CN103760137B - 细胞dna损伤检测方法 - Google Patents
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Abstract
细胞DNA损伤检测方法，涉及细胞损伤检测。将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热，取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中，使胶平展铺开冷却固化，再将板盖浸入细胞裂解液中裂解；用碱性解旋液冲洗裂解后的胶板，然后将胶板浸入装有预冷碱性解旋液的容器中；将碱解旋后的胶板置于装有预冷电泳液的电泳槽中电泳；将电泳后的胶板在Milli‑Q水中浸泡；将胶板用预冷无水乙醇静置浸泡后，取出胶板，将胶板冷藏保存；在脱水干燥后的胶板上每孔滴加一滴Milli‑Q水，静置，润湿胶板后每孔滴加10～15μL的溴化乙啶，避光染色，用滤纸吸干胶板表面残余的染液，即可在515nm激发波长下进行图像采集。
Description
技术领域
本发明涉及细胞损伤检测，特别是涉及一种细胞DNA损伤检测方法。
背景技术
在癌症病人中，DNA遗传信息的稳定性受到不同程度的破坏，这表明癌症的发生与DNA损伤具有十分密切的关系。目前环境中存在着多种多样有害物理、化学因子（如紫外辐射、农药残留以及其他有机污染物等）能直接或者间接引起细胞DNA损伤，而且每年还有大量的新增因子进入环境中，那么快速有效地对现有以及新进入环境因子进行致DNA损伤毒性检测，有利于及时采取措施对有害因子进行控制和治理，减少相关癌症以及遗传性疾病的发生，对于环境监测和保护具有重要意义。
单细胞凝胶电泳技术(Single cell gel electrophoresis，SCGE)作为检测细胞DNA损伤的方法之一，由Ostling等人首次提出，经Singh等人进一步改善后建立了碱性单细胞凝胶电泳技术。其制胶板过程：将正常熔点琼脂糖(NMA)滴到载玻片的磨砂面，迅速盖上干净的盖玻片，冷凝；将含样品细胞的低熔点琼脂糖(LMA)滴到第一层胶板上，使其凝固；最后在再滴加LMA。第一层的主要目的是使第二层平整和附着紧密，第三层胶的目的是对第二层细胞起保护作用。随后进行裂解、解旋、电泳、染色、结果观察。其制胶板过程工艺复杂，每次样品检测数量有限，而且在后期操作中容易脱胶，导致实验失败。
近几年，研究者对常规单细胞凝胶技术不断进行改进。
Peggy等人（Peggy L O,Judit P B.The commet assay:a method to measureDNA damage in individual cells.Nature Protocols.2006,1:23-29）将载玻片用1%正常熔点琼脂糖凝胶浸泡，取出擦净一面后烘干得一面附有底膜的玻片，保存备用。随后可将与待测细胞样品混匀的琼脂糖凝胶铺于预先镀膜的胶板上。
McNamee等人（McNamee J P,McLean J R,Ferrarotto C L,Bellier P V.Cometassay:rapid processing of multiple samples.Mutation Research.2000,466:63-69）在常规SCGE的基础上提出了Gelbond法，使用一种能够粘附低熔点琼脂糖凝胶的膜代替常规SCGE中的底膜，其它步骤不变，该方法相对常规SCGE能够有效减少掉胶率，但是具有粘附低熔点琼脂糖凝胶功能的Gelbond膜价格昂贵，而且不能重复利用，大量使用时成本较高。
David等人（David K W,David M W,Sangeeta N B.Single cell trapping andDNA damage analysis using microwell arrays.PNAS.2010,107:10008-10013）在使用Gelbond膜的基础上，引入微室阵列法。该方法为先采用SU-8型感光树脂、平板印刷版、硅晶圆等材料经过UV射线照射，丙二醇甲醚醋酸酯显影等步骤制得微室模具，再在铺有溶解的正常熔点的琼脂糖凝胶的Gelbond膜上用模具制微室，待胶凝固后，移去模具，制得微室，微室制好后，即可在微室中加入待测细胞样品，并铺上一层低熔点琼脂糖凝胶，凝固后按常规SCGE进行后面的步骤。微室阵列法较常规SCGE改进了胶板的制备过程，并且微室中的每一个细胞位置明确，采用全自动分析，确保分析到每一个细胞，但是微室阵列法中微室模具制作过程精密复杂，模具需随着细胞大小的变化而变化，改变受试细胞时，需重新优化模具，过程复杂，全自动阅片需要有专门的配套设备，硬件和技术要求高，影响其推广和应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述问题，提供一种快速、灵敏度高、工艺简单的细胞DNA损伤检测方法。
本发明包括以下步骤：
1）凝胶板的制备：将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热，取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中，使胶平展铺开，冷却固化；
2）细胞裂解：将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入细胞裂解液中裂解；
3）DNA碱解旋：用碱性解旋液冲洗裂解后的胶板，然后将胶板浸入装有预冷碱性解旋液的容器中，静置；
4）电泳：将碱解旋后的胶板先用电泳液冲洗，然后置于装有预冷电泳液（TAE）的电泳槽中进行电泳；
5）中和：将电泳后的胶板在Milli-Q水中浸泡；
6）脱水与晾干：用滤纸吸去中和后胶板表面的残留水，将胶板用预冷无水乙醇静置浸泡后，取出胶板，重复脱水一次，将自然晾干之后的胶板冷藏保存；
7）染色以及图像采集：在脱水干燥后的胶板上每孔用胶头滴管滴加一滴Milli-Q水，静置，润湿胶板后每孔滴加10～15μL的溴化乙啶，避光染色，用滤纸吸干胶板表面残余的染液，即可在515nm激发波长下进行图像采集。
在步骤1）中，所述将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热的方法可为：将24孔细胞培养板板盖绞掉一组对应的横或者竖的外围，另一组保留，再将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶（LMA）预热；所述预热的温度可为37℃；所述取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中可取50～80μL混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中；所述使胶平展铺开可采用枪头辅助推胶使胶平展铺开；所述冷却的条件可为4℃下冷却3～5min；所述LMA的质量分数为0.4%～0.6%，所述待测样品细胞密度为8～10×105个/mL，细胞悬液与LMA的体积比为1∶3～5。
在步骤2）中，所述将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入细胞裂解液中裂解可将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入4℃的细胞裂解液中避光裂解1.5～2h；
所述细胞裂解液的组成可为100mmol/L Na2EDTA、2.5mol/L NaCl、10mmol/LTris-HCl缓冲液，pH=10；临用前加Triton X-100至体积分数1%，同时加DMSO至体积分数10%。
在步骤3）中，所述静置可在4℃避光静置15～25min；所述解旋液的组成可为1mmol/L Na2EDTA，300mmol/L NaOH，pH>13。
在步骤4）中，所述电泳液为TAE，50×TAE配制方法为242g Tris-base、37.2gNa2EDTA·2H2O，加入57.1mL的冰乙酸充分溶解，用NaOH溶液调节pH值为8.3，Milli-Q水定容至1L，室温保存，使用前将其稀释50倍并置于4℃冷藏2h以上；所述电泳的条件可为：电泳的电压为15～25V（恒压），电泳的时间为10～30min。
在步骤5）中，所述浸泡可浸泡5～10min，重复2～3次。
在步骤6）中，所述静置浸泡的时间可为10～15min。
在步骤7）中，所述静置的时间可为2～3min；所述溴化乙啶的浓度可为1μg/mL，所述避光染色的时间可为10～15min。
本发明提供了一种细胞DNA损伤的快速检测方法。包括凝胶板制备、细胞裂解、DNA碱解旋、电泳、中和、脱水与晾干、染色及图像采集步骤。以24孔细胞培养板板盖代替传统的载玻片为胶承载体，将样品细胞悬液与低熔点琼脂糖凝胶混匀，用移液枪将定量的混合液置于胶承载体样品孔中，枪头轻轻带动，使其平坦地铺满整个样品孔，待胶板冷却后即可进行后续步骤；与传统载玻片点样工艺相比，本发明仅铺单层胶，简化了胶板制备工艺，并且24孔细胞培养板板盖样品孔大小合适，不仅保证了单个样品足够的胶面积，而且胶层薄，不易出现细胞重叠现象，有利于保证电泳条件的一致和图像的采集。常规方法中要求“制板后必须尽快观察，以免失真”。为解决上述问题，本方法增加了点样板的脱水和自然晾干过程，不仅使胶板能够长期保存，随看随染色，提高了实验的灵活性，而且脱水晾干后，胶层像膜一样镀在胶承载体上，核DNA在同一个平面上，图像观察时无需反复调焦，效率大为提高。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和效果：
（1）本发明以24孔细胞培养板盖孔作为胶承载体，采用移液枪头辅助推胶方法，形成极其薄的单层胶，克服了常规点样工艺中由于胶量多，胶易冷却而导致胶流动性差无法铺开的问题，而且本发明采用单层胶，简化了传统工艺的2～3层制胶法。
（2）本发明在传统单细胞凝胶电泳过程中加入了乙醇脱水步骤，经过脱水晾干之后的胶板可以长期保存，在需要观察结果时再染色，与传统工艺相比，大大提高了实验的灵活性和方便性。并且经脱水晾干后的胶板像“膜”一样镀在24孔板孔内，染色斑几乎在同一平面上，观察时无需反复调焦，效率大为提高。
（3）由于本发明所制的胶板极薄，EB染料浓度仅需1μg/mL，仅为常规使用浓度的1/10～1/100，每孔10μL即可达到很好的图片效果，大大降低了剧毒药品EB在实验中的用量。
（4）本发明中电泳和解旋过程采用了不同的缓冲液，解旋用常规的碱解旋液，而电泳用的是TAE，传统单细胞凝胶电泳裂解和解旋都用碱解旋液，而碱解旋液离子浓度非常高，经常造成电流或电压（恒压或恒流）过载，无法达到预设值，导致实验难以进行。而采用TAE作为电泳液，很好地解决了上述问题。
附图说明
图1为小鼠原代脾细胞的单细胞凝胶电泳的荧光显微镜图。Control(a)为空白对照，所用受试化合物为H2O2，浓度分别为1μmol/L(b)、20μmol/L(c)、40μmol/L(d)，作用时间1.5h，受试细胞为小鼠原代脾细胞。
图2为人急性单核细胞（THP-1）的单细胞凝胶电泳的荧光显微镜图。Control(a)为空白对照，所用受试化合物为HgCl2，浓度分别为1μmol/L(b)、10μmol/L(c)、100μmol/L(d)，作用时间1.5h，受试细胞为人急性单核细胞。
图3为小鼠原代脾细胞的单细胞凝胶电泳的荧光显微镜图。Control(a)为空白对照，所用受试化合物为CuCl2，浓度分别为10nmol/L(b)、100nmol/L(c)、1μmol/L(d)，作用时间1.5h，受试细胞为小鼠原代脾细胞。
具体实施方式
实施例1：
（1）小鼠（Cavia porcellus）脾细胞样品的制备：颈椎脱臼处死小鼠，75%乙醇简单处理之后于超净台中迅速取出脾，置于玻璃平皿内，用预冷的PBS缓冲液冲洗掉表面的血液后，将其浸在PBS缓冲液中，用眼科手术剪刀将其剪碎为1～2mm3的小块。将悬有脾小块的PBS缓冲液吸入一次性无菌注射器（拔去针头）中反复压滤，过300目细胞筛，收集细胞悬液。常温下，1500rpm离心10min得细胞沉淀，再将其重悬于RMPI-1640中，并调节细胞密度约为8×105个/mL。
（2）细胞暴污：将细胞接种于24孔细胞培养板中，然后加入H2O2溶液，H2O2浓度分别为1μmol/L、20μmol/L、40μmol/L，同时设一个空白对照组，4℃暴污1.5h。暴污结束后，用PBS洗涤2次，1000rpm离心收集细胞，再用PBS重悬，调节细胞密度约为8×105个/mL待用。
（3）凝胶板的制备：将已准备好的细胞样品与用无钙、镁的PBS配制的0.5%的低熔点的琼脂糖凝胶在37℃下预热并混匀，取70μL铺于24孔细胞培养板板盖样品孔中，每个样品重复3个或以上，4℃冷却3～5min使胶层固化。
（4）细胞裂解：将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入细胞裂解液，于4℃避光裂解1.5h。
（5）DNA碱解旋：用碱解旋液小心冲洗裂解后的胶板，然后将胶板置于装有预冷碱解旋液容器中，4℃避光解旋20min。
（6）电泳：将碱解旋后的胶板先用电泳液冲洗，然后置于装有预冷电泳液（TAE）的电泳槽中进行电泳，电泳电压为20V（恒压），电泳时间为15min。
（7）中和：将电泳后的胶板置于装有Milli-Q水中常温下浸泡5min，重复2次。
（8）脱水与晾干：用滤纸尽量吸去中和后胶板表面的残留水，将胶板用预冷无水乙醇静置浸泡10min，取出胶板，重复脱水一次，将自然晾干之后的胶板冷藏保存。
（9）染色以及图像观察：在脱水干燥后的胶板上每孔用胶头滴管滴加一滴Milli-Q水，常温下静置3min。润湿胶板后每孔滴加10μL的溴化乙啶（1μg/mL），避光染色10min；用滤纸吸干胶板表面残余的染液，即可在515nm激发波长下进行图像采集。
实验结果（见图1）显示损伤的小鼠脾细胞的DNA碎片形成典型的彗星图像，而且拖尾长度与H2O2浓度呈现剂量效应关系。
实施例2：
（1）人急性单核细胞（THP-1）样品的制备：THP-1细胞培养在10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RMPI1640培养基中，37℃、5%CO2细胞培养箱培养。传代时用移液枪轻轻吹打使细胞均匀即可直接传代，根据实验需要将细胞接种于24孔细胞培养板中培养24h待用。
（2）细胞暴污：将细胞接种于24孔细胞培养板中，然后加入HgCl2溶液，HgCl2浓度分别为1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L，同时设一个空白对照组，4℃暴污1.5h。暴污结束后，用PBS洗涤2次，1200rpm离心收集细胞，再用PBS重悬，调节细胞密度约为8×105个/mL待用。
（3）后续操作参照实施例1步骤3～9。实验结果见图2。
实施例3：
（1）小鼠（Cavia porcellus）脾细胞样品的制备参照实施例1步骤1。
（2）细胞暴污：将细胞接种于24孔细胞培养板中，然后加入CuCl2溶液，CuCl2浓度分别为10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L，同时设一个空白对照组，4℃暴污1.5h。暴污结束后，用PBS洗涤2次，1000rpm离心收集细胞，再用PBS重悬，调节细胞密度约为8×105个/mL待用。
（3）后续操作参照实施例1步骤3～9。实验结果见图3。
Claims (6)
1.细胞DNA损伤检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1)凝胶板的制备：将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热，取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中，使胶平展铺开，冷却固化；所述将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热的方法为：将24孔细胞培养板板盖绞掉一组对应的横或者竖的外围，另一组保留，再将待测细胞样品与用无钙、镁PBS配制的低熔点琼脂糖凝胶预热；所述预热的温度为37℃；所述取混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中是取50～80μL混合液铺在24孔细胞培养板板盖样品孔中；所述使胶平展铺开采用枪头辅助推胶使胶平展铺开；所述冷却的条件为4℃下冷却3～5min；所述低熔点琼脂糖凝胶的质量分数为0.4％～0.6％，所述待测样品细胞密度为(8～10)×105个/mL，细胞悬液与低熔点琼脂糖凝胶的体积比为1∶3～5；
2)细胞裂解：将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入细胞裂解液中裂解；所述将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入细胞裂解液中裂解是将铺有单层胶的24孔细胞培养板板盖浸入4℃的细胞裂解液中避光裂解1.5～2h；所述细胞裂解液的组成为100mmol/LNa2EDTA、2.5mol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH＝10；临用前加Triton X-100至体积分数1％，同时加DMSO至体积分数10％；
3)DNA碱解旋：用碱性解旋液冲洗裂解后的胶板，然后将胶板浸入装有预冷碱性解旋液的容器中，静置；所述解旋液的组成为1mmol/L Na2EDTA，300mmol/L NaOH，pH>13；
4)电泳：将碱解旋后的胶板先用电泳液冲洗，然后置于装有预冷电泳液的电泳槽中进行电泳；所述电泳液为TAE，50×TAE配制方法为242g Tris-base、37.2g Na2EDTA·2H2O，加入57.1mL的冰乙酸充分溶解，用NaOH溶液调节pH值为8.3，Milli-Q水定容至1L，室温保存，使用前将其稀释50倍并置于4℃冷藏2h以上；
5)中和：将电泳后的胶板在Milli-Q水中浸泡；
6)脱水与晾干：用滤纸吸去中和后胶板表面的残留水，将胶板用预冷无水乙醇静置浸泡后，取出胶板，重复脱水一次，将自然晾干之后的胶板冷藏保存；
7)染色以及图像采集：在脱水干燥后的胶板上每孔用胶头滴管滴加一滴Milli-Q水，静置，润湿胶板后每孔滴加10～15μL的溴化乙啶，避光染色，用滤纸吸干胶板表面残余的染液，即在515nm激发波长下进行图像采集。
2.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述静置是在4℃避光静置15～25min。
3.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤4)中，所述电泳的条件为：电泳的电压为15～25V，恒压，电泳的时间为10～30min。
4.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤5)中，所述浸泡是浸泡5～10min，重复2～3次。
5.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤6)中，所述静置浸泡的时间为10～15min。
6.如权利要求1所述细胞DNA损伤检测方法，其特征在于在步骤7)中，所述静置的时间为2～3min；所述溴化乙啶的浓度为1μg/mL，所述避光染色的时间为10～15min。
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