KR20150130738A - 분자표지자를 이용한 소나무와 구주소나무의 식별 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 소나무와 구주소나무의 식별이 가능한 분자표지자 및 상기 분자표지자를 이용하여 중합효소 연쇄반응 및 제한효소 단편 다형성(PCR-RFLP) 기법으로 소나무와 구주소나무를 식별하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 분자표지자를 이용한 소나무와 구주소나무의 식별 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 소나무와 구주소나무의 식별이 가능한 분자표지자 및 상기 분자표지자를 이용하여 중합효소 연쇄반응 및 제한효소 단편 다형성(PCR-RFLP) 기법으로 소나무와 구주소나무를 식별하는 방법에 관한 것이다.
지구상의 소나무 속(Genus Pinus)은 100 종 이상 분포하며 침엽수에 현존하는 가장 큰 속으로 알려져 있다(Mirov, 1967; Price et al., 1998).
그 중 우리나라에는 소나무를 비롯한 해송, 잣나무, 섬잣나무, 눈잣나무 등이 자연 분포하고 있으며(이석우, 2007), 리기다소나무, 테다소나무, 스트로브잣나무 등이 도입되어 조림되었다.
소나무는 우리나라 제주도 한라산에서부터 함경북도에 이르기까지 온대림 지역에 광범위하게 분포하는 우리나라 대표 수종이다(조현제와 이창배, 2011).
구주소나무는 소나무 중에 가장 넓은 분포를 하고 있으며 유라시아의 대표적인 용재 수종이다. 구주소나무는 유럽의 스코틀랜드와 스페인에서부터 시베리아를 거쳐 북아시아에까지 분포되어 있다(Mirov, 1967).
소나무속은 분류학적으로 크게 소나무아속(Diplozylon)과 잣나무아속(Haplozylon)으로 분류되는데(Price et al., 1998), 소나무와 구주소나무는 소나무아속의 소나무아절에 속한다.
이들 수종은 2개의 침엽이 모여 나고, 수피는 붉은색 또는 붉은 갈색을 나타내며 외형상 매우 유사하여 쉽게 구분하기 어려운 특징을 갖는다. 분자계통분류학적 연구 결과에서도 소나무와 구주소나무는 매우 근연의 분류학적 관계를 갖는 것으로 나타났다(Gernandt et al., 2005).
일반적으로 고도로 훈련된 전문가를 제외한 일반인의 경우 이들 수종에 대한 시각적 식별은 매우 어려운 것으로 인식되어 있다. 특히 가공 목재의 경우 육안에 의한 식별은 더욱 어려우며, 현미경적 방법으로도 식별이 쉽지 않아(국립산림과학원, 2006) 목재의 혼용 및 불법 유통이 문제시 될 우려가 있다.
상기 문제를 해결하기 위한 기술은 국내에서는 아직까지 개발되어 있지 않으며, 분류학적으로도 주로 잎의 형태와 구과의 형태에 미세한 차이가 있으나(Fu et al., 1999), 생물체 특성상 발달 단계에 따라 형태적 변이가 다양하므로 식별 방법으로 활용하기에는 불명확하고 주관적인 식별 오류의 측면을 배제할 수 없는 문제점이 있다.
따라서, 분류학적 경험적 측정에 의한 소나무와 구주소나무의 식별 기준 이외에, 객관적이고 과학적인 식별 방법은 아직까지 개발되어 있지 않은 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점에 대한 해결 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 소나무와 구주소나무를 식별할 수 있는 종 특이적인 DNA 변이를 탐색하고, 중합효소 연쇄반응 및 제한효소 단편 다형성 기법(PCR-RFLP)을 기반으로 하는 분자표지자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 외부 형태 비교의 불명확함과 주관적인 식별 오류에 대한 문제를 해결하기 위하여, 상기 분자표지자를 이용하여 외부 형태 및 환경 변이의 영향이 없는 DNA 변이를 기반으로 식별의 객관성과 명확한 일관성을 갖는 소나무와 구주소나무의 식별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분자표지자를 포함함으로써, 외부 형태 및 환경 변이의 영향이 없는 DNA 변이를 기반으로 식별의 객관성과 명확한 일관성을 갖는 소나무와 구주소나무의 식별용 키트를 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 소나무와 구주소나무 식별용 분자표지자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 분자표지자를 이용한 소나무와 구주소나무의 식별 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 분자표지자를 포함하는 소나무와 구주소나무 식별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 소나무와 구주소나무 식별용 분자표지자를 이용하여 소나무와 구주소나무를 안정적이고 확실하게 구분할 수 있기 때문에, 소나무와 구주소나무 식별에 대한 과학적 보증을 위한 분자표지자로 활용할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 방법을 이용할 경우, 기존의 방법과 비교하여 불명확한 요소를 해결하고, 특히 외부 형태 비교 자체가 불가능하고 현미경적 방법으로도 식별이 어려운 가공 목재를 식별하는 경우에도 활용될 수 있다.
도 1은 소나무와 구주소나무 식별 Pidest-cp1 분자표지자를 이용한 중합효소 연쇄반응 증폭 산물 분획양상(레인 1~30: 소나무, 레인 31~60: 구주소나무, M: DNA size marker)을 나타낸 것이다.
도 2는 소나무와 구주소나무 식별 Pidest-cp1 분자표지자를 이용한 중합효소 연쇄반응 증폭 산물을 HinfI 제한효소를 이용한 절단산물 분획양상(레인 1~30: 소나무, 레인 31~60: 구주소나무, M: DNA size marker)을 나타낸 것이다.
도 2는 소나무와 구주소나무 식별 Pidest-cp1 분자표지자를 이용한 중합효소 연쇄반응 증폭 산물을 HinfI 제한효소를 이용한 절단산물 분획양상(레인 1~30: 소나무, 레인 31~60: 구주소나무, M: DNA size marker)을 나타낸 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 소나무와 구주소나무 식별용 분자표지자를 제공한다.
본 발명에서, “분자표지자”라 함은 DNA 염기서열을 전기영동으로 감별할 때 이용하는 DNA 마커를 의미한다.
또한, 본 발명에서, “프라이머”라 함은 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다.
상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 표적의 복합도, 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존한다.
본 발명에서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating angent)를 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 상기 분자표지자를 구성하는 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머의 염기서열은 소나무와 구주소나무의 엽록체 DNA 염기서열을 바탕으로 개발되었으며, 본 발명에 의해 처음으로 개시되는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 분자표지자를 이용한 소나무와 구주소나무의 식별 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 소나무와 구주소나무의 식별 방법은, (a) 시료로부터 주형 DNA를 추출하는 단계, (b) 상기 분자표지자를 이용하여 상기 단계에서 추출한 주형 DNA를 중합효소 연쇄반응시켜 증폭하는 단계, (c) 상기 단계에 의해 생성된 증폭산물에 제한효소를 처리하여 상기 증폭산물을 절단하는 단계, 및 (d) 상기 단계에 의해 생성된 절단 산물을 분획하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 소나무와 구주소나무의 식별 방법에서, 상기 중합효소 연쇄반응을 위한 반응 용액은, 상기 반응 용액 50μl당, 25ng의 소나무 게놈 DNA, 25ng의 구주소나무 게놈 DNA, 1 x 완충용액, 20μM의 서열번호 1의 정방향 프라이머, 20μM의 서열번호 2의 역방향 프라이머, 0.2mM의 dNTPs, 2.5mM의 MgCl2 및 0.125 유니트의 DNA 중합효소를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 소나무와 구주소나무의 식별 방법에서, 상기 (b) 단계의 증폭은 94℃에서 5분간 초기 변성과정 후에 94℃에서 30초 변성, 60℃에서 30초 프라이머 결합, 72℃에서 30초의 중합과정을 45회 반복한 후, 72℃에서 10분간 최종 중합과정을 수행할 수 있다.
본 발명의 상기 소나무와 구주소나무의 식별 방법에서, 상기 (c) 단계의 제한효소를 처리하여 상기 증폭산물을 절단하기 위한 반응물은 PCR 증폭산물 5㎕당, 1 x 반응완충용액 및 0.5 유니트의 제한효소를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 소나무와 구주소나무의 식별 방법에서, 상기 제한효소는 HinfI, TfiI, PfeI 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 소나무와 구주소나무의 식별 방법에서, 상기 제한효소의 처리는 37℃에서 3시간 동안 활성화시킨 후, 65℃에서 20분 동안 비활성화시키는 단계를 포함할 수 있다,
또한, 본 발명은 상기 분자표지자를 포함하는 소나무와 구주소나무 식별용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 키트에 포함되는 구성 성분 및 그 제조방법에 대해서는 통상의 키트에 포함되는 구성 성분 및 제조방법을 이용하는 것으로 족하므로, 이들에 대한 상세한 설명은 생략하기로 한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 주형 DNA의 추출 및 정제
주형 DNA 추출 및 정제를 위한 시료를 준비하기 위하여, 각각의 개체로부터 채취된 잎시료 200mg을 정량하여, 세라믹 비드와 함께 2ml 마이크로 튜브에 넣고, DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)의 Buffer AP1 400μl와 RNase A 4μl를 넣은 후, Tissue Lyser(QIAGEN)를 이용하여 30회/초의 속도로 10분간 진동을 주어 잎시료 조직을 파쇄하였다.
이후 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 DNA를 추출하고 정제하였다. 추출된 DNA의 최종 농도는 5ng/μl로 희석하여 사용하였다.
<실시예 2> 프라이머의 설계
소나무 엽록체 염기서열(GenBank accession No.JN854210)과 구주소나무 엽록체 염기서열(GenBank accession No.JN854158)을 이용하여 증폭 대상 영역의 염기서열을 결정하고, Primer3 소프트웨어를 이용하여 프라이머를 설계하였다.
프라이머 크기의 범위는 18mer~22mer, Tm값의 범위는 57도~63도, GC 클램프 1개, 프라이머에 의한 증폭 산물의 길이는 250bp~350bp가 되도록 조정하였다.
하기 표 1은 본 발명의 분자표지자인 Pdest-cp1의 염기서열을 나타낸 것으로서, 프라이머 염기서열 조합은 역방향 상보적(reverse complementary) 염기서열의 조합과 동일한 프라이머 염기서열의 조합으로 간주한다.
| 분자표지자 | 염기서열(5→3) | |
| 정방향(forward primer) | 역방향(reverse primer) | |
| Pdest-cp1 | AACGAGGTGCTCTACCTTGC | GACTCTCGCCGTATGAAAGC |
<실시예 3> 중합효소 연쇄반응(PCR)
상기 실시예 2에서 설계한 분자표지자 Pdest-cp1을 이용하여 소나무와 구주소나무 시료를 대상으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실행하여 증폭 산물을 생성시켰다.
이때, 상기 PCR 반응 혼합물의 조성은 다음과 같다.
PCR 반응 용액은 50μl당 소나무, 구주소나무 게놈 DNA 각각 25ng, 1×완충용액, 20μM primer, 0.2mM dNTPs, 2.5mM MgCl2, 0.125 유니트 Taq DNA polymerase(RBC사)가 포함되도록 하였다.
PCR 증폭은 94℃에서 5분간 초기 변성과정 후에 94℃에서 30초 변성, 60℃에서 30초 프라이머 결합, 72℃에서 30초의 중합과정을 45회 반복한 후, 72℃에서 10분간 최종 중합과정을 실시하였다.
<실시예 4> 제한효소 단편 다형성(RFLP) 기법에 의한 잘단 산물의 생성
상기 실시예 3에서 생성된 증폭 산물에 제한효소를 처리하여 상기 증폭산물의 절단 산물을 생성시켰다.
이때, 상기 제한효소로는 HinfI을 사용하였고, PCR 증폭 산물의 제한효소 절단을 위한 반응물의 조성은 PCR 증폭산물 5㎕당, 1×reaction buffer와 제한효소 0.5Unit이 포함되도록 만든 혼합물을 넣어주었다.
상기 HinfI 제한효소 처리는 37℃에서 3시간 동안 활성화시킨 후, 65℃에서 20분 동안 비활성화시켜 과정으로 수행하였다.
<실시예 5> 증폭 산물 및 절단 산물의 분획
상기 실시예 3에서 생성된 증폭 산물 5㎕를 덜어 3㎕의 loading dye를 섞어준 후, 2% 아가로스 겔 전기영동을 수행하였는데, 100bp ladder(Fermentas사, 50㎍/㎕)를 동시에 분획하여 증폭산물 단편의 크기를 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.
또한, 상기 실시예 4에서 생성된 절단 산물에 5㎕의 loding dye를 섞어준 후, 2% 아가로스 겔 전기영동을 수행하였는데, 100bp ladder(Fermentas사, 50㎍/㎕)를 동시에 분획하여 절단산물 단편의 크기를 확인한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, 아가로스 겔에서 전기영동하여 분획양상을 관찰하면, 소나무와 구주소나무 시료에서 공통적으로 약 300bp의 DNA 단편이 동시에 관찰됨을 알 수 있다.
또한, 도 2에서 보는 바와 같이, 분자표지자인 Pidest-cp1를 이용한 증폭산물의 절단산물을 아가로스 겔에서 전기영동하여 분획양상을 관찰하면, 구주소나무에서는 절단산물이 관찰되지 않는 반면, 소나무에서는 약 200bp의 절단산물 DNA 단편이 관찰됨을 알 수 있다.
상기에서 관찰된 DNA 단편의 크기는 함께 전기영동된 DNA 크기 마커(DNA size marker)를 기준으로 시각적으로 관찰된 값이며, 프라이머 합성에 이용된 염기서열로부터 프라이머가 증폭하는 염기서열의 크기와 제한효소 인식부위를 기준으로 계산된 길이를 바탕으로 대략적 크기를 예상할 수 있다.
상기 전기영동을 통한 DNA 단편을 관측할 때, 시각적 관찰에 의하여 관찰자에 따라 근소하게 상이한 값을 나타낼 수 있으나, 큰 오차가 나지 않는 이상 목표로 하는 DNA 부위를 정확히 증폭하고, 절단하는 것으로 간주할 수 있다.
이상 본 발명의 구체적 실시형태와 관련하여 본 발명을 설명하였으나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 통상의 기술자라면본 발명의 범위를 벗어나지 아니한 채, 설명된 실시형태를 변경 또는 변형할 수 있으며, 이러한 변경 또는 변형도 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명에 따르면, 상기 소나무와 구주소나무 식별용 분자표지자를 이용하여 소나무와 구주소나무를 안정적이고 확실하게 구분할 수 있기 때문에, 소나무와 구주소나무 식별에 대한 과학적 보증을 위한 분자표지자로 활용할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 방법을 이용할 경우, 기존의 방법과 비교하여 불명확한 요소를 해결하고, 특히 외부 형태 비교 자체가 불가능하고 현미경적 방법으로도 식별이 어려운 가공 목재를 식별하는 경우에도 활용될 수 있다.
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<120> Method of distinguishing between the red pine and the scot pine
using molecular marker
<130> 9615
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 1
aacgaggtgc tctaccttgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 2
gactctcgcc gtatgaaagc 20
Claims (9)
- 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어진 소나무와 구주소나무 식별용 분자표지자.
- 제1항의 분자표지자를 이용한 소나무와 구주소나무의 식별 방법.
- 제2항에 있어서,
(a). 시료로부터 주형 DNA를 추출하는 단계;
(b). 상기 분자표지자를 이용하여 상기 단계에서 추출한 주형 DNA를 중합효소 연쇄반응시켜 증폭하는 단계;
(c). 상기 단계에 의해 생성된 증폭산물에 제한효소를 처리하여 상기 증폭산물을 절단하는 단계; 및
(d). 상기 단계에 의해 생성된 절단 산물을 분획하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 소나무와 구주소나무의 식별 방법. - 제3항에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응을 위한 반응 용액은 상기 방응 용액 50μl당, 25ng의 소나무 게놈 DNA, 25ng의 구주소나무 게놈 DNA, 1 x 완충용액, 20μM의 서열번호 1의 정방향 프라이머, 20μM의 서열번호 2의 역방향 프라이머, 0.2mM의 dNTPs, 2.5mM의 MgCl2 및 0.125 유니트의 DNA 중합효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 소나무와 구주소나무의 식별 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 (b) 단계의 증폭은 94℃에서 5분간 초기 변성과정 후에 94℃에서 30초 변성, 60℃에서 30초 프라이머 결합, 72℃에서 30초의 중합과정을 45회 반복한 후, 72℃에서 10분간 최종 중합과정을 수행하는 것을 특징으로 하는 소나무와 구주소나무의 식별 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 (c) 단계의 제한효소를 처리하여 상기 증폭산물을 절단하기 위한 반응물은 PCR 증폭산물 5㎕당, 1 x 반응완충용액 및 0.5 유니트의 제한효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 소나무와 구주소나무의 식별 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 제한효소는 HinfI인 것을 특징으로 하는 소나무와 구주소나무의 식별 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 제한효소의 처리는 37℃에서 3시간 동안 활성화시킨 후, 65℃에서 20분 동안 비활성화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 소나무와 구주소나무의 식별 방법.
- 제1항의 분자표지자를 포함하는 소나무와 구주소나무 식별용 키트.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| J301 | Trial decision |
Free format text: TRIAL NUMBER: 2016101004247; TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20160720 Effective date: 20171222 |
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| S901 | Examination by remand of revocation | ||
| GRNO | Decision to grant (after opposition) | ||
| GRNT | Written decision to grant |