CN105002158B - 一种野生烟草ssr指纹图谱及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种野生烟草SSR指纹图谱及其构建方法和应用，包括：选取多种核心野生烟草种质；提取核心野生烟草种质的DNA；用烟草核心引物进行核心野生烟草种质DNA的PCR扩增；电泳检测并根据检测结果确定理想引物组合构建指纹图谱。本发明建立了快速简便、经济实用、稳定可靠的构建野生烟草DNA指纹图谱和利用分子标记鉴定野生烟草资源的标准实验体系。其次，从54对烟草核心引物中筛选出了3对适用于野生烟草的特异性强、分辨率高、重复性好的SSR引物，并用这些引物构建了一种适用于野生烟草种质鉴定SSR指纹图谱。仅用3对SSR引物便可完全区分30份核心野生烟草种质，在时间上提高了试验效率，经济上节约了测试成本，与传统检测方法相比，具有快速、准确、经济等优势。

Description

一种野生烟草SSR指纹图谱及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及利用分子技术鉴定烟草种质资源技术领域，特别涉及一种野生烟草SSR指纹图谱及其构建方法和应用。

背景技术

烟草在植物分类学上属于双子叶植物纲(Dicotyledoneae)，管花目(Tubiflorae)，茄科(Solanaceae)，烟属(Nicotiana)。一般把烟属分为黄花烟亚属Rustica)、普通烟亚属(Tabacum)和碧冬烟亚属(Petuuioides)3个亚属，其中普通烟草种(Nicotiana tabacum L.)和黄花烟草种(Nicotiana rustica L.)可直接利用到栽培种植上，而野生烟则是宝贵的育种材料。由于长期在野外生存、经自然进化，野生烟草往往具有优良的抗病、抗虫、抗逆性，除此之外还具有栽培种中所不具备的独特品质性状，其蕴含的基因资源十分丰富。为今后能更好、更便捷地开发利用野生烟草资源，首先要做的就是对不同来源的野生烟的鉴定和甄别工作。

早期，人们多采用形态学的方法对烟草品种进行鉴定，即根据其外部特征以及田间表现来识别不同品种。这些方法有操作简单、相对经济的优点。但鉴定周期长，还易受环境、栽培技术、鉴定者的经验等因素影响，并且随着育种亲本利用集中化，通过形态差异进行烟草品种鉴定愈来愈困难。近年来，包括同工酶电泳、蛋白质电泳、高效液相色谱等内容的生物化学检测方法，逐渐被应用到烟草品种鉴定中来。该技术具有简便、快速、分辨力高、受环境影响小等优点。不过蛋白质具有表达的组织特异性和发育的阶段性，因此，取样部位或时间不一致都会带来误差，影响鉴定工作；而且同工酶一般要从幼苗或生长期的植株中提取，也需一定的鉴定周期；另外可利用的同工酶和所揭示的位点都比较有限，较难区分细小差异。

随后发展的分子标记技术基本上克服了传统方法的缺点，给种质鉴定工作提供了一种解决问题的全新途径用，分子标记技术直接在DNA水平上阐述差异,不受环境和基因表达影响，理论上能够区分每份种质在基因型上存在的微小差异。而利用分子标记技术建立DNA指纹图谱则是今后烟草品种、品系鉴定，审定品种和品种权登记保护等工作的必要工具。SSR分子标记因操作简单、重复性好、多态性丰富、共显性等特点，已被成功应用于绘制多种作物的DNA指纹图谱。2011年烟草SSR高密度遗传图谱的发表，提供了2317对定位在烟草各染色体上的标记，为使用SSR标记技术构建烟草指纹图谱提供了强大的保障。但分子标记使用对实验仪器,及操作人员的技术水平要求较高，使用的耗材药品造价较高,构建指纹图谱时，只有选用针对性强、高分辨率的精简标记才具有实际意义。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种野生烟草SSR指纹图谱及其构建方法和应用，能更好地开展烟草种质资源鉴定，保护地方品种、发掘新种质，并弥补传统鉴定方法的不足，且能用最简化的标记对野生烟进行准确、经济、快速的鉴定。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种野生烟草SSR指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

步骤一：选取多种核心野生烟草种质；

所述步骤一中，选取的核心野生烟草种质全国统一编号为：00001260、00001261、00001262、00001263、00001264、00001265、00001268、00001269、00001271、00001272、00001273、00001275、00002410、00002411、00002412、00002414、00002415、00002416、00002417、00002418、00002419、00002420、00002421、00002422、00002423、00002424、00002425、00002426、00002427、00003637；

步骤二：提取核心野生烟草种质的DNA；

步骤三：用烟草核心引物进行核心烟草种质DNA的pCR扩增；

步骤四：电泳检测并根据检测结果确定理想引物组合构建指纹图谱。

进一步的，所述步骤二中，提取DNA的具体操作为：取上述30种野生烟草的上部幼嫩叶片冷冻保存，使用 PlantM iniKit(QIAGEN)试剂盒，按照其操作说明提取各野生烟的总DNA，并用微量紫外分光光度计检测DNA纯度和浓度，-20℃保存备用。

进一步的，所述步骤三中，选取的烟草核心引物为以下54对：

进一步的，所述步骤三中，PCR扩展体系为：

进一步的，所述步骤三中，PCR条件为：95℃预变性5min：94℃变性15s、Tm：退火温度视引物而定，15s、72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min，反应结束后，产物放4℃保存。

所述步骤四中，电泳检测的具体步骤为：

用微量加样器分别吸取3μL的PCR扩增产物加入点样孔，采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，在25℃、180V恒压下垂直电泳分离；

电泳结束后，取下玻璃板用以下方法染色；

(1)固定：将附有凝胶的玻璃板以凝胶面朝上浸入已配好的1.5L的蒸馏水、150mL酒精、10mL醋酸混匀得到的固定液，静置8～10min，

(2)固定后取出用水洗一下，再将胶板置于1.5L蒸馏水、2.25g AgNO3、2.5mL甲醛混匀得到的染色液中振荡8～10min，染色过程需要避光；

(3)染色完成后，将胶板先在固定液中浸润，再放蒸馏水中；

(4)显色：将胶板置于22.5gNaOH、1.5L蒸馏水、3mL甲醛混匀的显色液中振荡5～10min，待条带显现后，停止震荡，取出胶板，

(5)显色后水洗，晾十分钟后拍照、封膜保存。

进一步的，所述步骤四中，指纹图谱的构建中，首先剔除分辨率低、扩增效果不理想的引物，再将保留的条带清晰、多样性水平高的SSR引物，条带的判读根据电泳图谱人工分析，SSR扩增产物在相同迁移率位置上，有带记作1，无带记作0，缺失记作9，不稳定的条带或弱带不进行统计，生成原始数据矩阵；每个SSR的多态性信息量PIC按公式PIC＝1-∑fi2，其中fi为i位点的基因频率，应用NTSYS-pc2.1软件，采用其中SHAN程序绘制各种质间的UPGMA聚类图；

依据上述步骤确定PT50132、PT60934、PT60600这三对引物为理想引物；

参照50bpDNALadder指示的标准分子量，对比样品的迁移位置来估计片段大小；确定样品每个位点的等位变异大小后，纯合位点的等位变异记作X/X，杂合位点的等位变异记作X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段的分子量大小，小片段在前，大片段在后；无效等位变异记作，将确定的三对引物的片段数据整合得到野生烟草的SSR指纹图谱。

一种野生烟草SSR指纹图谱，该图谱的引物为：

PT50132：F-CATTCAGCACGCACCTAAGA；R-ATGCTTCCAAACCTTTCTCG；

PT60934：F-CACACATCAGCTGCACATTG；R-CCTCACGAAGCATTCCATAAA；

PT60600：F-GGATGACCCACCTAATCCCT：R-TGGGTAAAGTATGCCGTTGG。

上述野生烟草SSR指纹图谱在识别野生烟草种属方面的应用。

包括提取核心烟草种质的DNA，用烟草核心引物进行PCR扩增，电泳检测和根据检测结果确定理想引物组合并构建指纹图谱，所用的30份野生烟草材料均为烟草核心种质资源，能够一定程度上代表野生烟草的基本信息；所用的54对SSR引物均为烟草核心引物(见表2)；最终用于构建图谱的3对引物PT50132、PT60934、PT60600，是从核心引物中筛选出的能够区分所有种质的最佳组合，引物序列如表3所示。

具体步骤如下：

(1)提取供试种质的DNA

使用 PlantM iniKit(Q IAGEN)试剂盒。

(2)核心引物对供试材料进行PCR扩增

用54对烟草核心SSR引物对供试品种DNA进行PCR扩增。在eppendorf公司的MastercyclergradientPCR仪中进行扩增。反应体系包含，DNA模板(100ng/μL)1.0μL，正反引物(10μmol/L)0.5μL，MIX5μL，ddH2O3μL，总体积为10μL。反应程序经优化后确定为：95℃预变性5min：94℃变性15s、Tm(退火温度视引物而定)15s、72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min。反应结束后，产物放4℃保存。

(3)PCR产物的电泳检测

采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，在25℃、180V恒压下垂直电泳分离。用微量加样器分别吸取5μL的PCR扩增产物加入点样孔，电泳时间由溴酚蓝指示根据引物实际情况而定。电泳结束后，取下玻璃板银染显色。

(4)引物的筛选

对比54对引物的电泳结果，首先剔除分辨率低、扩增效果不理想的引物。再将保留的条带清晰、多样性水平高的SSR引物，根据扩增产物在相同位点的迁移，有带记作1，无带记作0，缺失记作9，生成原始数据矩阵。通过计算各引物多样性指数，分别或分组进行聚类分析来确定最佳组合，即能将所有材料完全区分开的最少引物组合。最终，确定PT50132、PT60934、PT60600这三对引物可以满足条件。

(5)野生烟草指纹图谱的构建

参照50bpDNALadder指示的标准分子量，对比样品的迁移位置来估计片段大小。确定样品每个位点的等位变异大小后，纯合位点的等位变异记作X/X，杂合位点的等位变异记作X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段的分子量大小，小片段在前，大片段在后；无效等位变异记作，将确定的三对引物的片段数据整合为野生烟草的SSR指纹图谱。本发明所构建的SSR指纹图谱如表4所示，用3对SSR引物可以将30份核心野生烟草种质完全区分开，说明对几乎所有野生烟草资源的鉴定都具有指导作用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：首先，本发明建立了快速简便、经济实用、稳定可靠的构建野生烟草DNA指纹图谱和利用分子标记鉴定野生烟草资源的标准实验体系。其次，从54对烟草核心引物中筛选出了3对适用于野生烟草的特异性强、分辨率高、重复性好的SSR引物，并用这些引物构建了一种适用于野生烟草种质鉴定SSR指纹图谱。本发明，仅用3对SSR引物便可完全区分30份核心野生烟草种质，在时间上提高了试验效率，经济上节约了测试成本，与传统检测方法相比，具有快速、准确、经济等优势。

附图说明

图1引物PT50132对部分野生烟材料的电泳图。

图2引物PT60934对部分野生烟材料的电泳图。

图3引物PT60600对部分野生烟材料的电泳图。

图4 30份野生烟核心种质基于SSR引物PT50132、PT60934、PT60600的聚类图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

1 DNA提取

本研究选取了30份野生烟草种质为试验材料(表1)，所有材料均为烟草核心种质资源，由国家烟草种质库提供。

表1 供试用野生烟草种质材料

取试验材料的上部幼嫩叶片冷冻保存。使用 Plant MiniKit(QIAGEN)试剂盒，按照其操作说明提取各野生烟的总DNA。并用微量紫外分光光度计检测DNA纯度和浓度，-20℃保存备用。

2引物准备

利用烟草不同染色体上的54对烟草核心SSR引物(表2)，由北京奥科鼎盛合成。对30份野生烟草核心种质分别用这54个标记进行检测。

表2 54对烟草核心引物

3SSR-PCR扩增

在eppendorf公司的MastercyclergradientPCR仪中进行扩增反应，反应体系如下：

将各种成分混匀后进行PCR，反应程序经优化后确定为：95℃预变性5min：94℃变性15s、Tm(退火温度视引物而定)15s、72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min。反应结束后，产物放4℃保存。

4电泳与染色

用微量加样器分别吸取3μL的PCR扩增产物加入点样孔，采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，在25℃、180V恒压下垂直电泳分离。电泳时间由溴酚蓝指示根据引物实际情况而定。

电泳结束后，取下玻璃板用用以下方法染色。

(1)固定：将附有凝胶的玻璃板以凝胶面朝上浸入已配好的固定液(1.5L的蒸馏水、150mL酒精、10mL醋酸混匀)中，静置8～10min。

(2)固定后取出用水洗一下，再将胶板置于染色液(1.5L蒸馏水、2.25gAgNO3、2.5mL甲醛混匀)中振荡8～10min。(注意染色过程需要要避光)

(3)染色完成后，将胶板先在固定液中浸一下，再放蒸馏水中过一下。

(4)显色：接着将胶板置于显色液(22.5gNaOH、1.5L蒸馏水、3mL甲醛混匀)中振荡5～10min，待条带显现后，停止震荡，取出胶板。

(5)显色后用水洗一下，晾十分钟后拍照、封膜保存。

注意：染色过程中所用试剂均需现用现配。

5数据统计与分析

对比54对引物的电泳结果，首先剔除分辨率低、扩增效果不理想的引物。再将保留的条带清晰、多样性水平高的SSR引物。条带的判读根据电泳图谱人工分析，SSR扩增产物在相同迁移率位置上，有带记作1，无带记作0，缺失记作9，不稳定的条带或弱带不进行统计，生成原始数据矩阵，来进行相关计算。每个SSR的多态性信息量(Polymorphic InformationContent，简称PIC)按公式PIC＝1-∑fi2，其中fi为i位点的基因频率。应用NTSYS-pc2.1软件，采用其中SHAN程序绘制各种质间的UPGMA聚类图。

通过分析各引物的多态性，结合分别或分组进行聚类分析的结果可以确定PT50132、PT60934、PT60600这三对引物满足条件。这3对引物能将所有材料完全区分开(附图4)的最简引物组合。而且特异性强、重复性好、表现稳定，可用于构建野生烟草的SSR指纹图谱。

表3 用于构建野生烟草SSR指纹图谱的引物信息

参照50bpDNALadder指示的标准分子量，对比样品的迁移位置来估计片段大小。确定样品每个位点的等位变异大小后，纯合位点的等位变异记作X/X，杂合位点的等位变异记作X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段的分子量大小，小片段在前，大片段在后；无效等位变异记作，将确定的三对引物的片段数据整合为野生烟草的SSR指纹图谱(表4)。

本发明所构建的SSR指纹图谱，用3对SSR引物可以将供试的30份野生烟草材料完全区分开来(图4)，而这30份材料均是野生烟草核心种质能够代表野生烟草资源的整体情况，说明本发明构建的指纹图谱，对几乎所有野生烟草资源的鉴定评价工作都具有指导作用。

表4 30份野生烟草核心种质的SSR指纹数据

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种核心野生烟草SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：筛选能代表核心野生烟草遗传多样性的核心种质材料；

所述步骤一中，选取的核心野生烟草种质全国统一编号为：00001260、00001261、00001262、00001263、00001264、00001265、00001268、00001269、00001271、00001272、00001273、00001275、00002410、00002411、00002412、00002414、00002415、00002416、00002417、00002418、00002419、00002420、00002421、00002422、00002423、00002424、00002425、00002426、00002427、00003637；

步骤二：提取核心野生烟草种质的DNA；

步骤三：用烟草核心引物对所提DNA进行PCR扩增；

步骤四：电泳检测并根据检测结果确定理想引物组合构建指纹图谱；

所述步骤三中，选取的烟草核心引物为以下54对：

其中，PT50132、PT60934、PT60600这三对引物为理想引物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，提取DNA的具体操作为：取上述30种野生烟草的上部幼嫩叶片冷冻保存，使用 Plant Mini Kit(QIAGEN)试剂盒，按照其操作说明提取各野生烟的总DNA，并用微量紫外分光光度计检测DNA纯度和浓度，-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，PCR扩展体系为：

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，PCR条件为：95℃预变性5min：94℃变性15s、Tm：退火温度视引物而定，15s、72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min，反应结束后，产物放4℃保存。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，电泳检测的具体步骤为：

用微量加样器分别吸取3μL的PCR扩增产物加入点样孔，采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，在25℃、180V恒压下垂直电泳分离；

电泳结束后，取下玻璃板用以下方法染色；

(1)固定：将附有凝胶的玻璃板以凝胶面朝上浸入已配好的1.5L的蒸馏水、150mL酒精、10mL醋酸混匀得到的固定液，静置8～10min，

(2)固定后取出用水洗一下，再将胶板置于1.5L蒸馏水、2.25gAgNO₃、2.5mL甲醛混匀得到的染色液中振荡8～10min，染色过程需要避光；

(3)染色完成后，将胶板先在固定液中浸润，再放蒸馏水中；

(4)显色：将胶板置于22.5g NaOH、1.5L蒸馏水、3mL甲醛混匀的显色液中振荡5～10min，待条带显现后，停止震荡，取出胶板，

(5)显色后水洗，晾十分钟后拍照、封膜保存。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，指纹图谱的构建中，首先剔除分辨率低、扩增效果不理想的引物，再将保留的条带清晰、多样性水平高的SSR引物，条带的判读根据电泳图谱人工分析，SSR扩增产物在相同迁移率位置上，有带记作1，无带记作0，缺失记作9，不稳定的条带或弱带不进行统计，生成原始数据矩阵；每个SSR的多态性信息量PIC按公式PIC＝1-∑fi²，其中fi为i位点的基因频率，应用NTSYS-pc2.1软件，采用其中SHAN程序绘制各种质间的UPGMA聚类图；

依据上述步骤确定PT50132、PT60934、PT60600这三对引物为理想引物；

参照50bpDNALadder指示的标准分子量，对比样品的迁移位置来估计片段大小；确定样品每个位点的等位变异大小后，纯合位点的等位变异记作X/X，杂合位点的等位变异记作X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段的分子量大小，小片段在前，大片段在后；无效等位变异记作“—”，将确定的三对引物的片段数据整合得到野生烟草的SSR指纹图谱。

7.一种核心野生烟草SSR指纹图谱，其特征在于，该图谱的引物为：

PT50132：F-CATTCAGCACGCACCTAAGA；R-ATGCTTCCAAACCTTTCTCG；

PT60934：F-CACACATCAGCTGCACATTG；

R-CCTCACGAAGCATTCCATAAA；

PT60600：F-GGATGACCCACCTAATCCCT：R-TGGGTAAAGTATGCCGTTGG。

8.权利要求7所述核心野生烟草SSR指纹图谱在识别野生烟草种属方面的应用。