CN104611442A - 用于鉴别宁夏水稻品种的引物组合物及其应用 - Google Patents

用于鉴别宁夏水稻品种的引物组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴别宁夏水稻品种的引物组合物及其应用。本发明的引物组合物由以下引物对组成：RM1195、RM3482、RM208、RM8208、RM5473、RM430、RM1370、RM336、RM6670、RM223、RM219、RM333、RM536和RM1337引物对。所述引物对由其对应的上游引物和下游引物组成。该引物组合物还包括RM297、RM525、RM251、RM8277、RM5414、RM249、RM253、RM528、RM481、RM72、RM160、RM7217、RM224和RM247引物对。利用本发明中的28对核心引物，参试的47份品种(系)中，除宁粳23号和宁粳28号、宁粳23号和宁粳35号各有1对引物差异，判别为相似品种外，其余品种间均有2对或2对以上引物差异，品种间能够被区分。本发明确定的前14对引物可以区分参试47份材料中的40份，占85.1％。具有灵敏度高、分辨力好、结果准确可靠等优点。

Description

用于鉴别宁夏水稻品种的引物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及鉴别水稻品种技术领域，特别涉及用于鉴别宁夏水稻品种的引物组合物及其应用。
背景技术
传统的品种鉴定是根据种子、幼苗及植株的形态特征和农艺性状进行鉴定的，主要测试品种的特异性、一致性和稳定性。这些鉴定方法存在时间长、费用大、占用土地等应用局限性问题，同时这种方法也只适用于品种间差异明显的样品的鉴定。利用分子技术进行品种鉴定具有不受环境影响、快速高效、可用标记多等优点。基于PCR技术的SSR标记具有多态丰富、共显性、稳定、技术简单易行、成本低等特性，目前是构建指纹图谱有效鉴别品种真实性的理想标记。
参照NY/T 1433-2014《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》提供的48对引物，对宁夏47份水稻品种(系)进行分析，结果表明，48对引物中21对引物没有多态性；利用其余27对引物对参试材料比较分析，只有34份品种能够被区分(品种间有2对或2对引物以上差异)，占参试材料的72.3％；而表型相似的品种如宁粳41和富源4号，宁粳28、宁粳23、宁粳35，宁香稻2号、宁香稻3号等均不能区分。由此可见，由于宁夏水稻遗传基础狭窄，品种间遗传差异性较小，NY/T 1433-2014《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》不能对宁夏水稻品种进行完全有效的鉴定。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴别宁夏水稻品种的引物组合物及其应用。
本发明提供的用于鉴别宁夏水稻品种的引物组合物，主要由RM1195、RM3482、RM208、RM8208、RM5473、RM430、RM1370、RM336、RM6670、RM223、RM219、RM333、RM536和RM1337引物对组成；
所述RM1195引物对由序列1和序列2所示DNA组成的引物对；
所述RM3482引物对由序列3和序列4所示DNA组成的引物对；
所述RM208引物对由序列5和序列6所示DNA组成的引物对；
所述RM8208引物对由序列7和序列8所示DNA组成的引物对；
所述RM5473引物对由序列9和序列10所示DNA组成的引物对；
所述RM430引物对由序列11和序列12所示DNA组成的引物对；
所述RM1370引物对由序列13和序列14所示DNA组成的引物对；
所述RM336引物对由序列15和序列16所示DNA组成的引物对；
所述RM6670引物对由序列17和序列18所示DNA组成的引物对；
所述RM223引物对由序列19和序列20所示DNA组成的引物对；
所述RM219引物对由序列21和序列22所示DNA组成的引物对；
所述RM333引物对由序列23和序列24所示DNA组成的引物对；
所述RM536引物对由序列25和序列26所示DNA组成的引物对；
所述RM1337引物对由序列27和序列28所示DNA组成的引物对。
本发明所述的用于鉴别宁夏水稻品种的引物组合物，还包括RM297、RM525、RM251、RM8277、RM5414、RM249、RM253、RM528、RM481、RM72、RM160、RM7217、RM224、RM247引物对；
所述RM297引物对由序列29和序列30所示DNA组成的引物对；
所述RM525引物对由序列31和序列32所示DNA组成的引物对；
所述RM251引物对由序列33和序列34所示DNA组成的引物对；
所述RM8277引物对由序列35和序列36所示DNA组成的引物对；
所述RM5414引物对由序列37和序列38所示DNA组成的引物对；
所述RM249引物对由序列39和序列40所示DNA组成的引物对；
所述RM253引物对由序列41和序列42所示DNA组成的引物对；
所述RM528引物对由序列43和序列44所示DNA组成的引物对；
所述RM481引物对由序列45和序列46所示DNA组成的引物对；
所述RM72引物对由序列47和序列48所示DNA组成的引物对；
所述RM160引物对由序列49和序列50所示DNA组成的引物对；
所述RM7217引物对由序列51和序列52所示DNA组成的引物对；
所述RM224引物对由序列53和序列54所示DNA组成的引物对；
所述RM247引物对由序列55和序列56所示DNA组成的引物对。
所述的引物组合物可用于鉴别宁夏水稻品种。本发明以宁夏审定且确认的44份品种和3份已完成生产试验待审定的品系为材料，通过筛选的28对核心引物鉴定判别，能够较好的将各品种区分开来。尤其是能够区分表型性状不易判别的品种，如宁粳41和富源4号，宁粳35号和宁粳28号，宁粳36号和宁粳47号等。
本发明还保护一种用于鉴别宁夏水稻品种的试剂盒。所述试剂盒中，还可包括用于提取基因组DNA的试剂和/或用于PCR扩增的试剂。所述试剂盒中的各个组分可为液体，也可为冻干粉。
本发明还保护一种应用所述引物组合物鉴别宁夏水稻品种的方法，包括如下步骤：以待测水稻的DNA基因组为模板，分别用所述RM1195、所述RM3482、所述RM208、所述RM8208、所述RM5473、所述RM430、所述RM1370、所述RM336、所述RM6670、所述RM223、所述RM219、所述RM333、所述RM536和所述RM1337引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；将所述PCR扩增产物进行电泳、染色及鉴定。
当样品间检测出的差异位点数小于2时，以待测水稻品种DNA基因组为模板，分别用所述RM297、所述RM525、所述RM251、所述RM8277、所述RM5414、所述RM249、所述RM253、所述RM528、所述RM481、所述RM72、所述RM160、所述RM7217、所述RM224、所述RM247引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；将所述PCR扩增产物进行电泳、染色及鉴定。
利用本发明中的28对核心引物，参试的47份品种(系)中，除宁粳23号和宁粳28号、宁粳23号和宁粳35号各有1对引物差异，判别为相似品种外，其余品种间均有2对或2对以上引物差异，品种间能够被区分。本发明确定的前14对引物可以区分参试47份材料中的42份，占89.4％。具有灵敏度高、分辨力好、结果准确可靠等优点。
本发明技术方案的制定，使宁夏水稻品种鉴定在分子水平上有标准可循，与表型鉴定相结合，在品种审定方面，有利于仿冒雷同品种的检出；可以对待审定品种和审定品种进行有效的判别，填补了利用分子标记技术判别宁夏水稻品种的空白。在品种保护、市场监管、生产利用等方面，有利于防止套牌、假种子等的危害，保护育种家及农户的合法权益。因此，本发明的实施具有良好的社会效益。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明参试的47份品种(系)是通过2年表型鉴定试验仔细甄别，确保了品种的真实性。
实施例1：
(一)、田间鉴定
1、将构建指纹图谱的材料(来源于宁夏目前审定的水稻品种及优异品系60份)育秧后单本插值。田间管理同大田生产。逐株编号挂牌，调查各农艺性状，并参考杨占烈等田间鉴定方法鉴定并记载杂株类型。
2、成熟时去除边行，随机取中间5株考种，计算理论产量，同时将小区剩余单株实收测产。
3、在分蘖盛期田间取样，按1-10行每行分别取10个单株叶片并等量混合，1-10列每列分别取10个单株叶片并等量混合，每小区共30个样，分别记录每个混合样的行、列号。SSR鉴定时，行列号交叉处SSR标记为该单株的特征标记。
(二)、实验室提取
2.1样品准备
检测样品为种子时，从供试样品中随机取50粒种子于25℃左右的水中浸种3d，28℃左右恒温培养箱培养7d左右，随机选25株幼苗提取基因组DNA；检测样品为组织器官时，随机选25个样品提取基因组DNA。每个品种分别检测10个个体，对一致性差的品种可增加检测个体数，同一批品种的各个体按下述步骤同步进行。
2.2DNA提取
2.2.1DNA提取步骤
CTAB提取法：幼苗或叶片约300mg～400mg，置于2.0mL离心管，加液氮充分研磨；每管加入700μL 65℃预热的CTAB提取液后，充分混合，65℃保温60min，期间每隔10min颠倒混匀；每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇混合液，摇床慢摇30min充分混匀；12,000rpm离心10min后，吸取上清液至一新离心管，再加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管数次混匀，在-20℃下放置30min；12,000rpm离心10min，弃上清液；加入75％乙醇，旋转离心管数次，弃去乙醇；将离心管倒立于垫有滤纸的实验台上，室温干燥沉淀6h以上；加入100μL超纯水或TE缓冲液，充分溶解后备用。
备注：以上为推荐的DNA提取方法，其它达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法均适用。
2.2.2DNA样品的质量和数量
在紫外分光光度仪或DNA检测仪上检测DNA样品260nm和280nm的OD值(光吸收值)，选择OD260/OD280之比为1.8±0.1的样品用于检测。
2.2.3DNA样品的工作浓度
从每个DNA样品中取部分DNA溶液稀释至20ng/μL左右作为工作液，存于4℃冰箱备用。
2.3PCR扩增
2.3.1引物选择
首先选择表1中前14对引物(I型)进行检测，当样品间检测出的差异位点数小于2时，再选用表1中后14对引物(II型)进行检测。
表1 核心引物名单及序列
2.3.2反应体系
PCR反应体系为10μL体系。其中包括10×buffer(含Mg2+)1.0μL，2.5mmol/L dNTP1.0μL，10μmol/L正向、反向引物各0.125μL，5U/μL Taq酶0.25μL，20ng/μL DNA1.0μL，ddH2O 6.5μL再加15μL的石蜡油(有热盖设备的PCR仪可以不加石蜡油)，防止反应过程中水分蒸发。
2.3.3反应程序
94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，共37个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
2.4PCR产物检测
本标准PCR扩增产物的检测采用普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，有条件也可采用荧光标记毛细管电泳检测。
2.4.1清洗玻璃板
用清水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95％乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上涂上2mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂2mL剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。
2.4.2组装电泳板
待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，用夹子固定，并用水平仪调平。
2.4.3制胶
在55mL 6.0％PAGE胶中分别加入TEMED 70L，10％过硫酸铵140L，迅速混匀后灌胶。待胶流动充满后，在上部轻轻的反向插入梳子，使其聚合至少1h以上。灌胶时应匀速以防止出现气泡或胶液聚合。
2.4.4预电泳
在正极槽(下槽)中加入5×TBE缓冲液700mL，在负极槽(上槽)加入10×TBE缓冲液600mL～700mL(电极丝没入缓冲液中)，拔出梳子。80W恒功率预电泳10min～20min。
2.4.5变性
在10L PCR产物中加入3L 6×溴酚蓝-二甲苯青电泳指示剂，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5min，4℃冷却10min以上。
2.4.6电泳
用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，插入样品梳子。每一个加样孔点入3L～5L样品。80W恒功率电泳至上部的指示带(二甲苯青)到达胶板的中部。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶会紧贴在长板上。
备注：预期扩增产物片段大小在150bp以下时电泳时间应适当缩短，扩增产物片段大小在300bp以上时电泳时间应适当延长。
2.4.7银染显色
主要步骤：
固定：将凝胶放入冰醋酸固定液中轻轻晃动3min，倒去固定液；
漂洗：蒸馏水快速漂洗，不超过10s；
染色：将凝胶浸入硝酸银染色液中染色20min，倒去液体；
漂洗：蒸馏水快速漂洗，不超过10s；
显影：将凝胶浸入氢氧化钠和甲醛显影液中轻轻晃动至带纹出现；
定影：凝胶在冰醋酸固定液中定影5min；
漂洗：蒸馏水漂洗1min。
(三)、DNA指纹图谱的建立
选取均匀分布于水稻12条染色体上的SSR引物，筛选多态性高、条带清晰28对核心引物建立DNA指纹图谱。
1、SSR聚类分析
每对SSR引物检测到1个位点，视每条多态性带为1个等位基因；将观测到的每条带视为一个性状，有此带时赋值为“1″，无此带时赋值为“0″，缺失时赋值为“3″，建立DNA指纹数据库。
每两份材料间的遗传距离差异按Nei的方法求遗传距离D，即D＝i-[2Mxy/(Mx+My)]。式中Mx和My分别为X和Y两材料的片段数，Mxy为两材料的总片段数。应用非加权平均数(UPGMA)进行聚类分析。
2、根据Smith等报道的方法计算PIC(polymorphism information content)值。平均等位基因数(Ap)：Ap＝∑Api/np，式中为第i个多态位点上的等位基因数，np为所检测的多态位点的总数。平均基因多样性(Hs)：Hs＝1-1/n∑q2ij，式中qij为第i个多态位点上第J个等位基因的频率，n为检测的位点数。
3、依据SSR分析结果，构建宁夏水稻特征指纹图谱。
利用trans 2.0把DNA“0”、“1”数据库转换为字母表示，如表2所示。利用本发明中的28对核心引物，参试的47份品种(系)中各材料间均有差异；其中只有1对引物差异的是宁粳23号和宁粳28号在RM1370处有差异，宁粳23号和宁粳35号在RM72处有差异，判别为相似品种，其余品种间均有2对或2对以上引物差异，品种间能够被区分。
表2 28对SSR引物建立的47份品种(系)的指纹数据库
本发明确定的前14对引物可以区分参试47份材料中的40份，占85.1％。利用trans 2.0把DNA“0”、“1”数据库转换为字母表示，如表3所示，宁粳23和宁粳35在14对引物中表现无差异；只有1对引物有差异的为宁粳18和宁粳19在RM667处有差异，宁粳28与宁粳23、宁粳35在RM1370处有差异，2007G318与宁粳23、宁粳35在RM208处有差异，宁粳45和宁粳28在RM333处有差异。其它各材料间均在两对或两对以上引物处有差异，判别为不同品种。
表3 47份品种(系)在前14对SSR引物中的数据库
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.用于鉴别宁夏水稻品种的引物组合物，其特征在于，主要由RM1195、RM3482、RM208、RM8208、RM5473、RM430、RM1370、RM336、RM6670、RM223、RM219、RM333、RM536和RM1337引物对组成；
所述RM1195引物对由序列1和序列2所示DNA组成的引物对；
所述RM3482引物对由序列3和序列4所示DNA组成的引物对；
所述RM208引物对由序列5和序列6所示DNA组成的引物对；
所述RM8208引物对由序列7和序列8所示DNA组成的引物对；
所述RM5473引物对由序列9和序列10所示DNA组成的引物对；
所述RM430引物对由序列11和序列12所示DNA组成的引物对；
所述RM1370引物对由序列13和序列14所示DNA组成的引物对；
所述RM336引物对由序列15和序列16所示DNA组成的引物对；
所述RM6670引物对由序列17和序列18所示DNA组成的引物对；
所述RM223引物对由序列19和序列20所示DNA组成的引物对；
所述RM219引物对由序列21和序列22所示DNA组成的引物对；
所述RM333引物对由序列23和序列24所示DNA组成的引物对；
所述RM536引物对由序列25和序列26所示DNA组成的引物对；
所述RM1337引物对由序列27和序列28所示DNA组成的引物对。
2.根据权利要求1所述的用于鉴别宁夏水稻品种的引物组合物，其特征在于，其还包括RM297、RM525、RM251、RM8277、RM5414、RM249、RM253、RM528、RM481、RM72、RM160、RM7217、RM224和RM247引物对；
所述RM297引物对由序列29和序列30所示DNA组成的引物对；
所述RM525引物对由序列31和序列32所示DNA组成的引物对；
所述RM251引物对由序列33和序列34所示DNA组成的引物对；
所述RM8277引物对由序列35和序列36所示DNA组成的引物对；
所述RM5414引物对由序列37和序列38所示DNA组成的引物对；
所述RM249引物对由序列39和序列40所示DNA组成的引物对；
所述RM253引物对由序列41和序列42所示DNA组成的引物对；
所述RM528引物对由序列43和序列44所示DNA组成的引物对；
所述RM481引物对由序列45和序列46所示DNA组成的引物对；
所述RM72引物对由序列47和序列48所示DNA组成的引物对；
所述RM160引物对由序列49和序列50所示DNA组成的引物对；
所述RM7217引物对由序列51和序列52所示DNA组成的引物对；
所述RM224引物对由序列53和序列54所示DNA组成的引物对；
所述RM247引物对由序列55和序列56所示DNA组成的引物对。
3.权利要求1或2所述的引物组合物在鉴别宁夏水稻品种中的应用。
4.权利要求1所述的引物组合物在制备鉴别宁夏水稻品种试剂盒中的应用。
5.一种鉴别鉴别宁夏水稻品种的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的引物组合物。
6.一种应用权利要求1所述引物组合物鉴别宁夏水稻品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测水稻的DNA基因组为模板，分别用所述RM1195、所述RM3482、所述RM208、所述RM8208、所述RM5473、所述RM430、所述RM1370、所述RM336、所述RM6670、所述RM223、所述RM219、所述RM333、所述RM536和所述RM1337引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；将所述PCR扩增产物进行电泳、染色及鉴定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤：当样品间检测出的差异位点数小于2时，以待测水稻品种DNA基因组为模板，分别用所述RM297、所述RM525、所述RM251、所述RM8277、所述RM5414、所述RM249、所述RM253、所述RM528、所述RM481、所述RM72、所述RM160、所述RM7217、所述RM224、所述RM247引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；将所述PCR扩增产物进行电泳、染色及鉴定。
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