CN108676909B - 一种用于雪茄烟草鉴定的引物对和试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于雪茄烟草鉴定的引物对和试剂盒及应用，属于分子生物学DNA标记技术与应用领域。本发明所述筛选方法包括以下步骤：以烟草基因组DNA作为模板DNA；以已公布的公共SSR标记为待筛选引物，将待筛选引物与模板DNA进行PCR扩增，得PCR产物；对得到的PCR产物进行检测，能观察到目标片段的作为SSR引物。本发明获得的SSR核心引物具有多态性高、稳定性好、易于操作推广、分布均匀等优点，可直接利用，大大提高了筛选效率，为以后雪茄烟资源遗传多样性分析、亲缘关系鉴定和育种工作提供有力技术支撑，对雪茄烟研究工作有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及一种用于雪茄烟草鉴定的引物对和试剂盒及应用。
背景技术
雪茄烟劲头大、香气浓郁，吃味浓，同时焦油与烟碱比值小，近年来在国内外市场需求日益增长，产业前景广阔。我国雪茄烟草研究工作起步晚，基础研究落后，目前种植的品种绝大部分为国外品种。受种植条件及栽培措施的限制，烟叶品质与国外优质雪茄烟叶还存在很大差距，不能满足烟草工业公司对烟叶原料的需求。因此，构建雪茄烟草核心引物来分析雪茄烟草亲缘关系及遗传多样性，对加快我国雪茄烟草育种工作的理论研究，推进我国雪茄烟草育种工作的顺利进行意义重大。
目前，分子标记技术已被广泛应用于作物遗传多样性分析及亲缘关系鉴定。烟草前期研究多采用第二代分子标记，如随机引物多态性标记(RAPD)、扩增片段长度多态性标记(AFLP)、相关序列扩增多态性(SRAP)、核糖体DNA和简单序列重复(ISSR)等。而与其它第二代分子标记相比，SSR标记稳定性高、位点特异性强、多态性高，适用于分子标记辅助选择育种、遗传多样性分析和亲缘关系分析等工作。2011年，Bindler等在前期工作基础上完成了烟草第一张高密度SSR遗传图谱，共定位了2317个SSR标记和2363个位点。Xia等利用28对SSR标记对我国78份烟草栽培品种进行遗传多样性分析和群体结构预测，结果表明78个栽培品种遗传基础相对狭窄，不利于烟草育种的发展。Fricano等利用49对SSR标记对312份烟草资源进行遗传多样性分析，将312份资源分成6大类群，并进行了系统的遗传结构和遗传距离的分析。张雪廷等对38份国内外晾晒烟资源进行了详细的遗传多样性分析和亲缘关系鉴定，发现晾晒烟资源遗传多样性高，遗传背景差异较大，亲缘关系较远。杨柳等对25份烟草种质资源通过14对SSR标记，详细分析了遗传多样性和品种间的亲缘关系。
目前，烟草已经有超过5000多对SSR公共标记，如何高效率的利用这些标记进行雪茄烟遗传多样性分析和育种是一个亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于雪茄烟草鉴定的SSR引物的筛选方法，并用此方法高效地对雪茄烟资源进化、遗传多样性及亲缘关系进行分析，为雪茄烟品种审定奠定理论基础，有效提高雪茄烟育种进程。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种雪茄烟草鉴定用SSR引物的筛选方法，包括以下步骤：以烟草基因组DNA作为模板DNA；以已公布的公共SSR标记为待筛选引物，将待筛选引物与模板DNA进行PCR扩增，得PCR产物；对得到的PCR产物进行检测，能观察到目标片段的作为鉴定雪茄烟草用SSR引物；所述目标片段长度为190～220bp。
优选的，所述模板DNA的浓度为40～80ng/μL。
优选的，所述PCR扩增的体系包括：Dreamtaq Mix 10μL，模板DNA 1μL，引物对的上、下游引物各1μL，双蒸水补至20μL。
优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性45s，退火温度60℃延伸30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，10℃恒温冷却。
本发明提供了一种用于雪茄烟草鉴定的试剂盒，包括Dreamtaq Mix和利用上述技术方案所述筛选方法筛选得到的鉴定雪茄烟草用SSR引物对。
优选的，所述鉴定雪茄烟草用SSR引物对包括如SEQ ID NO.1～96所示引物对中的一对或多对。
本发明提供了一种上述试剂盒在雪茄烟草品种鉴定中的应用。
本发明提供了一种上述试剂盒在雪茄烟草遗传学分析中的应用。
本发明提供了一种雪茄烟草鉴定用SSR引物的筛选方法，筛选方法简单，多态性高、稳定性好、易于操作推广、分布均匀等优点。筛选得到的雪茄烟草SSR核心引物具有稳定性好、多态性高、分布均匀、操作简单等优点。筛选得到的SSR核心引物可以直接用于以后对雪茄烟资源的遗传分析，改变了雪茄烟育种理论研究存在的盲目性，提高了雪茄烟育种进程；还可以有效对雪茄烟不同资源见的遗传多样性和亲缘关系做出评价，大大提高雪茄烟理论研究效率。
附图说明
图1为本发明实施例提供的雪茄烟SSR核心引物筛选图；
图2为本发明实施例提供的核心引物验证材料的聚类分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种雪茄烟草鉴定用SSR引物的筛选方法，包括以下步骤：以烟草基因组DNA作为模板DNA；以已公布的公共SSR标记为待筛选引物，将待筛选引物与模板DNA进行PCR扩增，得PCR产物；对得到的PCR产物进行检测，能观察到目标片段的作为鉴定雪茄烟草用SSR引物；所述目标片段长度为190～220bp。
本发明的所述筛选方法以烟草基因组DNA为模板DNA。本发明对所述基因组DNA的提取方法并没有特殊限定，优选采用CTAB法提取。本发明提取基因组DNA后优选的去除RNA污染，具体包括：TE溶解基因组DNA，加入RNA酶水浴30min。本发明所述模板DNA浓度优选为40～80ng/μL，更优选为45～60ng/μL，最优选为50ng/μL。
得到模板DNA后，本发明以已公布的公共SSR标记为待筛选引物，将待筛选引物与模板DNA进行PCR扩增，得PCR产物。本发明所述公共SSR标记优选为已开发的烟草SSR标记，本发明实施例中选择998对公共SSR标记的引物对。本发明对所述公共SSR标记的引物对来源并没有特殊限定，优选的来源于公司合成。本发明所述PCR扩增的体系优选包括：Dreamtaq Mix 10μL，模板DNA 1μL，引物对的上、下游引物各1μL，双蒸水补至20μL。本发明所述PCR扩增的程序优选为：95℃预变性5min；95℃变性45s，退火温度60℃延伸30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，10℃恒温冷却。
本发明对得到的PCR产物进行检测，能观察到目标片段的作为鉴定雪茄烟草用SSR引物。本发明对所述检测的方法并没有特殊限定，优选采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。本发明所述目标片段的长度优选为190～220bp。
本发明还提供了一种用于雪茄烟草鉴定的试剂盒，包括Dreamtaq Mix和利用上述技术方案所述筛选方法筛选得到的鉴定雪茄烟草用SSR引物对。本发明对所述DreamtaqMix的来源及浓度并没有特殊限定。本发明所述筛选得到的鉴定雪茄烟草用SSR引物对优选包括如SEQ ID NO.1～96所示引物对中的一对或多对，具体如表1所示：
表1.筛选得到的雪茄烟草SSR引物对名称及序列
本发明还提供了一种上述试剂盒在雪茄烟草品种鉴定中的应用。
优选的，所述雪茄烟草品种鉴定包括以下步骤：以上述试剂盒对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，将获得的多态性扩增条带与已有的雪茄烟品种条带进行比对，若SSR标记引物存在两对及两对以上多态性扩增差异，则判定待测样品为新雪茄烟品种资源；若存在两对以下多态性扩增差异，则判定所述待测样品为已有雪茄烟品种资源，品种鉴定不合格。
更优选的，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性45s，退火温度60℃延伸30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，10℃恒温冷却。
本发明还提供了一种上述试剂盒在雪茄烟草遗传学分析中的应用。
优选的，所述雪茄烟草遗传学分析包括以下步骤：以上述试剂盒对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，将得到的PCR产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；选择带型清晰的PCR扩增条带进行人工读带，有条带记为“1”，无条带记为“0”，建立“0/1”矩阵，使用DataFormater软件进行矩阵的转换。
用Popgene32软件计算：观察等位基因数No(observed number of alleles)，有效等位基因Ne(effective number of alleles)，Nei’s基因多样性指数H(Nei’s genediversity)，Shannon’s多态信息指数I(Shannon’s information index)以及品种间成对Nei’s遗传距离(Nei’s genetic distance)。
通过对不同样品量或引物数处理得到Nei’s遗传距离，使用统计软件NTSYS-PCver2.1分析供试样品间遗传相似系数，采用非加权配对算术平均数法(UPGMA，unweightedpair group method with arithmetic mean)进行聚类分析，绘制聚类分析树状图。
下面结合实施例对本发明提供的雪茄烟草鉴定的引物对和试剂盒及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
利用由中国农业科学院烟草研究所国家种质资源中期库和海南雪茄研究所提供的，雪茄烟生产国常用5个栽培品种：H211(中国)、Beinhart 1000-1(美国)、Little Dutch(美国)、Havana 10(古巴)、H382(印度尼西亚)和Hicks(SSR标记阳性对照)以及20份不同地理来源的雪茄烟资源(如表2所示)进行雪茄烟草SSR引物对的筛选：
表2.雪茄烟资源名称及来源地
在供试样品资源5片真叶期时随机选取10株混合取样，采用CTAB法提取基因组DNA，TE溶解DNA，加入RNA酶水浴30min。经核酸测定仪(NanoProp 2000 Thermoscientific)测定DNA的质量与浓度，将DNA浓度统一稀释到50ng/μL，在-20℃低温下长期保存；
委托六合华大(北京)基因科技有限公司合成998对已公布的公共SSR标记；
配制扩增体系：在PCR反应管中依次加入Dreamtaq Mix 10μL、模板DNA 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL，最后用双蒸水将反应体系补至20μL；
PCR扩增：反应程序为95℃预变性5min；95℃变性45s，退火温度60℃延伸30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，10℃恒温冷却。
取出PCR反应管，对扩增产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
利用6份雪茄烟资源对998对公共SSR标记进行初步筛选，雪茄烟各染色体引物多态率如表3所示：
表3.雪茄烟各染色体引物多态率
由上述可知，初步筛选得到的多态性引物共有437对，占总数的43.79％，表明烟草公共标记在5份雪茄烟资源中多态率较高；第13号染色体多态率最高，达78.95％；通过筛选得到96对多态性高、稳定性好、扩增方便、各染色体分布均匀的SSR，占引物总数的9.6％；随后利用20份雪茄烟资源进行进一步筛选，共得到48对如表1所示的雪茄烟草SSR引物，占总引物的4.80％，各引物对的染色体位置如表4所示：
表4.筛选得到的雪茄烟草SSR引物的染色体位置
最终确定的48对筛选得到的雪茄烟草SSR引物分布在24条染色体上，每条染色体各2对引物。
实施例2
选择带型清晰的PCR扩增条带进行人工读带，有条带记为“1”，无条带记为“0”，建立“0/1”矩阵，使用DataFormater软件进行矩阵的转换。用Popgene32软件计算：观察等位基因数Na(observed number of alleles)，有效等位基因Ne(effective number ofalleles)，Nei’s基因多样性指数H(Nei's gene diversity)，Shannon’s多态信息指数I(Shannon’s information index)以及品种间成对Nei’s遗传距离(Nei’s geneticdistance)，结果如表5所示：
表5.雪茄烟草SSR引物在供试雪茄烟资源中的多态性信息
结果显示：48对SSR标记在20份雪茄烟资源遗传多样性结果显示观测等位基因数在2～9之间，平均值为4.02，引物PT52689等位基因数最多为7个。有效等位基因数在1.02～6.45之间，平均值为2.85，引物PT52689有效等位基因数最多为6.45，引物PT51059有效等位基因数最少为1.02。Shannon信息指数在0.10～2.01之间，平均值为1.09。多样性指数在0.06～0.85之间，平均值为0.58。
试验例
1、利用筛选得到的雪茄烟草SSR引物对20个供试雪茄烟资源进行引物的有效性验证：
具体的PCR扩增体系及扩增程序与实施例相同，其中一对引物具体结果如图1所示，在20个供试雪茄烟资源中都能检测到雪茄烟草SSR引物PT30163的多态性扩增条带。
2、利用软件NTSYS-PCver 2.1分析20个供试雪茄烟资源间遗传相似系数，采用非加权配对算术平均数法(UPGMA，unweighted pair grooup method with arithmeticmean)进行聚类分析，绘制聚类分析树状图，研究不同来源雪茄烟资源间的亲缘关系，验证筛选得到的雪茄烟草SSR引物的有效性和应用性：
根据表4所示的遗传多样性分析结果进行统计分析，绘制0/1二维矩阵，使用NTSYS-pc(2.10e)计算20个供试雪茄烟资源之间的遗传相似性系数和遗传距离指数。结果表明，各晒烟资源间的遗传相似性系数在0.149～1.000之间。
为研究筛选得到的雪茄烟草SSR引物的有效性和应用性，对明确不同地理来源的供试雪茄烟资源进行亲缘关系分析，利用48对雪茄烟草SSR引物按照非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析结果如图2。在相似性系数0.299可将雪茄烟资源分为两个类群，Havana10(17)、H211(18)、Criollo Salteno 11(19)和Havana IIc(20)3个古巴资源加一个中国雪茄烟资源为一个小类群，推测H211(18)可能为中国从古巴引种资源，H211(18)与Criollo Salteno 11(19)亲缘关系很近，可能为姊妹系资源。古引3号(9)、古引4号(10)和古引5号(11)亲缘关系一致，根据来源地和名称可以认定这三个资源为同一份雪茄烟资源，田间表型也印证了分子鉴定结果。同样的，巴西1号(14)、巴西2号(15)和巴西5号(16)亲缘关系极为相近，认定为同一份资源或者姊妹系资源。
综上所述，本发明获得的雪茄烟草SSR引物具有多态性高、稳定性好、易于操作推广、分布均匀等优点。筛选出的48对雪茄烟SSR引物可以直接利用，改变了通常使用SSR引物时耗时、费力、费钱的难点，大大提高了筛选效率，为以后雪茄烟资源遗传多样性分析、亲缘关系鉴定和育种工作提供有力技术支撑，对雪茄烟研究工作有重要意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院烟草研究所
中国烟草总公司海南省公司海口雪茄研究所
<120> 一种用于雪茄烟草鉴定的引物对和试剂盒及应用
<160> 96
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acccatttaa ttgccacgtc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
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<210> 42
<211> 18
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tagcagggaa gccgaaagta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
ccaagtagcg acgaggagaa 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgggaagagt gctaccttag taca 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
gcgatgtact cctaaagatg tcaa 24
Claims (3)
1.一种用于雪茄烟草鉴定的试剂盒，包括Dreamtaq Mix和鉴定雪茄烟草用SSR引物对；
所述鉴定雪茄烟草用SSR引物对由如SEQ ID NO.1~96所示的引物对组成。
2.权利要求1所述试剂盒在雪茄烟草品种鉴定中的应用。
3.权利要求1所述试剂盒在雪茄烟草遗传学分析中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810739029.XA CN108676909B (zh) | 2018-07-06 | 2018-07-06 | 一种用于雪茄烟草鉴定的引物对和试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810739029.XA CN108676909B (zh) | 2018-07-06 | 2018-07-06 | 一种用于雪茄烟草鉴定的引物对和试剂盒及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108676909A CN108676909A (zh) | 2018-10-19 |
| CN108676909B true CN108676909B (zh) | 2021-10-15 |
Family
ID=63813285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810739029.XA Active CN108676909B (zh) | 2018-07-06 | 2018-07-06 | 一种用于雪茄烟草鉴定的引物对和试剂盒及应用 |
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108676909B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2005243214A1 (en) * | 2004-04-29 | 2005-11-24 | U.S. Smokeless Tobacco Company Llc | Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof |
| CN103451296A (zh) * | 2013-09-06 | 2013-12-18 | 红云红河烟草(集团)有限责任公司 | 一种应用ssr分子标记技术鉴定商品卷烟的方法 |
| CN107541568A (zh) * | 2016-06-29 | 2018-01-05 | 中国农业科学院烟草研究所 | 一种烤烟ssr核心引物组合及其构建方法 |
-
2018
- 2018-07-06 CN CN201810739029.XA patent/CN108676909B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN107541568A (zh) * | 2016-06-29 | 2018-01-05 | 中国农业科学院烟草研究所 | 一种烤烟ssr核心引物组合及其构建方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Construction of a Genetic Linkage Map of Cigar Tobacco (Nicotiana tabacum L.) Based on SSR Markers and Comparative Studies;Zhijun TONG等;《Czech J. Genet. Plant Breed》;20180430;第54卷(第3期);第115-122页 * |
| 利用ISSR分子标记对25个烟草种质资源的遗传多样性分析;傅冰等;《安徽农业科学》;20080120(第03期);第898-901页 * |
| 同科植物SSR引物在烟草遗传差异分析中的应用研究;聂琼等;《中国烟草科学》;20110415(第02期);第52-56页 * |
| 基于SSR标记的雪茄烟种质资源指纹图谱库的构建及遗传多样性分析;王琰琰等;《作物学报》;20210131;第47卷(第7期);第1259-1274页 * |
| 烟草种质资源遗传多样性和应用潜力分析以及核心SSR引物筛选;尹国英;《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑（月刊）》;20131215(第12期);第1.6节，第4.1-4.2节 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108676909A (zh) | 2018-10-19 |
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