中，混匀。
（6）凝胶胶片清洗液
取碳酸钠6.0g，十二烷基苯磺酸2.0g，羧甲基纤维素（CMC）0.6g，三聚磷酸钠1.0g，40wt%的硅酸钠溶液0.4g，用水溶解，定容至500ml备用。
（7）凝胶片保存液
取甘油300ml，用水稀释定容至1000ml备用。
2、样品提取
从送验样品中随机分取玉米种子至少100粒，用单籽粒粉碎器粉碎，放入1.5mL离心管中，用滴管加入与样品体积相同的样品提取液，在30℃恒温箱静置提取20分钟，取上清液用于电泳。
3、凝胶制备
将预先洗净晾干的玻璃板装人胶条中，平放在桌面上，取适量分离胶溶液于烧杯中，用微量进样器加入适量3%的过氧化氢溶液（一般每15mL分离胶溶液加3%过氧化氢20μL），迅速摇匀，沿长玻璃板边缘均匀倒入，马上插好样品梳，放平。
4、点样
分离胶聚合后，拔出样品梳并将样品槽清理干净，用微量进样器在每个样品槽中加入不同籽粒的样品上清液约15μL，每点一粒后，都要用去离子水清洗进样器3次。
5、电泳
加样完毕后，倒入电极缓冲液，上槽电极缓冲液面要高于短玻璃板，下槽电极缓冲液面要高于铂金丝；将电源线正极接上槽，负极接下槽；接通电源，采用300V稳压进行电泳，约1小时后，待甲基绿指示剂下移至胶底部边缘时，关闭电源。
6、卸板
倒出电极液，从电泳槽内取出胶室，卸下胶条，启开玻璃板，取出胶片，浸入染色液中。
7、凝胶染色与清洗凝胶胶片
在35℃恒温条件下胶片染色30分钟，将胶片取出置于凝胶胶片清洗液，并轻轻振荡3分钟。清洗完毕后，用水清洗三次后可直接观察电泳图谱。
8、结果计算
将染色、清洗后的凝胶胶片，在观片灯上通过不同品种特征谱带进行一致性鉴定，统计出非本品种粒数，并按式(1)计算电泳测定值X。
X(%)=100×(供检样品粒数－非本品种粒数)／供检样品粒数………(1)
将电泳测定值X代人式(2)回归方程，计算出样品纯度值Y
Y=52.9+0.461X………………………………………………………(2)
9、凝胶胶片的保存
首先将染色后的电泳胶片置于凝胶片保存液中湿润5分钟。胶片浸润期间把保鲜膜摊平于平整桌面。
取浸润的胶片置于保鲜膜上，排除气泡后将胶片密封，用Staetler记号笔标记检测编号、品种等内容于保鲜膜上，此方法密封胶片保存可至2年。
试验例：
对客户提供的玉米种子郑单958进行纯度进行鉴定，结果比较如下：采用本发明实施例1中的方法测定该玉米种子纯度，电泳计算值为98.4%。具体的电泳图谱见图1。
对同一样品，按照中华人民共和国农业行业标准《玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法NY/T449-2001》的方法测定该玉米种子纯度，电泳计算值为98.4%。具体的图谱见图2。
对改进前后的图谱进行比较，结果表明：电泳条带具有同样的清晰度，染色效果相同，同时电泳值计算相同，检测结果一致。实施效果良好。
Claims (2)
1.一种玉米种子纯度鉴定方法，包括溶液配制、样品提取、凝胶制备、点样、电泳、卸板、凝胶染色和结果计算，其特征是，所述凝胶染色后还需要清洗凝胶胶片；其中：
（1）溶液配制
包括配制电极缓冲液、样品提取液、分离胶溶液、3%的过氧化氢溶液、染色液和凝胶胶片清洗液；
所述样品提取液中采用甲基绿AR-0721为指示剂；
所述分离胶溶液为：取1.43mL乳酸钠加去离子水980mL；然后加入丙烯酸胺129.38g，N，N’一亚甲基双丙烯酰胺4.31g，抗坏血酸0.25g，硫酸亚铁8.0mg；溶解后，用乳酸调至pH3.0，再加去离子水定容至1000mL，过滤于棕色瓶中，在4℃条件下保存；
所述凝胶胶片清洗液为：取碳酸钠6.0g，十二烷基苯磺酸2.0g，羧甲基纤维素0.6g，三聚磷酸钠1.0g，40wt%的硅酸钠溶液0.4g，用水溶解，定容至500ml备用；
（2）样品提取
将粉碎后的玉米种子加入样品提取液在30℃恒温箱静置提取20分钟，取上清液用于电泳；
（3）凝胶制备
将预先洗净晾干的玻璃板装入胶条中，平放在桌面上；取分离胶溶液于烧杯中，用微量进样器加入3%的过氧化氢溶液，迅速摇匀，沿长玻璃板边缘均匀倒入，马上插好样品梳，放平；
（4）点样
分离胶聚合后，拔出样品梳并将样品槽清理干净，用微量进样器在每个样品槽中加入不同籽粒的样品上清液；
（5）电泳、卸板
加样完毕后，倒入电极缓冲液；接通电源，采用300V稳压进行电泳，待甲基绿AR-0721指示剂下移至胶底部边缘时，关闭电源；卸板；
（6）凝胶染色、清洗凝胶胶片
在35℃恒温条件下胶片染色30分钟，将胶片取出置于凝胶胶片清洗液中，并轻轻振荡3分钟；清洗完毕后，用水清洗三次后观察电泳图谱并进行结果计算。
2.如权利要求1所述的一种玉米种子纯度鉴定方法，其特征是，对步骤（6）清洗后的凝胶胶片进行保存：把保鲜膜摊平于平整桌面，将染色后的电泳胶片置于凝胶片保存液中湿润5分钟；取浸润的胶片置于保鲜膜上，排除气泡后将胶片密封；所述凝胶片保存液为：取甘油300ml，用水稀释定容至1000ml备用。
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