CN105400777A - 栽培花生ssr分子标记引物组及其在品种鉴定中的应用 - Google Patents
栽培花生ssr分子标记引物组及其在品种鉴定中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105400777A CN105400777A CN201510600068.8A CN201510600068A CN105400777A CN 105400777 A CN105400777 A CN 105400777A CN 201510600068 A CN201510600068 A CN 201510600068A CN 105400777 A CN105400777 A CN 105400777A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- molecular marker
- peanut
- ssr
- ssr molecular
- cultivation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 title claims abstract description 49
- 241001553178 Arachis glabrata Species 0.000 title claims abstract description 49
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 title claims abstract description 49
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 title claims abstract description 49
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 title claims abstract description 49
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 7
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 7
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 6
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 238000012797 qualification Methods 0.000 claims description 4
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 claims 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims 1
- 239000005357 flat glass Substances 0.000 description 20
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 6
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000316770 Deschampsia cespitosa var. alpina Species 0.000 description 1
- GVGLGOZIDCSQPN-PVHGPHFFSA-N Heroin Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)OC(C)=O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4OC(C)=O GVGLGOZIDCSQPN-PVHGPHFFSA-N 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000005652 acute fatty liver of pregnancy Diseases 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011229 interlayer Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于分子生物学分子标记领域，特别涉及一种栽培花生SSR分子标记引物组及其在品种鉴定中的应用。本发明是基于SSR分子标记鉴定法建立的，利用均匀分布在栽培花生染色体组、多态性好、PCR扩增稳定的20对SSR引物组成的一套引物对不同栽培花生品种进行鉴定的技术体系。该技术体系能够快速、准确的对不同栽培花生品种进行鉴定。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学分子标记领域，特别涉及一种栽培花生SSR分子标记引物组及其在品种鉴定中的应用。
背景技术
花生(ArachishypogaeaL.)又名落花生，栽培花生是包含来自于不同野生种A和B两个基因组的异源四倍体作物，是我国重要的经济作物和油料作物之一。
近年来，我国花生新品种数量急剧增加，每年参加国家、各省市区试的品种数百个，每年审(认)定的品种达到二十个以上。同时高频率的使用少数骨干亲本使品种的遗传基础趋于狭窄，从而加大了利用外观表型性状区别不同花生品种的难度。随着分子生物学技术的不断发展，DNA分子标记技术为栽培花生品种鉴定提供了新的途径。AFLP、RFLP、RAPD、SSR、SCoT等分子标记均被应用于花生品种鉴定，而SSR分子标记较其他标记具有共显性、多态性高、扩增稳定、快速经济等特点，可高效准确的应用于栽培花生品种鉴定。
目前常用的栽培花生品种鉴定方法主要有：1、表型性状鉴定法：该方法通过不同品种间表型性状差异对不同品种进行鉴定，虽然比较直观、快捷，但对表型性状相近的品种则无法鉴定；2、DNA分子标记法：该方法利用各类DNA分子标记在基因水平上对不同品种进行鉴定，其中SSR分子标记因其具有共显性、多态性高、扩增稳定、快速经济等特点而应用最为普遍，但目前已公布的花生SSR分子标记数达到了15518，但只有13.5％-14.5％的分子标记在栽培花生中具有多态性，盲目的使用SSR分子标记对栽培花生品种进行鉴定不仅费时费力，也难以得到准确的鉴定结果。
本发明是基于SSR分子标记鉴定法建立的，利用均匀分布在栽培花生染色体组、多态性好、PCR扩增稳定的20对SSR引物组成的一套引物对不同栽培花生品种进行鉴定的技术体系。该技术体系能够快速、准确的对不同栽培花生品种进行鉴定。
发明内容
利用SSR分子标记法直接对花生遗传物质DNA进行分析，相对于表型性状更加准确。但之前报道的一些SSR分子标记鉴定方法由于使用的引物在花生染色体组上分布不均匀以及数量较少，难以区分一些遗传背景比较相近的花生品种。本发明利用筛选到的均匀分布在花生染色体组上的20对SSR分子标记引物组对不同栽培花生品种进行鉴定，能够对鉴定品种进行准确区分。
本发明的目的在于提供一套栽培花生SSR分子标记引物组，以及在于利用上述SSR分子标记引物组鉴别栽培花生品种的方法。
为实现上述目的，具体方案如下：
本发明的栽培花生SSR分子标记引物组，所述引物组包括核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1-40所示引物。
利用上述SSR分子标记引物组鉴定栽培花生品种的方法，包括如下步骤：
(1)提取待鉴定栽培花生样品基因组DNA；
(2)采用如序列表SEQIDNo.1-40所示引物进行SSR-PCR扩增；
(3)将步骤(2)的扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染检测；
(4)根据特异性图谱进行栽培花生品种的鉴定。
所述步骤(2)中的SSR-PCR扩增体系为10μL，其中DNA模板10ng，正、反向引物各0.4μmol/L，dNTPs0.25mmol/L，1×PCR缓冲液(包含MgCl21.5mmol/L)，Taq酶0.1单位。
所述步骤(2)中的SSR-PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
所述步骤(4)的鉴定方法为:如果两品种间差异位点数≥2则判定两品种为不同品种。
本方法利用一套由20对均匀分布在花生基因组不同连锁群上的SSR分子标记引物对鉴定品种的遗传信息进行分析，与现在广泛使用的表型鉴定方法和之前报道的分子鉴定方法相比更加准确。而且本方法仅采用普通引物进行扩增并用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，相比基于荧光标记引物的毛细管电泳检测方法，本方法更加经济。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例子仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
1.鉴定材料DNA提取
参照Charters的CTAB法，具体操作步骤如下：
1)选取待检测花生幼嫩、无病虫害叶片4-6片，用蒸馏水清洗干净，纱布吸干，放置-80℃冷冻保存。
2)将冷冻的叶片放入预冷的研钵中，加入适量液氮，在保持叶片冷冻的条件下快速将叶片研磨成粉末，将粉末转入2ml离心管中。
3)迅速向上述转入叶片粉末的离心管中加入65℃预热的CTAB提取液700μL，65℃水浴1h，每15min摇匀一次。
4)加入酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)700μL，上下颠倒混匀，4℃条件下12000转离心10min，吸取上清液转入1.5ml离心管中。
5)加入预冷的异丙醇500μL，混匀后4℃静置30min，4℃条件下12000转离心10min，去掉上清液。
6)加入预冷的70％乙醇洗涤两遍，短暂离心后去除上清液，室温干燥至没有乙醇气味；
7)加入200μL灭菌去离子水或TE溶液，用1％琼脂糖电泳检测DNA分子量大小，利用超微量紫外分光光度计测定DNA浓度，并稀释到10ng/μL，4℃保存待用。
2.鉴定材料DNA的SSR-PCR扩增
利用本方法给出的20对引物对待鉴定材料DNA进行PCR扩增，反应体系及程序如下：
1)反应体系：10μL体系包括鉴定材料DNA模板10ng，正、反向引物各0.4μmol/L，dNTP0.25mmol/L，1×PCR缓冲液(包含MgCl21.5mmol/L)，Taq酶0.1单位。
2)反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
3.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测
以使用JY-CX2A型测序电泳槽为例，操作步骤如下：
1)清洗玻璃板：用自来水将玻璃板清洗干净后用去离子水冲洗后晾干，再用无水乙醇擦洗两遍后吸水纸擦干。在长玻璃板上涂上0.5mL亲和硅烷工作液，带凹槽短玻璃板上涂上0.5mL剥离硅烷工作液，室温静置20min晾干并防止两块玻璃板相互污染。
2)组装玻璃板：待玻璃板完全干燥后在长玻璃板涂抹亲和硅烷两侧各放置一条0.4mm厚垫片，将短玻璃板涂抹剥离硅烷一面与长玻璃板相对扣在长剥离板上，两玻璃板以垫片隔开。
3)制胶：在50mL6.0％的丙烯酰胺胶溶液中加入新配制的10％过硫酸铵溶液500μL，TEMED50μL，迅速混匀后灌胶。待胶液充满玻璃板夹层，将0.4mm厚鲨鱼齿梳子平齐端向内轻轻插入胶液0.3-0.4cm，灌胶过程中应防止出现气泡。胶板静置1h使胶液完全聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子。
4)预电泳：将胶板安装在电泳槽上，向上槽中加入预热至60℃的0.5×TBE缓冲液，使其超过凝胶顶部约2cm，向下槽加入0.5×TBE缓冲液，使其超过胶板地步约2cm，在70W恒功率下，预电泳20min。
5)样品制备
在10μLPCR样品中加入3μL上样缓冲液，混匀后在PCR仪上95℃变性5min。变性结束后迅速冰浴冷却。
6)电泳：用注射器吸取缓冲液冲洗凝胶顶端几次，将悬浮于凝胶顶端的气泡和胶碎片清除。将鲨鱼齿梳子梳齿插入凝胶1-2mm，每一个加样孔加入1.5μL样品。在70W恒功率下进行电泳，使凝胶温度保持在50℃左右。电泳1.5-2.5h，电泳时间取决于扩增片段的大小范围。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，取下凝胶附着的长玻璃板准备银染。
7)银染：①将附着凝胶的长玻璃板置于塑料盒中，加入适量银染固定液，含冰醋酸0.5％、无水乙醇1％，使固定液完全没过凝胶，在摇床上轻轻晃动20min。②去除玻璃板，在去离子水中漂洗2次，每次1min。③将玻璃板置于染色液，含AgNO30.1％中，使染色液完全没过凝胶，在摇床上轻轻晃动30min。④将玻璃板取出，在去离子水中快速漂洗10s。⑤将玻璃板置于显影液，含NaOH1.5％、甲醛0.4％中，使显影液完全没过凝胶，在摇床上轻轻晃动至出现清晰带纹。⑥将玻璃板取出，在清水中漂洗2次，每次30s。
8)将各鉴定品种同一位点扩增片段的带型和迁移位置进行比较，扩增带型以0、1表示，在相同迁移位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，构建“1”、“0”矩阵。
9)对每对引物的鉴定结果进行统计分析，不同鉴定品种间差异位点数≥2则判定两品种为不同品种。
采用本方法对12个山东省主要栽培花生品种(表1)进行鉴定，根据各品种特异性图谱构建“1”、“0”矩阵(表2)。
表1鉴定栽培花生品种
| 编号 | 品种名称 | 编号 | 品种名称 | 编号 | 品种名称 |
| 1 | 花育56 | 5 | 山花7号 | 9 | 山花8号 |
| 2 | 花育45 | 6 | 山花9号 | 10 | 山花10号 |
| 3 | 花育61 | 7 | 山花12号 | 11 | 丰花1号 |
| 4 | 花育33 | 8 | 山花15号 | 12 | 海花3号 |
表220个SSR构建的12个栽培花生品种“1”、“0”矩阵
由上表可知各鉴定品种间差异位点数均≥2，因此可以确定以上栽培花生品种均为不同品种。
表320对SSR
其中，AHGS1294的正向引物对应序列表中的1号序列，反向引物对应序列表中的2号序列；Ai124P23的正向引物对应序列表中的3号序列，反向引物对应序列表中的4号序列；Seq12E10的正向引物对应序列表中的5号序列，反向引物对应序列表中的6号序列；GNB827的正向引物对应序列表中的7号序列，反向引物对应序列表中的8号序列；IPAHM659的正向引物对应序列表中的9号序列，反向引物对应序列表中的10号序列；AHGS1836的正向引物对应序列表中的11号序列，反向引物对应序列表中的12号序列；Seq2G03的正向引物对应序列表中的13号序列，反向引物对应序列表中的14号序列；Ad91I24的正向引物对应序列表中的15号序列，反向引物对应序列表中的16号序列；TC23D04的正向引物对应序列表中的17号序列，反向引物对应序列表中的18号序列；AHGS3721的正向引物对应序列表中的19号序列，反向引物对应序列表中的20号序列；AHGS1750的正向引物对应序列表中的21号序列，反向引物对应序列表中的22号序列；AHGS1661的正向引物对应序列表中的23号序列，反向引物对应序列表中的24号序列；Seq18C05的正向引物对应序列表中的25号序列，反向引物对应序列表中的26号序列；IPAHM455的正向引物对应序列表中的27号序列，反向引物对应序列表中的28号序列；Seq19B12的正向引物对应序列表中的29号序列，反向引物对应序列表中的30号序列；TC25G11的正向引物对应序列表中的31号序列，反向引物对应序列表中的32号序列；TC23H10的正向引物对应序列表中的33号序列，反向引物对应序列表中的34号序列；AHGS1446的正向引物对应序列表中的35号序列，反向引物对应序列表中的36号序列；GNB464的正向引物对应序列表中的37号序列，反向引物对应序列表中的38号序列；Ad92L05的正向引物对应序列表中的39号序列，反向引物对应序列表中的40号序列。
以上已将本发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能限定本发明实施范围，即凡依本申请范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。
Claims (6)
1.栽培花生SSR分子标记引物组，其特征在于：所述引物组包括核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1-40所示引物。
2.利用如权利要求1所述的SSR分子标记引物组鉴定栽培花生品种的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取待鉴定栽培花生样品基因组DNA；
(2)采用如序列表SEQIDNo.1-40所示引物进行SSR-PCR扩增；
(3)将步骤(2)的扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染检测；
(4)根据特异性图谱进行栽培花生品种的鉴定，所述特异性图谱为将各鉴定品种同一位点扩增片段的带型和迁移位置进行比较，扩增带型以0、1表示，在相同迁移位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，构建的“1”、“0”矩阵图。
3.如权利要求2所述的利用如权利要求1所述的SSR分子标记引物组鉴定栽培花生品种的方法，其特征在于：所述步骤(1)由以下步骤组成：
1)选取待检测花生幼嫩、无病虫害叶片4-6片，用蒸馏水清洗干净，纱布吸干，放置-80℃冷冻保存；
2)将冷冻的叶片放入预冷的研钵中，加入适量液氮，在保持叶片冷冻的条件下快速将叶片研磨成粉末，将粉末转入2ml离心管中；
3)迅速向上述转入叶片粉末的离心管中加入65℃预热的CTAB提取液700μL，65℃水浴1h，每15min摇匀一次；
4)加入酚：氯仿：异戊醇比例为25：24：1的混合液700μL，上下颠倒混匀，4℃条件下12000转离心10min，吸取上清液转入1.5ml离心管中；
5)加入预冷的异丙醇500μL，混匀后4℃静置30min，4℃条件下12000转离心10min，去掉上清液；
6)加入预冷的70％乙醇洗涤两遍，短暂离心后去除上清液，室温干燥至没有乙醇气味；
7)加入200μL灭菌去离子水或TE溶液，用1％琼脂糖电泳检测DNA分子量大小，利用超微量紫外分光光度计测定DNA浓度，并稀释到10ng/μL，4℃保存待用。
4.如权利要求2所述的利用如权利要求1所述的SSR分子标记引物组鉴定栽培花生品种的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的SSR-PCR扩增体系为10μL，其中DNA模板10ng，正、反向引物各0.4μmol/L，dNTPs0.25mmol/L，1×PCR缓冲液，包含MgCl21.5mmol/L，Taq酶0.1单位。
5.如权利要求2所述的利用如权利要求1所述的SSR分子标记引物组鉴定栽培花生品种的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的SSR-PCR扩增程序为：94-95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
6.如权利要求2所述的利用如权利要求1所述的SSR分子标记引物组鉴定栽培花生品种的方法，其特征在于：所述步骤(4)的鉴定方法为:如果两品种间差异位点数≥2则判定两品种为不同品种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510600068.8A CN105400777B (zh) | 2015-09-18 | 2015-09-18 | 栽培花生ssr分子标记引物组及其在品种鉴定中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510600068.8A CN105400777B (zh) | 2015-09-18 | 2015-09-18 | 栽培花生ssr分子标记引物组及其在品种鉴定中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105400777A true CN105400777A (zh) | 2016-03-16 |
| CN105400777B CN105400777B (zh) | 2018-06-29 |
Family
ID=55466538
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510600068.8A Expired - Fee Related CN105400777B (zh) | 2015-09-18 | 2015-09-18 | 栽培花生ssr分子标记引物组及其在品种鉴定中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105400777B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107079808A (zh) * | 2017-05-25 | 2017-08-22 | 广东省农业科学院作物研究所 | 一种半蔓型高产花生品种的选育方法 |
| CN107937596A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-04-20 | 石家庄博瑞迪生物技术有限公司 | 基于单核苷酸多态性的花生真假杂种鉴定引物组及其鉴定方法 |
| CN108977570A (zh) * | 2018-08-28 | 2018-12-11 | 北京市农林科学院 | 鉴定28个胡萝卜优良品种的方法及其专用引物组 |
| CN110894540A (zh) * | 2019-12-10 | 2020-03-20 | 广东省农业科学院作物研究所 | 用于花生品种鉴定的snp芯片、制备方法及其应用 |
| CN113151549A (zh) * | 2021-04-16 | 2021-07-23 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 与花生黄曲霉抗性主效位点qAFTA07紧密连锁的分子标记及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104099414A (zh) * | 2014-06-18 | 2014-10-15 | 北京市农林科学院林业果树研究所 | 利用ssr分子标记鉴定杏品种的方法 |
| CN104894110A (zh) * | 2015-05-14 | 2015-09-09 | 浙江大学 | 构建芥菜ssr遗传图谱的引物组及遗传图谱的构建方法 |
-
2015
- 2015-09-18 CN CN201510600068.8A patent/CN105400777B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104099414A (zh) * | 2014-06-18 | 2014-10-15 | 北京市农林科学院林业果树研究所 | 利用ssr分子标记鉴定杏品种的方法 |
| CN104894110A (zh) * | 2015-05-14 | 2015-09-09 | 浙江大学 | 构建芥菜ssr遗传图谱的引物组及遗传图谱的构建方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 杜金友等: "SSR和AFLP分析玉米遗传多样性的研究", 《华北农学报》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107079808A (zh) * | 2017-05-25 | 2017-08-22 | 广东省农业科学院作物研究所 | 一种半蔓型高产花生品种的选育方法 |
| CN107079808B (zh) * | 2017-05-25 | 2019-04-09 | 广东省农业科学院作物研究所 | 一种半蔓型高产花生品种的选育方法 |
| CN107937596A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-04-20 | 石家庄博瑞迪生物技术有限公司 | 基于单核苷酸多态性的花生真假杂种鉴定引物组及其鉴定方法 |
| CN108977570A (zh) * | 2018-08-28 | 2018-12-11 | 北京市农林科学院 | 鉴定28个胡萝卜优良品种的方法及其专用引物组 |
| CN110894540A (zh) * | 2019-12-10 | 2020-03-20 | 广东省农业科学院作物研究所 | 用于花生品种鉴定的snp芯片、制备方法及其应用 |
| CN110894540B (zh) * | 2019-12-10 | 2022-05-31 | 广东省农业科学院作物研究所 | 用于花生品种鉴定的snp芯片、制备方法及其应用 |
| CN113151549A (zh) * | 2021-04-16 | 2021-07-23 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 与花生黄曲霉抗性主效位点qAFTA07紧密连锁的分子标记及其应用 |
| CN113151549B (zh) * | 2021-04-16 | 2022-03-29 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 与花生黄曲霉抗性主效位点qAFTA07紧密连锁的分子标记及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105400777B (zh) | 2018-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105400777A (zh) | 栽培花生ssr分子标记引物组及其在品种鉴定中的应用 | |
| Vargas et al. | Molecular fingerprinting evidence (ISSR, inter-simple sequence repeats) for a wild status of Olea europaea L.(Oleaceae) in the Eurosiberian North of the Iberian Peninsula | |
| CN101921866A (zh) | 一种利用ssr核心引物鉴定棉花品种的方法 | |
| CN106755328A (zh) | 一种蚕豆ssr指纹图谱的构建方法 | |
| CN105296648A (zh) | 狐源性成分鉴定及动物制品中狐、兔、狗成分的多重pcr检测试剂盒 | |
| CN103194539B (zh) | 一种利用ssr分子标记鉴定苎麻品种的方法 | |
| CN106701960A (zh) | 紫花苜蓿ilp分子标记引物及在苜蓿品种鉴定中的应用 | |
| CN102586478B (zh) | 检测芜菁花叶病毒的一步多重rt-pcr法及其专用引物 | |
| CN103937873B (zh) | 棉花品种‘中棉所49号’的dna指纹检测方法 | |
| CN107058518A (zh) | 与芝麻抗茎点枯病主效基因位点紧密连锁的ssr分子标记及应用 | |
| CN105112557A (zh) | 快速鉴定兰属植物的方法 | |
| CN105274189B (zh) | 棉花杂交种亲子鉴定方法 | |
| CN104073561B (zh) | 一套适于不结球白菜核酸指纹库构建的ssr引物组合及其应用 | |
| CN105112523A (zh) | 基于大白菜全基因组序列开发的ssr核心引物组及应用 | |
| CN103290102B (zh) | 一种基于pcr的snp分型方法及应用 | |
| CN111961752B (zh) | 一种鉴定中国樱桃种质的ssr标记、应用及鉴定方法 | |
| CN104611442B (zh) | 用于鉴别宁夏水稻品种的引物组合物及其应用 | |
| CN108977563A (zh) | 基于萝卜全基因组序列开发的ssr核心引物组及其应用 | |
| CN106755389A (zh) | 用于鉴定瘿椒树性别的基因序列及其应用 | |
| CN110468231B (zh) | 一组与茶树(+)-儿茶素含量连锁的分子标记及其应用 | |
| CN105132536B (zh) | 一套金银花种质鉴定引物及其应用 | |
| KR102584621B1 (ko) | 밀복속 어종 판별용 유전자 마커 및 그를 이용한 판별방법 | |
| CN101225439A (zh) | 保守序列扩增多态性分子标记及其分析方法 | |
| CN107805674A (zh) | 一种利用ssr分子标记快速鉴定灌木辣椒种质的方法 | |
| CN111518919B (zh) | 一种利用线粒体分子标记鉴定茶蚜的方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20180629 |