CN108330162B

CN108330162B - 一种利用SCoT分子标记分析草果遗传多样性的方法

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Publication number: CN108330162B
Application number: CN201710384534.2A
Authority: CN
Inventors: 卢丙越; 马孟莉; 王田涛; 孟衡玲; 雷恩; 苏一兰; 李春燕; 刘艳红; 张虹; 张薇; 袁盛勇
Original assignee: Honghe University
Current assignee: Honghe University
Priority date: 2017-05-26
Filing date: 2017-05-26
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2037-05-26
Also published as: CN108330162A

Abstract

本发明公开了一种利用SCoT分子标记分析草果遗传多样性的方法，其中，SCoT‑PCR反应体系如下：每25μL的反应体系中含有不含Mg²⁺的10×PCR buffer 3.0μL、Taq酶0.5U、Mg²⁺2.5mmol/L、dNTP 0.25mmol/L、引物0.5μmol/L和模板DNA 60ng；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：95℃预变性5min，95℃变性1min，48‑52℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。本发明对近危物种草果资源的保护及育种利用具有重要意义，进而提高山区草果种植农民的经济收入。

Description

一种利用SCoT分子标记分析草果遗传多样性的方法

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体地说，涉及一种利用SCoT分子标记分析草果遗传多样性的方法。

背景技术

草果(Amomum tsaoko Crevost et Lemaire)是姜科豆蔻属植物中一种多年生草本植物，不仅是我国食品加工业和轻工业的重要原料，而且是一种传统的中药材，有燥湿、健胃、祛痰、温中、顺气、抗疟等功能，还是大众的调料食品，国际、国内市场需求量大。草果对生长环境条件要求较高，一般生长在海拔800～1500m的北热带和中、南亚热带中低山区，年降雨量在1200～1600mm，年平均气温在16～22℃，冬季多雾、湿度大、透光度在40％～50％的阴湿山坡沟谷森林环境下，主要分布在我国云南、广西和贵州三省局部地区，其中云南是草果主产区，产量约占全国的95％，主要分布在红河、文山、西双版纳、德宏、保山、思茅、临沧7个地(州)的31个县(市)。

分子标记是一种以DNA序列差异性为标记的检测遗传多样性的方法，具有不受外界环境及基因表达与否的影响，不影响实验材料的性状、可标记数量大及分辨率高等特点，目前被广泛应用于生物遗传研究。SCoT(目标起始密码子多态性，Start codon targetedpolymorphism)是Collard和Mackill于2009年在水稻上开发的新的目的基因分子标记方法。其原理是根据植物基因中ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性设计单引物，对基因组进行扩增，产生偏向候选功能基因区的显性多态性标记。SCoT标记具有操作简单，成本低，引物设计简单且可以通用，多态性丰富，能产生与性状联系的标记，目前已用于多种植物的遗传多样性分析。但在草果中，应用SCoT分子标记技术进行种质资源鉴定、遗传多样性分析的方法尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种简单、易于操作的分子标记技术，可为草果资源鉴定、遗传多样性分析等科学研究提供很好的技术指导和理论支持。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种用于草果遗传多样性分析的SCoT分子标记引物体系，所述引物序列包括：

SCoT2：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

SCoT7：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

SCoT11：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

SCoT13：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

SCoT15：其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

SCoT21：其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

SCoT29：其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

SCoT31：其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

SCoT32：其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

SCoT33：其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明还公开了一种用于草果遗传多样性分析的SCoT-PCR反应体系，每25μL的反应体系中含有不含Mg²⁺的10×PCR buffer 3.0μL、Taq酶0.5U、Mg²⁺2.5mmol/L、dNTP0.25mmol/L、引物0.5μmol/L和模板DNA 60ng；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：95℃预变性5min，95℃变性1min，48-52℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

进一步地，所述引物选自上述SEQ ID NO.1～10中的任一条。

进一步地，所述退火温度根据所选择的引物来确定，具体如下：

SEQ ID No.1 50℃

SEQ ID No.2 48℃

SEQ ID No.3 48℃

SEQ ID No.4 50℃

SEQ ID No.5 50℃

SEQ ID No.6 50℃

SEQ ID No.7 52℃

SEQ ID No.8 50℃

SEQ ID No.9 48℃

SEQ ID No.10 48℃。

本发明还公开了一种利用SCoT分子标记分析草果遗传多样性的方法，其步骤包括：

(1)采用2*CTAB法提取草果基因组DNA以备用；

(2)采用SCoT-PCR反应体系对步骤(1)中提取的DNA样品进行扩增；

(3)将PCR扩增产物在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳结束后银染检测条带；

(4)草果遗传多样性分析：利用10条SCoT分子标记将不同来源的草果进行聚类分析，并进行各遗传多样性参数的统计。

进一步地，步骤(1)采用2*CTAB法提取草果基因组DNA以备用具体为：采用2*CTAB法提取DNA，并将提取的DNA样品溶于TE缓冲液后存储于-20℃备用，扩增前用双蒸水将DNA样品稀释成20ng/μl的工作液，作为PCR扩增反应的模板。

进一步地，所述SCoT-PCR反应体系具体为：每25μL的反应体系中含有不含Mg²⁺的10×PCR buffer 3.0μL、Taq酶0.5U、Mg²⁺2.5mmol/L、dNTP 0.25mmol/L、引物0.5μmol/L和模板DNA 60ng；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：95℃预变性5min，95℃变性1min，48-52℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

进一步地，步骤(3)中将PCR扩增产物在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳结束后银染检测条带具体为：电泳结束后，将胶体从玻璃板上取下，蒸馏水漂洗，转入含有0.2％硝酸银的染色液中，振荡10min，蒸馏水漂洗1次1min，转入含2％氢氧化钠和0.4％甲醛的显色液中，轻轻振荡待条带显色完全，将胶体转入蒸馏水中；在凝胶成像系统下对胶体进行拍照保存。

进一步地，步骤(4)中利用10条SCoT分子标记将不同来源的草果进行聚类分析，并进行各遗传多样性参数的统计具体为：读取步骤(3)获得的谱带信息，将电泳图谱上100～2000bp范围内清晰且重复出现的条带记为1，同一位置没有条带记为0，由此生成0和1原始矩阵；统计每条引物扩增出的总条带数和多态性条带数；用NTSYS-pc(2.10e)软件中SimQual程序计算相似系数矩阵，以Clustering程序中SHAN进行UPGMA聚类；用Tree plot模块生成聚类图，构建分子进化树。

根据01二元数据矩阵，统计SCoT扩增产物的条带总数和多态性条带数(NPB)，计算多态性条带所占的比率(PPB)和引物多态性信息含量(PIC)，PIC_i＝2f_i(1－f_i)，公式中PIC_i表示第i个位点的多态性信息含量，f_i表示有带所占的频率，(1－f_i)表示无带所占的频率；对每条引物来说，PIC＝∑PIC_i/n，式中n表示每条引物的多态性条带数；对每条引物而言，标记指数(MI)可以按下述公式计算：MI＝NPB*PIC；采用POPGene32软件对所有试验材料进行遗传多样性参数计算：等位基因数、有效等位基因数、Shannon's信息指数、基因多样性指数、多态位点比率。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明提供了一种利用分子标记技术进行草果种质资源鉴定及遗传分析的新方法，对近危物种草果资源的保护及育种利用具有重要意义，进而提高山区草果种植农民的经济收入。

2)本发明优化了草果基因组DNA的SCoT反应条件。

3)本发明采用5％的非变性聚丙烯酰胺凝胶对SCoT-PCR扩增产物进行分离，分辨率较琼脂糖凝胶更高；克服了传统方法采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，效果较差的问题。

4)利用优化的PCR反应体系，筛选出的10条SCoT引物在草果中PCR扩增反应稳定，扩增片段清晰，多态性高。

5)本发明可加快草果资源的鉴定速度，缩短实验时间，结果稳定可靠，弥补了国内外对草果遗传多样性研究的不足。

6)本发明成本低，在短时间内可完成大批试验材料鉴定。

7)本发明可用于草果种质资源的遗传多样性评价，重复性好、可靠性高，是一种非常有效的分子标记，对草果资源的保护及利用具有重要意义。

8)本发明采用的SCoT分子标记是根据基因中ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性设计的引物，与功能基因及性状密切相关，基因的多样性更能反映遗传资源的多样性。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明SCoT13引物扩增效果图；其中，M，2000bp Marker，1-13分别代表采自金平的J8、J108；采自元阳的Y5、Y32；采自绿春的L12、L28；采自屏边的P45；采自澜沧的LC9、LC30；采自保山的B15；采自梁河的D16、D17；采自云县的YX8；

图2是本发明基于SCoT标记的91份草果样品聚类图。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1DNA的提取

(1)实验材料

本试验所用的91份草果采自云南省8个草果居群，其中金平县13份、元阳县12份、绿春县11份、屏边县9份、澜沧县13份、保山市11份、梁河县12份、云县10份，具体见表1。

表1试验材料编号及采样点

(2)DNA的提取

在种质资源调查同时采集嫩叶用于全基因组DNA提取。采用2*CTAB法提取DNA，并将提取的DNA样品溶于TE缓冲液后存储于-20℃备用。扩增前用双蒸水将DNA样品稀释成20ng/μl的工作液，作为PCR扩增反应的模板。

实施例2PCR反应体系优化及引物筛选

(1)采用正交设计方法，对Mg²⁺、dNTPs和引物浓度、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量等5个因素进行筛选，得到适于草果的SCoT标记PCR反应体系。SCoT-PCR的正交设计如表2。所选SCoT-PCR引物为SCoT15，试验重复3次。经评分比较后，25μl反应体系中10×PCR buffer(不含Mg²⁺)3.0μL、Taq酶0.5U、Mg²⁺2.5mmol/L、dNTP 0.25mmol/L、引物0.5μmol/L和模板DNA60ng综合扩增效果最好。

表2 SCoT-PCR反应L16(4⁵)正交试验设计表

(2)上述反应体系的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

在试验确定最佳反应体系基础上，在梯度PCR仪上进行引物筛选及最佳退火温度确定，筛选出的SCoT引物序列及其最佳退火信息见表3。利用上述反应体系和反应程序共筛选出10条带型稳定、清晰且重复性好的多态性引物：SCoT2、SCoT7、SCoT11、SCoT13、SCoT15、SCoT21、SCoT29、SCoT31、SCoT32、SCoT33。图1为SCoT13对1-13号样品扩增效果图，从图1可以看出，本发明所建立的草果SCoT-PCR反应体系扩增出的条带具有多态性高、特异性强、背景清楚及稳定性强的优点。

表3筛选的SCoT引物序列

(3)电泳和银染体系

PCR扩增产物在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。电泳结束后银染检测条带，具体操作如下：电泳结束后，将胶体从玻璃板上取下，蒸馏水漂洗，转入含有0.2％硝酸银的染色液中，振荡10min，蒸馏水漂洗1次约1min，转入含2％氢氧化钠和0.4％甲醛(10gNaOH定容至500mL，使用前加入2mL甲醛)的显色液中，轻轻振荡待条带显色完全，将胶体转入蒸馏水中。在凝胶成像系统下对胶体进行拍照保存。

实施例3SCoT-PCR反应体系在91份草果品种遗传多样性分析中的应用

(1)聚类分析

将电泳图谱上100～2000bp范围内清晰且可重复出现的条带记为1，同一位置没有条带记为0，由此生成0和1原始矩阵。统计每条引物扩增出的总条带数和多态性条带数。用NTSYS-pc(2.10e)软件中SimQual程序计算相似系数矩阵，以Clustering程序中SHAN进行UPGMA(unweighted pair-groupmethod with arithmetic means)聚类；用Tree plot模块生成聚类图，构建分子进化树。

基于SCoT标记，利用NTSYSpc 2.10e软件对8个居群的91份草果进行聚类分析。基于10条SCoT引物在遗传相似系数阈值0.765处可将样本分为4大类，其中D1和J103各为1类，Y14、J118和J128聚为1类，其余86个样本聚为1类；在阈值0.78处可将样本分为8类，D1、J103、YX23、J119、Y14各为1类，J118和J128聚在一起，B15和YX7聚为1类，剩余的82份样本聚在一起，来自屏边居群的P30和P45、来自保山的B2和B4具有高度的一致性(图2)。

(2)遗传多样性分析

根据01二元数据矩阵，统计SCoT扩增产物的条带总数和多态性条带数(NPB)，计算多态性条带所占的比率(PPB)和引物多态性信息含量(PIC)，PIC_i＝2f_i(1－f_i)，公式中PIC_i表示第i个位点的多态性信息含量，f_i表示有带所占的频率，(1－f_i)表示无带所占的频率；对每条引物来说，PIC＝∑PIC_i/n，式中n表示每条引物的多态性条带数；对每条引物而言，标记指数(MI)可以按下述公式计算：MI＝NPB*PIC。假定所研究的草果居群都处于Hardy-Weinberg平衡，采用POPGene32软件对所有试验材料进行遗传多样性参数计算：等位基因数、有效等位基因数、Shannon's信息指数、基因多样性指数、多态位点比率等。10条SCoT引物共扩增308个条带，其中多态性条带308条，占总条带的100％，平均每条引物扩增30.8条带；不同引物所揭示的PIC(多态性信息含量)在0.136～0.308之间，平均为0.208；MI(标记指数)最高的是引物SCoT21，为7.983，表明该引物在10条引物中的扩增效率最高；有效等位位点数Ne、Nei基因多样度及Shannon's信息指数I最高的引物为SCoT32，分别为1.388、0.249和0.394(表4)。SCoT引物扩增多态性表明云南草果遗传多样性偏低。居群间比较分析表明遗传多样性由高到低依次为金平居群、澜沧居群、德宏居群、绿春居群、云县居群、元阳居群、屏边居群、保山居群。在物种水平上，多态性位点百分率P、观测等位基因数Na、有效等位位点数Ne、Nei基因多样度H和Shannon's信息指数I分别为100％、2.00、1.189、0.136、0.242(表5)。表明草果无论在居群水平还是物种水平遗传多样性都较低，亟需我们加大保护力度。

表4 10条SCoT引物扩增结果

注：TNP：扩增总条带数；NPB：多态性条带数；PPB：多态性比率；Na：观测等位基因数；Ne：有效等位基因数；H：Nei基因多样度；I：Shannon's信息指数；PIC：多态性信息含量；MI：标记指数。

表5草果居群SCoT遗传多样性分析

注：P：多态性位点百分率；Na：观测等位基因数。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 红河学院

<120> 一种利用SCoT分子标记分析草果遗传多样性的方法

<130> 2017

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caacaatggc taccaccc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caacaatggc taccacgg 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagcaatggc taccacca 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgacatggc gaccatcg 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgacatggc gaccgcga 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acgacatggc gacccaca 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccatggctac caccggcc 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccatggctac caccgcct 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccatggctac caccgcac 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccatggctac caccgcag 18

Claims

1.一种利用SCoT分子标记分析草果遗传多样性的方法，其特征在于，其步骤包括：

(1)采用2×CTAB法提取草果基因组DNA以备用；

(2)采用SCoT-PCR反应体系对步骤(1)中提取的DNA样品进行扩增；

(3)将PCR扩增产物在5%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳结束后银染检测条带；

(4)草果遗传多样性分析：利用10条SCoT分子标记将不同来源的草果进行聚类分析，并进行各遗传多样性参数的统计；

其中，所述步骤（2）中进行扩增的引物由扩增10条SCoT分子标记的引物SCoT2、SCoT7、SCoT11、SCoT13、SCoT15、SCoT21、SCoT29、SCoT31、SCoT32和SCoT33组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.10所示；

所述步骤(4)中利用10条SCoT分子标记将不同来源的草果进行聚类分析，并进行各遗传多样性参数的统计，具体为：读取步骤(3)获得的谱带信息，将电泳图谱上100～2000bp范围内清晰且重复出现的条带记为1，同一位置没有条带记为0，由此生成0和1原始矩阵；统计每条引物扩增出的总条带数和多态性条带数；用NTSYS-pc(2.10e)软件中SimQual程序计算相似系数矩阵，以Clustering程序中SHAN进行UPGMA聚类；用Tree plot模块生成聚类图，构建分子进化树，根据01二元数据矩阵，统计SCoT扩增产物的条带总数和多态性条带数NPB，计算多态性条带所占的比率PPB和引物多态性信息含量PIC，PIC_i＝2f_i(1－f_i)，公式中PIC_i表示第i个位点的多态性信息含量，f_i表示有带所占的频率，(1－f_i)表示无带所占的频率；对每条引物来说，PIC＝∑PIC_i/n，式中n表示每条引物的多态性条带数；对每条引物而言，标记指数MI可以按下述公式计算：MI＝NPB×PIC；采用POPGene32软件对所有试验材料进行遗传多样性参数计算：等位基因数、有效等位基因数、Shannon's信息指数、基因多样性指数、多态位点比率。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)采用2×CTAB法提取草果基因组DNA以备用，具体为：采用2×CTAB法提取DNA，并将提取的DNA样品溶于TE缓冲液后存储于-20℃备用，扩增前用双蒸水将DNA 样品稀释成20ng/μL的工作液，作为PCR扩增反应的模板。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SCoT-PCR反应体系具体为：每25μL的反应体系中含有不含Mg²⁺的10×PCR buffer 3.0μL、Taq酶0.5U、Mg²⁺ 2.5 mmol/L、dNTP0.25 mmol/L、引物0.5μmol/L和模板DNA 60ng；将上述反应混合液按如下程序进行扩增：95℃预变性5 min，95℃变性1 min，48-52℃退火1 min，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存；

所述退火温度根据所选择的引物来确定，具体如下：

SEQ ID No.1 50℃

SEQ ID No.2 48℃

SEQ ID No.3 48℃

SEQ ID No.4 50℃

SEQ ID No.5 50℃

SEQ ID No.6 50℃

SEQ ID No.7 52℃

SEQ ID No.8 50℃

SEQ ID No.9 48℃

SEQ ID No.10 48℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中将PCR扩增产物在5%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳结束后银染检测条带，具体为：电泳结束后，将胶体从玻璃板上取下，蒸馏水漂洗，转入含有0.2%硝酸银的染色液中，振荡10min，蒸馏水漂洗1次1min，转入含2%氢氧化钠和0.4%甲醛的显色液中，轻轻振荡待条带显色完全，将胶体转入蒸馏水中；在凝胶成像系统下对胶体进行拍照保存。