CN107541568A - 一种烤烟ssr核心引物组合及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烤烟SSR核心引物组合及其构建方法，利用烟草育种上常用的5份烤烟种质对已公布的2317对SSR标记进行初步筛选，再利用20份烤烟种质对获得的初筛获得的引物进行复筛和验证，最终挑选出24对带型清晰，多态性高，适合烤烟品种遗传分析的SSR核心引物。本发明获得的SSR核心引物组合具有多态性高、扩增稳定、操作简单等优点，筛选出的SSR组合可以直接利用，改变了通常使用SSR引物时需要进行大量筛选的过程，大大提高了筛选效率，利用该核心引物可以有效评价不同烤烟材料间的遗传多样性和亲缘关系，有助于提高烤烟育种效率。
Description
技术领域
本发明属于烟草育种领域，尤其涉及一种烤烟SSR核心引物组合及其构建方法。
背景技术
烟草是重要的经济作物，在全世界120多个国家均有种植，其中，我国主栽的是普通烟草种的烤烟类型。在长期的烤烟育种过程中，由于集中使用几个主体亲本，从而导致目前烟草品种的遗传基础狭窄。研究烤烟品种的遗传多样性，分析其亲缘关系，对拓宽其种质资源的遗传基础，科学、合理的选配亲本组合具有重要的理论意义。
利用分子标记分析种质资源遗传多样性和亲缘关系已经在很多重要作物上广泛开展。普通烟草在植物分类上属于茄科烟草属，其基因组大小约4.5G，在目前已知的茄科植物中基因组较大，并且基因组中70％以上为重复序列。烟草种质资源的遗传多样性研究一直落后于其他作物，之前，烟草种质遗传分析主要采用ISSR和AFLP标记，自Bindler等公布了烟草高密度SSR标记遗传图谱后，SSR标记被广泛应用于烟草种质资源遗传多样性分析。与其他标记相比，SSR标记多态性高，专一性强，适合多倍体物种的遗传分析。丛鑫等利用45对SSR引物将78份抗PVY的烟草种质按照遗传多样性划分为3类。陈夏晔等利用34对多态性SSR引物对73份烟草抗黑胫病种质进行遗传多样性分析，结果表明其遗传多样性较差。Moon等利用70对SSR标记，对不同来源、不同类型的702份烟草种质进行遗传多样性分析，共检测到1031个等位基因变异，平均等位基因数14.7，平均遗传多样性指数0.74。
目前，已经公布的SSR标记数超过5000对，在利用SSR标记进行烟草种质遗传分析时，如何选择有代表性的标记是研究者面临的一个问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烤烟SSR核心引物组合及其构建方法，旨在提高烤烟种质资源的遗传分析和亲缘关系检测的效率和准确性。
本发明是这样实现的，一种烤烟SSR核心引物组合由以下24对引物组成：
PT52573，SEQ ID NO：1，其由序列表中序列1所示的DNA碱基和序列2所示的DNA碱基组成；
PT60795，SEQ ID NO：2，其由序列表中序列3所示的DNA碱基和序列4所示的DNA碱基组成；
PT53936，SEQ ID NO：3，其由序列表中序列5所示的DNA碱基和序列6所示的DNA碱基组成；
PT60629，SEQ ID NO：4，其由序列表中序列7所示的DNA碱基和序列8所示的DNA碱基组成；
PT50244，SEQ ID NO：5，其由序列表中序列9所示的DNA碱基和序列10所示的DNA碱基组成；
PT60698，SEQ ID NO：6，其由序列表中序列11所示的DNA碱基和序列12所示的DNA碱基组成；
PT60038，SEQ ID NO：7，其由序列表中序列13所示的DNA碱基和序列14所示的DNA碱基组成；
PT60435，SEQ ID NO：8，其由序列表中序列15所示的DNA碱基和序列16所示的DNA碱基组成；
PT50501，SEQ ID NO：9，其由序列表中序列17所示的DNA碱基和序列18所示的DNA碱基组成；
PT50176，SEQ ID NO：10，其由序列表中序列19所示的DNA碱基和序列20所示的DNA碱基组成；
PT51144，SEQ ID NO：11，其由序列表中序列21所示的DNA碱基和序列22所示的DNA碱基组成；
PT30046，SEQ ID NO：12，其由序列表中序列23所示的DNA碱基和序列24所示的DNA碱基组成；
PT61010，SEQ ID NO：13，其由序列表中序列25所示的DNA碱基和序列26所示的DNA碱基组成；
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PT30272，SEQ ID NO：16其由序列表中序列31所示的DNA碱基和序列32所示的DNA碱基组成；
PT30302，SEQ ID NO：17，其由序列表中序列33所示的DNA碱基和序列34所示的DNA碱基组成；
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PT53384，SEQ ID NO：19，其由序列表中序列37所示的DNA碱基和序列38所示的DNA碱基组成；
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PT50298，SEQ ID NO：21，其由序列表中序列41所示的DNA碱基和序列42所示的DNA碱基组成；
PT54196，SEQ ID NO：22，其由序列表中序列43所示的DNA碱基和序列44所示的DNA碱基组成；
PT50472，SEQ ID NO：23，其由序列表中序列45所示的DNA碱基和序列46所示的DNA碱基组成；
PT30132，SEQ ID NO：24，其由序列表中序列47所示的DNA碱基和序列48所示的DNA碱基组成；
序列表如下：
序列1：TGATCCGTTTGGAGAAGTCA：
序列3：ATGAAACTTTCGCATGGCTC
序列5：CTTGTACCATCTCAAATGACCC
序列7：TGCACTCACAGACGAACACA(序列7)
序列9：CAATGATGGAAATGAAATCCAA(序列9)
序列11：CTTGTTCCTCTCACATCGGG(序列11)
序列13：CATCACCTTTCTCATTTCCACA(序列13)
序列15：AACCGAAACAAGGGAACAGA(序列15)
序列17：ATGAAGGCTCCATCAACGAC(序列17)
序列19：TGTCATGTTAGCATTCTTTGGC(序列19)
序列21：ACCGACAACACACGATTGTA(序列21)
序列23：GATAGGTAGATTATCCTCTGCAACA(序列23)
序列25：TCAATTCCCTTCTGCCTTTG(序列25)
序列27：CGTTTCTCTTCCAATTAACAGC(序列27)
序列29：CCACAAACTATCTGGTGTCCC(序列29)
序列31：GAACCTAACCTCGCTCCACA(序列31)
序列33：CCTTCCTAACCTCAGCTGGAA(序列33)
序列35：TCATGAGAGGCAGACAGTGTT(序列35)
序列37：CAACCGCAAGAGATCCTTCT(序列37)
序列39：GCTTGGCATCATCAGAATTT(序列39)
序列41：CCACAGCATGTAGACAACGG(序列41)
序列43：CCTATGTTTGGAGCAGAGGG(序列43)
序列45：TCCAACACAGAATATTTATACGAAGG(序列45)
序列47：CCTAACAGCATTTGCTACCCA(序列47)
序列2：GGCGAAATTAGAAATTGTATCTCAA(序列2)
序列4：GCCAGCCAGGTGACAATAAT(序列4)
序列6：GCAAGAGGTTCAGTTAACACCC(序列6)
序列8：TGTATGATGTTCCAGGCGAA(序列8)
序列10：AGTTCCATTTCAAGGTGGGA(序列10)
序列12：TAACAATCACTTGGCGAGGG(序列12)
序列14：GCTGACAAGTGATGATTCTACCA(序列14)
序列16：GGGTATAGTAAATATCATGTGTTGCG(序列16)
序列18：AACTAAATGCACTAATCATGGAAA(序列18)
序列20：CGGCTTTCCTCCTCTCTTTC(序列20)
序列22：GCTTGTCGCTTAGCTTAACCAT(序列22)
序列24：GGTGCTAGCAACATCATCAAA(序列24)
序列26：GGAAGTGTTGGGAATTAGTAGAGC(序列26)
序列28：ACGTCATCAATGGCATCAAA(序列28)
序列30：CACCACGAATAAGCTAGTTACAAA(序列30)
序列32：AAATGGTAGCTGCGAGGAGA(序列32)
序列34：TATGCCAATGCTTCTTGTGG(序列34)
序列36：TTGTGATGTTGTAATCCTGTTGG(序列36)
序列38：CGAAAGAGACAGTCGCAAGA(序列38)
序列40：TATTTCCATTGGCCGTGTCT(序列40)
序列42：AGTCGAAGTTCAAACAGTTGGT(序列42)
序列44：GTCATTGTCTGTGCATGGCT(序列44)
序列46：AAGAGCACCTCTTGAGACTATTAAA(序列46)
序列48：GATGGACAAGAGTGGCCTTT(序列48)。
本发明的另一目的在于提供一种烤烟SSR核心引物组合的构建方法，包括：
步骤一、采用CTAB方法提取烤烟种质基因组DNA；
步骤二、利用已经公布的2317对引物在5份材料中进行PCR扩增，初步筛选出70对核心引物，在20份代表烟草种质进行进一步PCR扩增，利用20份烤烟种质对获得的初筛获得的引物进行复筛和验证，最终确定烤烟SSR核心引物。
所述初步筛选获得的70对SSR标记为：
本发明的另一目的在于提供一种烤烟SSR核心引物组合的应用方法，包括：
步骤一、采用CTAB方法提取96份烤烟种质基因组DNA；
步骤二、利用确定的核心SSR引物组合对96份烤烟种质进行基因型分析，研究其不同品种间的遗传多样性及亲缘关系，验证核心引物效果。
本发明获得的SSR核心引物组合具有多态性高、扩增稳定、操作简单等优点。筛选出的SSR组合可以直接利用，改变了通常使用SSR引物时需要进行大量筛选的过程，大大提高了筛选效率，利用该核心引物可以有效评价不同烤烟材料间的遗传多样性和亲缘关系，有助于提高烤烟育种效率。
附图说明
图1是本发明实施例提供的基于核心引物验证材料的聚类分析图；
图2是本发明实施例提供的核心引物对验证材料进行主坐标分析的散点图。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。
请参阅图1：
一种烤烟SSR核心引物组合由以下24对引物组成：
PT52573，SEQ ID NO：1，其由序列表中序列1所示的DNA碱基和序列2所示的DNA碱基组成；
PT60795，SEQ ID NO：2，其由序列表中序列3所示的DNA碱基和序列4所示的DNA碱基组成；
PT53936，SEQ ID NO：3，其由序列表中序列5所示的DNA碱基和序列6所示的DNA碱基组成；
PT60629，SEQ ID NO：4，其由序列表中序列7所示的DNA碱基和序列8所示的DNA碱基组成；
PT50244，SEQ ID NO：5，其由序列表中序列9所示的DNA碱基和序列10所示的DNA碱基组成；
PT60698，SEQ ID NO：6，其由序列表中序列11所示的DNA碱基和序列12所示的DNA碱基组成；
PT60038，SEQ IDNO：7，其由序列表中序列13所示的DNA碱基和序列14所示的DNA碱基组成；
PT60435，SEQ ID NO：8，其由序列表中序列15所示的DNA碱基和序列16所示的DNA碱基组成；
PT50501，SEQ ID NO：9，其由序列表中序列17所示的DNA碱基和序列18所示的DNA碱基组成；
PT50176，SEQ ID NO：10，其由序列表中序列19所示的DNA碱基和序列20所示的DNA碱基组成；
PT51144，SEQ ID NO：11，其由序列表中序列21所示的DNA碱基和序列22所示的DNA碱基组成；
PT30046，SEQ ID NO：12，其由序列表中序列23所示的DNA碱基和序列24所示的DNA碱基组成；
PT61010，SEQ ID NO：13，其由序列表中序列25所示的DNA碱基和序列26所示的DNA碱基组成；
PT53568，SEQ ID NO：14，其由序列表中序列27所示的DNA碱基和序列28所示的DNA碱基组成；
PT51975，SEQ ID NO：15，其由序列表中序列29所示的DNA碱基和序列30所示的DNA碱基组成；
PT30272，SEQ ID NO：16其由序列表中序列31所示的DNA碱基和序列32所示的DNA碱基组成；
PT30302，SEQ ID NO：17，其由序列表中序列33所示的DNA碱基和序列34所示的DNA碱基组成；
PT50693，SEQ ID NO：18，其由序列表中序列35所示的DNA碱基和序列36所示的DNA碱基组成；
PT53384，SEQ ID NO：19，其由序列表中序列37所示的DNA碱基和序列38所示的DNA碱基组成；
PT53519，SEQ ID NO：20，其由序列表中序列39所示的DNA碱基和序列40所示的DNA碱基组成；
PT50298，SEQ ID NO：21，其由序列表中序列41所示的DNA碱基和序列42所示的DNA碱基组成；
PT54196，SEQ ID NO：22，其由序列表中序列43所示的DNA碱基和序列44所示的DNA碱基组成；
PT50472，SEQ ID NO：23，其由序列表中序列45所示的DNA碱基和序列46所示的DNA碱基组成；
PT30132，SEQ ID NO：24，其由序列表中序列47所示的DNA碱基和序列48所示的DNA碱基组成；
序列表如下：
序列1：TGATCCGTTTGGAGAAGTCA：
序列3：ATGAAACTTTCGCATGGCTC
序列5：CTTGTACCATCTCAAATGACCC
序列7：TGCACTCACAGACGAACACA(序列7)
序列9：CAATGATGGAAATGAAATCCAA(序列9)
序列11：CTTGTTCCTCTCACATCGGG(序列11)
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序列27：CGTTTCTCTTCCAATTAACAGC(序列27)
序列29：CCACAAACTATCTGGTGTCCC(序列29)
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序列33：CCTTCCTAACCTCAGCTGGAA(序列33)
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序列37：CAACCGCAAGAGATCCTTCT(序列37)
序列39：GCTTGGCATCATCAGAATTT(序列39)
序列41：CCACAGCATGTAGACAACGG(序列41)
序列43：CCTATGTTTGGAGCAGAGGG(序列43)
序列45：TCCAACACAGAATATTTATACGAAGG(序列45)
序列47：CCTAACAGCATTTGCTACCCA(序列47)
序列2：GGCGAAATTAGAAATTGTATCTCAA(序列2)
序列4：GCCAGCCAGGTGACAATAAT(序列4)
序列6：GCAAGAGGTTCAGTTAACACCC(序列6)
序列8：TGTATGATGTTCCAGGCGAA(序列8)
序列10：AGTTCCATTTCAAGGTGGGA(序列10)
序列12：TAACAATCACTTGGCGAGGG(序列12)
序列14：GCTGACAAGTGATGATTCTACCA(序列14)
序列16：GGGTATAGTAAATATCATGTGTTGCG(序列16)
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序列22：GCTTGTCGCTTAGCTTAACCAT(序列22)
序列24：GGTGCTAGCAACATCATCAAA(序列24)
序列26：GGAAGTGTTGGGAATTAGTAGAGC(序列26)
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序列30：CACCACGAATAAGCTAGTTACAAA(序列30)
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序列46：AAGAGCACCTCTTGAGACTATTAAA(序列46)
序列48：GATGGACAAGAGTGGCCTTT(序列48)。
本发明的另一目的在于提供一种烤烟SSR核心引物组合的构建方法，包括：
步骤一、采用CTAB方法提取烤烟种质基因组DNA；
步骤二、利用已经公布的2317对引物在5份材料中进行PCR扩增，初步筛选出70对核心引物，在20份代表烟草种质进行进一步PCR扩增，利用20份烤烟种质对获得的初筛获得的引物进行复筛和验证，最终确定烤烟SSR核心引物。
本发明的另一目的在于提供一种烤烟SSR核心引物组合的应用方法，包括：
步骤一、采用CTAB方法提取96份烤烟种质基因组DNA；
步骤二、利用确定的核心SSR引物组合对96份烤烟种质进行基因型分析，研究其不同品种间的遗传多样性及亲缘关系，验证核心引物效果。
实施例1
1材料与方法
1.1试验材料
供试材料为我国烤烟育种过程中常用的且表型性状差异较大的5份烟草种质包括3份中国种质净叶黄、小黄金1025、革新3号和2份美国引进种质NC82、Speight G-140。20份不同地理来源的烤烟种质见表1。所有材料均由中国农业科学院烟草研究所国家烟草种质资源中期库提供。
1.2试验方法
1.2.1DNA提取
材料均在中国农业科学院烟草研究所试验基地温室种植，每份材料随机选取10株混合取样，采用CTAB法提取DNA，并用紫外分光光度计检测DNA纯度和浓度，统一稀释到50ng·μL-1后，-20℃保存备用。
1.2.2PCR扩增及电泳检测
扩增体系为10μL，含50ng·μL-1模板DNA 1μL、10mol·L-1dNTPs 0.2μL、50ng·μL-1引物1μL、5U Taq Polymerase 0.2μL、10×buffer 1μL。使用Gene Amp PCR System 9700进行扩增，反应条件为94℃ 3min；94℃ 30s，52℃(根据引物退火温度调整)退火30s，72℃1min，共35次循环；72℃延伸7min，12℃保存。使用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增产物，银染观察并记录数据。
1.2.3核心引物的筛选
利用5份烤烟育种常用种质对已公布的2317对SSR引物进行初步筛选，随后利用20份不同地理来源的烤烟种质对初筛出来的引物进一步筛选，以稳定性好、条带清晰、易于统计、多态性信息量(PIC)较高并均匀分布在24条连锁群上为标准，确定核心引物。
1.2.4核心引物的验证
利用软件NTSYS-pc 2.11，采用类平均法(UPGMA)，利用筛选出的SSR核心引物对20份烤烟主要亲本进行聚类分析和主坐标(PCoA)分析，验证核心引物的有效性。
1.2.5数据处理与统计分析
以0、1、9统计SSR引物扩增带型，在相同迁移率位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，缺失记为“9”，并建立相应的数据库。利用DataFormater软件将原始数据转换。利用软件PowerMarker 3.25进行遗传多样性分析[16]。其中Simpson’s多样性指数也称位点多态性信息量(PIC)的计算方法为；基因型多样性H′＝-∑PilnPi，Pi为第i个等位基因变异出现的频率。
表1用于核心SSR引物筛选的20份供试烟草种质及其地理来源
2结果与分析
2.1SSR核心引物的筛选
用5份表型和遗传差异较大的主要烤烟亲本对2317对核心引物进行初步筛选，从中筛选到70对多态性较好、带型清晰的引物，占引物总数的3.02％。随后，采用20份不同地理来源的烤烟种质对70对初筛导到的引物进行复筛，最终确定24对SSR核心引物，占复筛引物的34.29％，占总引物的1.04％。
2.2SSR引物的多态性信息
最终确定的24对SSR核心引物分布在烟草22条连锁群上(表2)，除21号和24号连锁群以外，其余连锁群上均有分布，其中3号和23号连锁群上分布2对，其余连锁群各分布1对。24对SSR标记在20份烤烟种质中共检测出85个等位变异，引物的等位位点数为2-5个，平均为3.54，其中引物PT53936和引物PT50693的等位变异最多为5个。每个引物标记的基因型多样性为0.19-0.77，平均为0.58；引物多态性信量(PIC)为0.18-0.73，平均为0.52(表3)
表2烤烟核心SSR引物组合
表3核心引物在参试种质中的多态性信息
2.3核心引物的有效性验证
2.3.1核心引物聚类分析
根据遗传相似系数，利用UPGMA方法对20份烤烟种质(编号1-20)进行聚类分析。如图1所示，当遗传相似系数在0.52取值做切割线时，可将20份种质明显分为2个类群，一类为美国种质和中国台湾种质(编号1-10)，另一类为中国大陆种质(编号11-20)。第1类群又可分为3个亚群，第1亚群包括Coker319(1)和3份中国台烟种质T.T.8(8)、T.T.9(10)、T.T.10(9)，虽然中国台湾来源的烟草种质系谱尚不清楚，但从本研究来看，可初步确定其与美国种质有较近的亲缘关系；第2亚群包括FC8(2)、K326(3)、RG8(6)和Speight G-28(7)四份种质，其中RG8和FC8都由K326育成，而K326和Speight G-28都是由Hicks间接育成；NC89(4)和NC567(5)为第3类群，两份种质都由NC2326直接或间接育成，类群划分符合种质系谱关系。第2类群也可分为3个亚群，第1亚群为单育2号(12)、金星6007(13)、中烟14(17)和中烟15(18)等4份种质，它们都直接或间接来源于地方种质滕县金星；第2亚群有CF-90-NF(11)和中烟86(19)，这两份种质的遗传背景中有两个共同的亲本净叶黄和Speight G-28；第3亚群的净叶黄(14)、潘圆黄(15)、长脖黄(16)和中烟98(20)4份种质都具有长脖黄的背景。
2.3.2主坐标分析(PCoA)
前两个主坐标可以解释的方差贡献率为46.06％，其中第一个可以解释的方差贡献率为34.59％。如图2所示，20份种质可以明显的分为2类。第1类群有7份美国种质(1-7)和3份中国台湾种质(8-10)；第2类群为10份中国大陆种质(11-20)。第1类群又可分为3个亚群，第1亚群包括Coker319(1)和3份中国台湾种质(8-10)；第2亚群有FC8(2)、K326(3)、RG8(6)和Speight G-28(7)共4份种质；第3亚群为NC567(5)和NC89(4)。第2类群也可分为3个亚群，第1亚群包括亲缘关系较近的单育2号(12)、金星6007(13)、中烟14(17)和中烟15(18)共4份种质；第2亚群为CF-90-NF(11)和中烟86(19)；第3亚群有长脖黄(16)及其直接或间接育成品种净叶黄(14)、潘圆黄(15)、中烟98(20)。主坐标分析结果与聚类分析结果一致，说明该套核心引物适用于烤烟种质的遗传多样性分析。
本发明获得的SSR核心引物组合具有多态性高、扩增稳定、操作简单等优点。筛选出的SSR组合可以直接利用，改变了通常使用SSR引物时需要进行大量筛选的过程，大大提高了筛选效率，利用该核心引物可以有效评价不同烤烟材料间的遗传多样性和亲缘关系，有助于提高烤烟育种效率。
以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (3)
1.一种烤烟SSR核心引物组合，其特征在于，所述的烤烟SSR核心引物组合由以下24对引物组成：
PT52573，SEQ ID NO：1，其由序列表中序列1所示的DNA碱基和序列2所示的DNA碱基组成；
PT60795，SEQ ID NO：2，其由序列表中序列3所示的DNA碱基和序列4所示的DNA碱基组成；
PT53936，SEQ ID NO：3，其由序列表中序列5所示的DNA碱基和序列6所示的DNA碱基组成；
PT60629，SEQ ID NO：4，其由序列表中序列7所示的DNA碱基和序列8所示的DNA碱基组成；
PT50244，SEQ ID NO：5，其由序列表中序列9所示的DNA碱基和序列10所示的DNA碱基组成；
PT60698，SEQ ID NO：6，其由序列表中序列11所示的DNA碱基和序列12所示的DNA碱基组成；
PT60038，SEQ ID NO：7，其由序列表中序列13所示的DNA碱基和序列14所示的DNA碱基组成；
PT60435，SEQ ID NO：8，其由序列表中序列15所示的DNA碱基和序列16所示的DNA碱基组成；
PT50501，SEQ ID NO：9，其由序列表中序列17所示的DNA碱基和序列18所示的DNA碱基组成；
PT50176，SEQ ID NO：10，其由序列表中序列19所示的DNA碱基和序列20所示的DNA碱基组成；
PT51144，SEQ ID NO：11，其由序列表中序列21所示的DNA碱基和序列22所示的DNA碱基组成；
PT30046，SEQ ID NO：12，其由序列表中序列23所示的DNA碱基和序列24所示的DNA碱基组成；
PT61010，SEQ ID NO：13，其由序列表中序列25所示的DNA碱基和序列26所示的DNA碱基组成；
PT53568，SEQ ID NO：14，其由序列表中序列27所示的DNA碱基和序列28所示的DNA碱基组成；
PT51975，SEQ ID NO：15，其由序列表中序列29所示的DNA碱基和序列30所示的DNA碱基组成；
PT30272，SEQ ID NO：16其由序列表中序列31所示的DNA碱基和序列32所示的DNA碱基组成；
PT30302，SEQ ID NO：17，其由序列表中序列33所示的DNA碱基和序列34所示的DNA碱基组成；
PT50693，SEQ ID NO：18，其由序列表中序列35所示的DNA碱基和序列36所示的DNA碱基组成；
PT53384，SEQ ID NO：19，其由序列表中序列37所示的DNA碱基和序列38所示的DNA碱基组成；
PT53519，SEQ ID NO：20，其由序列表中序列39所示的DNA碱基和序列40所示的DNA碱基组成；
PT50298，SEQ ID NO：21，其由序列表中序列41所示的DNA碱基和序列42所示的DNA碱基组成；
PT54196，SEQ ID NO：22，其由序列表中序列43所示的DNA碱基和序列44所示的DNA碱基组成；
PT50472，SEQ ID NO：23，其由序列表中序列45所示的DNA碱基和序列46所示的DNA碱基组成；
PT30132，SEQ ID NO：24，其由序列表中序列47所示的DNA碱基和序列48所示的DNA碱基组成；
所述序列表如下：
序列1：TGATCCGTTTGGAGAAGTCA
序列3：ATGAAACTTTCGCATGGCTC
序列5：CTTGTACCATCTCAAATGACCC
序列7：TGCACTCACAGACGAACACA
序列9：CAATGATGGAAATGAAATCCAA
序列11：CTTGTTCCTCTCACATCGGG
序列13：CATCACCTTTCTCATTTCCACA
序列15：AACCGAAACAAGGGAACAGA
序列17：ATGAAGGCTCCATCAACGAC
序列19：TGTCATGTTAGCATTCTTTGGC
序列21：ACCGACAACACACGATTGTA
序列23：GATAGGTAGATTATCCTCTGCAACA
序列25：TCAATTCCCTTCTGCCTTTG
序列27：CGTTTCTCTTCCAATTAACAGC
序列29：CCACAAACTATCTGGTGTCCC
序列31：GAACCTAACCTCGCTCCACA
序列33：CCTTCCTAACCTCAGCTGGAA
序列35：TCATGAGAGGCAGACAGTGTT
序列37：CAACCGCAAGAGATCCTTCT
序列39：GCTTGGCATCATCAGAATTT
序列41：CCACAGCATGTAGACAACGG
序列43：CCTATGTTTGGAGCAGAGGG
序列45：TCCAACACAGAATATTTATACGAAGG
序列47：CCTAACAGCATTTGCTACCCA
序列2：GGCGAAATTAGAAATTGTATCTCAA
序列4：GCCAGCCAGGTGACAATAAT
序列6：GCAAGAGGTTCAGTTAACACCC
序列8：TGTATGATGTTCCAGGCGAA
序列10：AGTTCCATTTCAAGGTGGGA
序列12：TAACAATCACTTGGCGAGGG
序列14：GCTGACAAGTGATGATTCTACCA
序列16：GGGTATAGTAAATATCATGTGTTGCG
序列18：AACTAAATGCACTAATCATGGAAA
序列20：CGGCTTTCCTCCTCTCTTTC
序列22：GCTTGTCGCTTAGCTTAACCAT
序列24：GGTGCTAGCAACATCATCAAA
序列26：GGAAGTGTTGGGAATTAGTAGAGC
序列28：ACGTCATCAATGGCATCAAA
序列30：CACCACGAATAAGCTAGTTACAAA
序列32：AAATGGTAGCTGCGAGGAGA
序列34：TATGCCAATGCTTCTTGTGG
序列36：TTGTGATGTTGTAATCCTGTTGG
序列38：CGAAAGAGACAGTCGCAAGA
序列40：TATTTCCATTGGCCGTGTCT
序列42：AGTCGAAGTTCAAACAGTTGGT
序列44：GTCATTGTCTGTGCATGGCT
序列46：AAGAGCACCTCTTGAGACTATTAAA
序列48：GATGGACAAGAGTGGCCTTT。
2.一种烤烟SSR核心引物组合的构建方法，其特征在于，该方法包括：
步骤一、采用CTAB方法提取烤烟种质基因组DNA；
步骤二、利用已经公布的2317对引物在中国种质净叶黄、小黄金1025、革新3号和2份美国引进种质NC82、Speight G-140中进行PCR扩增，初步筛选出70对核心引物，初步筛选出的70对核心引物，在20份代表烟草种质进行进一步PCR扩增，利用20份烤烟种质对获得的初筛获得的引物进行复筛和验证，最终确定烤烟SSR核心引物；
所述初步筛选获得的70对SSR核记为：
3.一种烤烟SSR核心引物组合的应用方法，其特征在于，该方法包括：
步骤一、采用CTAB方法提取20份烤烟种质基因组DNA；
步骤二、利用确定的核心SSR引物组合对20份烤烟种质进行基因型分析；以0、1、9统计SSR引物扩增带型，在相同迁移率位置上，有带记为1，无带记为0，缺失记为9，并建立相应的数据库；利用DataFormater软件将原始数据转换；利用软件PowerMarker 3.25进行遗传多样性分析；其中Simpson’s多样性指数也称位点多态性信息量的计算方法为PIC＝1-∑Pi2；基因型多样性H′＝-∑PilnPi，Pi为第i个等位基因变异出出现的频率；
步骤三、核心引物效果验证；
不同品种间的遗传多样性及亲缘关系，验证核心引物效果；利用的方法和步骤为：利用软件NTSYS-pc 2.11，采用类平均法，利用筛选出的SSR核心引物对20份烤烟主要亲本进行聚类分析和主坐标分析，验证核心引物的有效性。
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| CN103451296A (zh) * | 2013-09-06 | 2013-12-18 | 红云红河烟草(集团)有限责任公司 | 一种应用ssr分子标记技术鉴定商品卷烟的方法 |
| CN105002158A (zh) * | 2015-05-06 | 2015-10-28 | 中国农业科学院烟草研究所 | 一种野生烟草ssr指纹图谱及其构建方法和应用 |
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