CN105002158A - 一种野生烟草ssr指纹图谱及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种野生烟草SSR指纹图谱及其构建方法和应用,包括:选取多种核心野生烟草种质;提取核心野生烟草种质的DNA;用烟草核心引物进行核心野生烟草种质DNA的PCR扩增;电泳检测并根据检测结果确定理想引物组合构建指纹图谱。本发明建立了快速简便、经济实用、稳定可靠的构建野生烟草DNA指纹图谱和利用分子标记鉴定野生烟草资源的标准实验体系。其次,从54对烟草核心引物中筛选出了3对适用于野生烟草的特异性强、分辨率高、重复性好的SSR引物,并用这些引物构建了一种适用于野生烟草种质鉴定SSR指纹图谱。仅用3对SSR引物便可完全区分30份核心野生烟草种质,在时间上提高了试验效率,经济上节约了测试成本,与传统检测方法相比,具有快速、准确、经济等优势。
Description
技术领域
本发明涉及利用分子技术鉴定烟草种质资源技术领域,特别涉及一种野生烟草SSR指纹图谱及其构建方法和应用。
背景技术
烟草在植物分类学上属于双子叶植物纲(Dicotyledoneae),管花目(Tubiflorae),茄科(Solanaceae),烟属(Nicotiana)。一般把烟属分为黄花烟亚属Rustica)、普通烟亚属(Tabacum)和碧冬烟亚属(Petuuioides)3个亚属,其中普通烟草种(Nicotiana tabacum L.)和黄花烟草种(Nicotiana rustica L.)可直接利用到栽培种植上,而野生烟则是宝贵的育种材料。由于长期在野外生存、经自然进化,野生烟草往往具有优良的抗病、抗虫、抗逆性,除此之外还具有栽培种中所不具备的独特品质性状,其蕴含的基因资源十分丰富。为今后能更好、更便捷地开发利用野生烟草资源,首先要做的就是对不同来源的野生烟的鉴定和甄别工作。
早期,人们多采用形态学的方法对烟草品种进行鉴定,即根据其外部特征以及田间表现来识别不同品种。这些方法有操作简单、相对经济的优点。但鉴定周期长,还易受环境、栽培技术、鉴定者的经验等因素影响,并且随着育种亲本利用集中化,通过形态差异进行烟草品种鉴定愈来愈困难。近年来,包括同工酶电泳、蛋白质电泳、高效 液相色谱等内容的生物化学检测方法,逐渐被应用到烟草品种鉴定中来。该技术具有简便、快速、分辨力高、受环境影响小等优点。不过蛋白质具有表达的组织特异性和发育的阶段性,因此,取样部位或时间不一致都会带来误差,影响鉴定工作;而且同工酶一般要从幼苗或生长期的植株中提取,也需一定的鉴定周期;另外可利用的同工酶和所揭示的位点都比较有限,较难区分细小差异。
随后发展的分子标记技术基本上克服了传统方法的缺点,给种质鉴定工作提供了一种解决问题的全新途径用,分子标记技术直接在DNA水平上阐述差异,不受环境和基因表达影响,理论上能够区分每份种质在基因型上存在的微小差异。而利用分子标记技术建立DNA指纹图谱则是今后烟草品种、品系鉴定,审定品种和品种权登记保护等工作的必要工具。SSR分子标记因操作简单、重复性好、多态性丰富、共显性等特点,已被成功应用于绘制多种作物的DNA指纹图谱。2011年烟草SSR高密度遗传图谱的发表,提供了2317对定位在烟草各染色体上的标记,为使用SSR标记技术构建烟草指纹图谱提供了强大的保障。但分子标记使用对实验仪器,及操作人员的技术水平要求较高,使用的耗材药品造价较高,构建指纹图谱时,只有选用针对性强、高分辨率的精简标记才具有实际意义。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题,本发明的目的在于提供一种野生烟草SSR指纹图谱及其构建方法和应用,能更好地开展烟草种质资源鉴定,保护地方品种、发掘新种质,并弥补传统鉴定方法的不足, 且能用最简化的标记对野生烟进行准确、经济、快速的鉴定。
为达到上述目的,本发明的技术方案为:
一种野生烟草SSR指纹图谱的构建方法,包括如下步骤:
步骤一:筛选能代表野生烟草遗传多样性的核心种质材料;
所述步骤一中,选取的核心野生烟草种质全国统一编号为:
00001260、00001261、00001262、00001263、00001264、00001265、
00001268、00001269、00001271、00001272、00001273、00001275、
00002410、00002411、00002412、00002414、00002415、00002416、
00002417、00002418、00002419、00002420、00002421、00002422、
00002423、00002424、00002425、00002426、00002427、00003637;
步骤二:提取核心野生烟草种质的DNA;
步骤三:用烟草核心引物进行核心烟草种质DNA的PCR扩增;
步骤四:电泳检测并根据检测结果确定理想引物组合构建指纹图谱。
进一步的,所述步骤二中,提取DNA的具体操作为:取上述30种野生烟草的上部幼嫩叶片冷冻保存,使用PlantM iniKit(QIAGEN)试剂盒,按照其操作说明提取各野生烟的总DNA,并用微量紫外分光光度计检测DNA纯度和浓度,-20℃保存备用。
进一步的,所述步骤三中,选取的烟草核心引物为以下54对:
进一步的,所述步骤三中,PCR扩展体系为:
进一步的,所述步骤三中,PCR条件为:95℃预变性5min:94℃变性15s、Tm:退火温度视引物而定,15s、72℃延伸30s,35个循环;最后72℃延伸7min,反应结束后,产物放4℃保存。
所述步骤四中,电泳检测的具体步骤为:
用微量加样器分别吸取3μL的PCR扩增产物加入点样孔,采用8%的聚丙烯酰胺凝胶,在25℃、180V恒压下垂直电泳分离;
电泳结束后,取下玻璃板用以下方法染色;
(1)固定:将附有凝胶的玻璃板以凝胶面朝上浸入已配好的1.5L的蒸馏水、150mL酒精、10mL醋酸混匀得到的固定液,静置8~10min,
(2)固定后取出用水洗一下,再将胶板置于1.5L蒸馏水、2.25g AgNO3、2.5mL甲醛混匀得到的染色液中振荡8~10min,染色过程需要避光;
(3)染色完成后,将胶板先在固定液中浸润,再放蒸馏水中;
(4)显色:将胶板置于22.5g NaOH、1.5L蒸馏水、3mL甲醛混匀的显色液中振荡5~10min,待条带显现后,停止震荡,取出胶板,
(5)显色后水洗,晾十分钟后拍照、封膜保存。
进一步的,所述步骤四中,指纹图谱的构建中,首先剔除分辨率低、扩增效果不理想的引物,再将保留的条带清晰、多样性水平高的SSR引物,条带的判读根据电泳图谱人工分析,SSR扩增产物在相同迁移率位置上,有带记作1,无带记作0,缺失记作9,不稳定的条带或弱带不进行统计,生成原始数据矩阵;每个SSR的多态性信息量PIC按公式PIC=1-∑fi2,其中fi为i位点的基因频率,应用NTSYS-pc2.1软件,采用其中SHAN程序绘制各种质间的UPGMA聚类图;
依据上述步骤确定PT50132、PT60934、PT60600这三对引物为理想引物;
参照50bpDNALadder指示的标准分子量,对比样品的迁移位置来估计片段大小;确定样品每个位点的等位变异大小后,纯合位点的等位变异记作X/X,杂合位点的等位变异记作X/Y,其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段的分子量大小,小片段在前,大片段在后;无效等位变异记作“—”,将确定的三对引物的片段数据整合得到野生烟草的SSR指纹图谱。
一种野生烟草SSR指纹图谱,该图谱的引物为:
PT50132:F-CATTCAGCACGCACCTAAGA;R-ATGCTTCCAAACCTTTCTCG;
PT60934:F-CACACATCAGCTGCACATTG;R-CCTCACGAAGCATTCCATAAA;
PT60600:F-GGATGACCCACCTAATCCCT:R-TGGGTAAAGTATGCCGTTGG。
上述野生烟草SSR指纹图谱在识别野生烟草种属方面的应用。
包括提取核心烟草种质的DNA,用烟草核心引物进行PCR扩增,电泳检测和根据检测结果确定理想引物组合并构建指纹图谱,所用的30份野生烟草材料均为烟草核心种质资源,能够一定程度上代表野生烟草的基本信息;所用的54对SSR引物均为烟草核心引物(见表2);最终用于构建图谱的3对引物PT50132、PT60934、PT60600,是从核心引物中筛选出的能够区分所有种质的最佳组合,引物序列如表3所示。
具体步骤如下:
(1)提取供试种质的DNA
使用Plant Mini Kit(QIAGEN)试剂盒。
(2)核心引物对供试材料进行PCR扩增
用54对烟草核心SSR引物对供试品种DNA进行PCR扩增。在eppendorf公司的MastercyclergradientPCR仪中进行扩增。反应体系包含,DNA模板(100ng/μL)1.0μL,正反引物(10μmol/L)0.5μL,MIX5μL,ddH2O3μL,总体积为10μL。反应程序经优化后确定为:95℃预变性5min:94℃变性15s、Tm(退火温度视引物而定)15s、72℃延伸30s,35个循环;最后72℃延伸7min。反应结束后,产物放4℃保存。
(3)PCR产物的电泳检测
采用8%的聚丙烯酰胺凝胶,在25℃、180V恒压下垂直电泳分离。用微量加样器分别吸取5μL的PCR扩增产物加入点样孔,电泳时间由溴酚蓝指示根据引物实际情况而定。电泳结束后,取下玻璃板银染显色。
(4)引物的筛选
对比54对引物的电泳结果,首先剔除分辨率低、扩增效果不理想的引物。再将保留的条带清晰、多样性水平高的SSR引物,根据扩增产物在相同位点的迁移,有带记作1,无带记作0,缺失记作9,生成原始数据矩阵。通过计算各引物多样性指数,分别或分组进行聚类分析来确定最佳组合,即能将所有材料完全区分开的最少引物组合。最终,确定PT50132、PT60934、PT60600这三对引物可以满足条件。
(5)野生烟草指纹图谱的构建
参照50bpDNALadder指示的标准分子量,对比样品的迁移位置来估计片段大小。确定样品每个位点的等位变异大小后,纯合位点的等位变异记作X/X,杂合位点的等位变异记作X/Y,其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段的分子量大小,小片段在前,大片段在后;无效等位变异记作“—”,将确定的三对引物的片段数据整合为野生烟草的SSR指纹图谱。本发明所构建的SSR指纹图谱如表4所示,用3对SSR引物可以将30份核心野生烟草种质完全区分开,说明对几乎所有野生烟草资源的鉴定都具有指导作用。
相对于现有技术,本发明的有益效果为:首先,本发明建立了快速简便、经济实用、稳定可靠的构建野生烟草DNA指纹图谱和利用分子标记鉴定野生烟草资源的标准实验体系。其次,从54对烟草核 心引物中筛选出了3对适用于野生烟草的特异性强、分辨率高、重复性好的SSR引物,并用这些引物构建了一种适用于野生烟草种质鉴定SSR指纹图谱。本发明,仅用3对SSR引物便可完全区分30份核心野生烟草种质,在时间上提高了试验效率,经济上节约了测试成本,与传统检测方法相比,具有快速、准确、经济等优势。
附图说明
图1引物PT50132对部分野生烟材料的电泳图。
图2引物PT60934对部分野生烟材料的电泳图。
图3引物PT60600对部分野生烟材料的电泳图。
图4 30份野生烟核心种质基于SSR引物PT50132、PT60934、PT60600的聚类图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述:
1 DNA提取
本研究选取了30份野生烟草种质为试验材料(表1),所有材料均为烟草核心种质资源,由国家烟草种质库提供。
表1 供试用野生烟草种质材料
取试验材料的上部幼嫩叶片冷冻保存。使用Plant Mini Kit(QIAGEN)试剂盒,按照其操作说明提取各野生烟的总DNA。并用微量紫外分光光度计检测DNA纯度和浓度,-20℃保存备用。
2 引物准备
利用烟草不同染色体上的54对烟草核心SSR引物(表2),由北京奥科鼎盛合成。对30份野生烟草核心种质分别用这54个标记进行检测。
表2 54对烟草核心引物
3 SSR-PCR扩增
在eppendorf公司的Mastercycler gradient PCR仪中进行扩增反应,反应体系如下:
将各种成分混匀后进行PCR,反应程序经优化后确定为:95℃预变性5min:94℃变性15s、Tm(退火温度视引物而定)15s、72℃延伸30s,35个循环;最后72℃延伸7min。反应结束后,产物放4℃保存。
4 电泳与染色
用微量加样器分别吸取3μL的PCR扩增产物加入点样孔,采用8%的聚丙烯酰胺凝胶,在25、℃180V恒压下垂直电泳分离。电泳时间由溴酚蓝指示根据引物实际情况而定。
电泳结束后,取下玻璃板用用以下方法染色。
(1)固定:将附有凝胶的玻璃板以凝胶面朝上浸入已配好的固定液(1.5L的蒸馏水、150mL酒精、10mL醋酸混匀)中,静置8~10min。
(2)固定后取出用水洗一下,再将胶板置于染色液(1.5L蒸馏水、2.25g AgNO3、2.5mL甲醛混匀)中振荡8~10min。(注意染色过程需要要避光)
(3)染色完成后,将胶板先在固定液中浸一下,再放蒸馏水中过一下。
(4)显色:接着将胶板置于显色液(22.5g NaOH、1.5L蒸馏水、3mL甲醛混匀)中振荡5~10min,待条带显现后,停止震荡,取出胶板。
(5)显色后用水洗一下,晾十分钟后拍照、封膜保存。
注意:染色过程中所用试剂均需现用现配。
5 数据统计与分析
对比54对引物的电泳结果,首先剔除分辨率低、扩增效果不理想的引物。再将保留的条带清晰、多样性水平高的SSR引物。条带的判读根据电泳图谱人工分析,SSR扩增产物在相同迁移率位置上, 有带记作1,无带记作0,缺失记作9,不稳定的条带或弱带不进行统计,生成原始数据矩阵,来进行相关计算。每个SSR的多态性信息量(Polymorphic Information Content,简称PIC)按公式PIC=1-∑fi2,其中fi为i位点的基因频率。应用NTSYS-pc2.1软件,采用其中SHAN程序绘制各种质间的UPGMA聚类图。
通过分析各引物的多态性,结合分别或分组进行聚类分析的结果可以确定PT50132、PT60934、PT60600这三对引物满足条件。这3对引物能将所有材料完全区分开(附图4)的最简引物组合。而且特异性强、重复性好、表现稳定,可用于构建野生烟草的SSR指纹图谱。
表3 用于构建野生烟草SSR指纹图谱的引物信息
参照50bpDNALadder指示的标准分子量,对比样品的迁移位置来估计片段大小。确定样品每个位点的等位变异大小后,纯合位点的等位变异记作X/X,杂合位点的等位变异记作X/Y,其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段的分子量大小,小片段在前,大片段在后;无效等位变异记作“—”,将确定的三对引物的片段数据整合为 野生烟草的SSR指纹图谱(表4)。
本发明所构建的SSR指纹图谱,用3对SSR引物可以将供试的30份野生烟草材料完全区分开来(图4),而这30份材料均是野生烟草核心种质能够代表野生烟草资源的整体情况,说明本发明构建的指纹图谱,对几乎所有野生烟草资源的鉴定评价工作都具有指导作用。
表4 30份野生烟草核心种质的SSR指纹数据
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何不经过创造性劳动想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种野生烟草SSR指纹图谱的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一:筛选能代表核心野生烟草遗传多样性的核心种质材料;
所述步骤一中,选取的核心野生烟草种质全国统一编号为:00001260、00001261、00001262、00001263、00001264、00001265、00001268、00001269、00001271、00001272、00001273、00001275、00002410、00002411、00002412、00002414、00002415、00002416、00002417、00002418、00002419、00002420、00002421、00002422、00002423、00002424、00002425、00002426、00002427、00003637;
步骤二:提取核心野生烟草种质的DNA;
步骤三:用烟草核心引物对所提DNA进行PCR扩增;
步骤四:电泳检测并根据检测结果确定理想引物组合构建指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤二中,提取DNA的具体操作为:取上述30种野生烟草的上部幼嫩叶片冷冻保存,使用Plant Mini Kit(QIAGEN)试剂盒,按照其操作说明提取各野生烟的总DNA,并用微量紫外分光光度计检测DNA纯度和浓度,-20℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤三中,选取的烟草核心引物为以下54对:
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤三中,PCR扩展体系为:
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤三中,PCR条件为:95℃预变性5min:94℃变性15s、Tm:退火温度视引物而定,15s、72℃延伸30s,35个循环;最后72℃延伸7min,反应结束后,产物放4℃保存。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤四中,电泳检测的具体步骤为:
用微量加样器分别吸取3μL的PCR扩增产物加入点样孔,采用8%的聚丙烯酰胺凝胶,在25℃、180V恒压下垂直电泳分离;
电泳结束后,取下玻璃板用以下方法染色;
(1)固定:将附有凝胶的玻璃板以凝胶面朝上浸入已配好的1.5L的蒸馏水、150mL酒精、10mL醋酸混匀得到的固定液,静置8~10min,
(2)固定后取出用水洗一下,再将胶板置于1.5L蒸馏水、2.25gAgNO3、2.5mL甲醛混匀得到的染色液中振荡8~10min,染色过程需要避光;
(3)染色完成后,将胶板先在固定液中浸润,再放蒸馏水中;
(4)显色:将胶板置于22.5g NaOH、1.5L蒸馏水、3mL甲醛混匀的显色液中振荡5~10min,待条带显现后,停止震荡,取出胶板,
(5)显色后水洗,晾十分钟后拍照、封膜保存。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述步骤四中,指纹图谱的构建中,首先剔除分辨率低、扩增效果不理想的引物,再将保留的条带清晰、多样性水平高的SSR引物,条带的判读根据电泳图谱人工分析,SSR扩增产物在相同迁移率位置上,有带记作1,无带记作0,缺失记作9,不稳定的条带或弱带不进行统计,生成原始数据矩阵;每个SSR的多态性信息量PIC按公式PIC=1-∑fi2,其中fi为i位点的基因频率,应用NTSYS-pc2.1软件,采用其中SHAN程序绘制各种质间的UPGMA聚类图;
依据上述步骤确定PT50132、PT60934、PT60600这三对引物为理想引物;
参照50bpDNALadder指示的标准分子量,对比样品的迁移位置来估计片段大小;确定样品每个位点的等位变异大小后,纯合位点的等位变异记作X/X,杂合位点的等位变异记作X/Y,其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段的分子量大小,小片段在前,大片段在后;无效等位变异记作“—”,将确定的三对引物的片段数据整合得到野生烟草的SSR指纹图谱。
8.一种野生烟草SSR指纹图谱,其特征在于,该图谱的引物为:
PT50132:F-CATTCAGCACGCACCTAAGA;R-ATGCTTCCAAACCTTTCTCG;
PT60934:F-CACACATCAGCTGCACATTG;R-CCTCACGAAGCATTCCATAAA;
PT60600:F-GGATGACCCACCTAATCCCT:R-TGGGTAAAGTATGCCGTTGG。
9.上述野生烟草SSR指纹图谱在识别野生烟草种属方面的应用。
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