CN114292948B - 一种蛋黄果SCoT分子标记的PCR反应体系 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋黄果SCoT分子标记的PCR反应体系，属于生物技术领域。该该PCR反应体系的组成与含量如下：模板DNA为80ng，Mg2+为3mmol/L，dNTPs浓度为0.25mmol/L，引物浓度为0.6μmol/L，Taq酶浓度为2U。所述引物为SCoT9、SCoT16、SCoT24、SCoT33、SCoT48中的任一条，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.5所示。本发明所建立的蛋黄果SCoT‑PCR反应体系扩增出的条带稳定性高，清晰度高，具有操作简单、灵敏度高、重复性好等优点，能够实现对蛋黄果遗传多样性的分析。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋黄果SCoT分子标记的最佳PCR反应体系的构建。
背景技术
蛋黄果(Lucuma nervosa A.DC)，又名狮头果、蛋果、桃榄、仙桃等，为山榄科(Sapotaceae)蛋黄果属(Lucuma)多年生的热带常绿稀有果树。原产古巴和美洲热带，20世纪30年代开始引入中国，适宜在我国北纬24°以南的地区种植(邓成菊等，2013)。蛋黄果果肉黄色粉质，似煮熟的蛋黄，口感独特，含有丰富的人体必需氨基酸，其蛋白质、矿物质和维生素等营养成分都比芒果高(欧世坤等，2007)，且其成熟期一般在12月到第二年3月份，为供果期较长的淡季水果，对水果市场具有良好的调节和促进作用(蛋黄果引种试种初报，罗心平等，2004)。除鲜食外，蛋黄果还被加工成果酱、奶油、果酒和醋等(蛋黄果果醋生产工艺的研究，顾宗珠，2011)；其叶片中含有8种三萜类化合物，因此具有较高的药用价值(Fu-CaiRen，2019)。近年来，蛋黄果的研究在我国正逐步展开，广西、海南、广东、云南和福建等地区先后引种试种，并筛选出一些适应性好、抗性强、坐果率高、果实品质优的品种，如“仙桃1号”(周婧，2011)、“仙桃2号”(周婧，2012)、“蛋黄果云热-205”(2012)和“蛋苹一号”(邓成菊等，2014)等，并对其栽培管理以及果实保鲜与加工等方面进行了相关的研究，但分子标记在蛋黄果上的研究尚少，仅有邢姗姗等(2009)探讨了蛋黄果ISSR—PCR反应的最佳体系，且尚无种质资源鉴定、遗传多样性分析等方面的研究。
目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism，SCoT)分子标记是一种基于单引物扩增目的基因的共显性中性分子标记方法，与传统的分子标记相比，其能有效产生与性状连锁的标记，是一种能跟踪性状的新型分子标记，其最早由Collard和Mackill(2009)提出并在水稻上应用，因其重复性好、灵敏度高、稳定性强、操作简单、成本较低、引物通用、多态性高、遗传信息丰富等优点被广泛用于其他植物资源的研究，如割手密(罗霆等，2013)、芥菜(林清等，2013)、番木瓜(杨祥燕等，2013)、鸭茅(蒋林峰等，2014)、枸杞(查美琴等，2016)、皂荚(张安世等，2017)、猕猴桃(张安世等，2017)、柑橘(韩国辉等，2019)、杨桃(欧景莉等，2019)和地黄(杨珂等，2019)等种质资源的遗传多样性研究、亲缘关系研究以及DNA指纹图谱构建等，但由于植物品种不同，生长特性不同，具体标记过程，引物的共显性等也有所不同。目前国内外尚无针对蛋黄果，利用SCoT分子标记进行质资源鉴定、遗传多样性分析的文献报道，因此，构建优化蛋黄果SCoT-PCR反应体系，获得最佳反应体系，为今后利用SCoT分子标记进行蛋黄果种质资源遗传多样性分析、种质保护和创新选种等研究提供技术保障基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋黄果SCoT分子标记的PCR反应体系，为蛋黄果的生物学研究提供参考。本发明的反应体系具有稳定性强，扩增出的条带清晰度高等特点。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种蛋黄果SCoT分子标记的PCR反应体系，该PCR反应体系的组成与含量如下：模板DNA为80ng，Mg2+为3mmol/L，dNTPs浓度为0.25mmol/L，引物浓度为0.6μmol/L，Taq酶浓度为2U。所述引物为SCoT9、SCoT16、SCoT24、SCoT33、SCoT48中的任一条，其核苷酸序列如SEQID NO.1-SEQ ID NO.5所示。
本发明所采用的PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃1min，50℃退火1min，72℃2min，进行35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
本发明的蛋黄果SCoT分子标记的PCR反应体系在蛋黄果遗传多样性评价分析中的运用。
本发明的有益效果：
(1)本发明是首次建立蛋黄果的SCoT-PCR反应体系，该反应体系具有操作简单、灵敏度高、重复性好等优点，能够实现对蛋黄果遗传多样性的分析，将有效弥补国内对蛋黄果遗传多样性研究的不足。
(2)本发明所建立的蛋黄果SCoT-PCR反应体系扩增出的条带稳定性高，清晰度高。而且对引物的适用性高，对于常规的引物也具有较好的效果。
(3)本发明SCoT-PCR反应体系筛选出来的5条引物(SCoT9、SCoT16、SCoT24、SCoT33、SCoT48)对33份不同的样品检测中均良好的稳定性，扩增出的条带稳定性高，清晰度也高，说明具有很强的适用性。
(4)本发明可用于蛋黄果蛋遗传多样性评价和亲缘关系分析、种质资源鉴定、种质保护和创新选种、指纹图谱构建、分子辅助育种以及功能基因挖掘等方面的研究，具有很大的科学价值和应用价值。
附图说明
图1是1号样品SCoT-PCR反应因素水平L16(45)正交试验PCR后的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图2为1号样品在50条不同引物中扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图3为33份样品在SCoT9引物中扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果图；
图4为33份样品在SCoT16引物中扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图5为33份样品在SCoT24引物中扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图6为33份样品在SCoT33引物中扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果。
图7为33份样品在SCoT48引物中扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施方式
本发明用下列实施例进行说明，但不是对本发明的使用范围的限制。
实施例
一、实验材料：
本发明的样品均采自广西南亚热带农业科学研究所，其中，1号为广西南亚热带农业科学研究所选育的“仙桃1号”，其余样品为来自国内不同地区的蛋黄果。
二、实验内容：
1.蛋黄果DNA的提取与检测
取蛋黄果幼嫩叶片，用试剂盒对样品进行DNA提取，用NanoDrop检测DNA的浓度、OD260/280和OD260/230；通过琼脂凝胶电泳检测样品DNA的完整性。
2.蛋黄果SCoT-PCR反应体系优化
以1号样品和引物SCoT1(5’-CAACAATGGCTACCACCA-3’)进行优化试验。将DNA、Mg2+、dNTPs、引物和Taq聚合酶5个影响因素设置为4个不同水平(不同因素水平见表1)，采用L16(45)正交试验，对蛋黄果SCoT-PCR反应体系进行优化。PCR反应体系为20μL，扩增程序为94℃预变性3min；94℃1min，50℃退火1min，72℃2min，进行35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。扩增完毕后，加入5μL 6*DNA loading buffer，充分混匀后，取10μL上样进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后用Bio-rad ChemiDoc MP凝胶成像仪拍照。电泳条件：1％琼脂糖凝胶，电压6V/cm，电泳时间47分钟。
表1 SCoT-PCR反应优化的因素与水平
3.蛋黄果SCoT-PCR反应体系正交试验结果
图1为1号样品SCoT-PCR反应因素水平L16(45)正交试验PCR后的琼脂糖凝胶电泳结果，根据2次电泳检测的结果中条带数量的丰富程度和清晰度对16个处理的试验进行打分，最佳的记16分，最差的计1分。依处理顺序得到的分数分别记为：8、1、11、16、14、10、11、15、12、14、11、14、8、15、6、6，将数据录入正交设计助手软件，获得均值及极差值(表2)，每个因素水平对应的最高均值即为该因子的最佳浓度，由此确定蛋黄果最佳SCoT-PCR反应体系(20μL)为：模板DNA 80ng，Mg2+3mmol·L-1，dNTPs 0.25mmol·L-1，引物0.6μmol·L-1，Taq2U；
表2 样品SCoT-PCR反应因素水平L16(45)正交试验设计
4.蛋黄果SCoT-PCR反应体系的检测及应用
(1)以1号样品为试材，分别用Collard等和罗聪公布的50条引物(表3)在优化的蛋黄果SCoT-PCR反应体系中进行扩增，50条SCoT引物均能在蛋黄果中扩增出清晰明亮的条带，说明这50条引物均可与本发明的蛋黄果SCoT-PCR结合，用于探究蛋黄果种质资源遗传多样性、分子标记辅助育种等研究，同时也证明本发明建立的蛋黄果SCoT-PCR反应体系具有较高的稳定性和通用性。图2为1号样品在50条不同引物中扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果图。
表3 SCoT引物序列
(2)选取3份来自不同地区的蛋黄果种质为试材(1号、13号、29号)，用上面实验(1)的50条引物在优化的蛋黄果SCoT-PCR反应体系中进行扩增，筛选出条带清晰明亮，数目丰富，多态性强，且稳定性高的5条引物(SCoT9、SCoT16、SCoT24、SCoT33、SCoT48)进行重复性、准确性检测分析。分别以33份来源不同(如表4)的蛋黄果种质为模板进行SCoT-PCR反应，均采用蛋黄果最佳SCoT-PCR反应体系(20μL)为：模板DNA 80ng，Mg2+ 3mmol·L-1，dNTPs0.25mmol·L-1，引物0.6μmol·L-1，Taq 2U进行PCR扩增。获得图3-6的琼脂糖凝胶电泳结果图。
表4 33份不同来源的蛋黄果种质
| 种质编号 | 来源 | 种质编号 | 来源 |
| 1 | 广西南亚所“仙桃1号” | 18 | 广西 |
| 2 | 广西南亚所“仙桃2号” | 19 | 广西 |
| 3 | 广西 | 20 | 广西 |
| 4 | 广西 | 21 | 广西 |
| 5 | 广西 | 22 | 广西 |
| 6 | 广西 | 23 | 广西 |
| 7 | 广西 | 24 | 广西 |
| 8 | 广西 | 25 | 广西 |
| 9 | 广西 | 26 | 广西凭祥 |
| 10 | 广西 | 27 | 广西凭祥 |
| 11 | 广西南亚所 | 28 | 云南轩岗乡 |
| 12 | 广西 | 29 | 四川攀枝花 |
| 13 | 云南 | 30 | 广西 |
| 14 | 云南 | 31 | 云南“蛋苹一号” |
| 15 | 广西 | 32 | 云南省红河热带农业科学研究所 |
| 16 | 广西 | 33 | 广西南亚所 |
| 17 | 广西 |
图3为33份样品在SCoT9引物中扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果；图4为33份样品在SCoT16引物中扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果；图5为33份样品在SCoT24引物中扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果；图6为33份样品在SCoT33引物中扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果；图7为33份样品在SCoT48引物中扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果。
从图3-6可知，均获得了清晰明亮、数目丰富、多态性好的条带。说明优化的筛选出来的引物在优化的SCoT-PCR反应体系中，对于不同品种的蛋黄果具有很好的稳定性。说明本发明的SCoT-PCR反应体系可用于蛋黄果遗传多样性评价和亲缘关系分析、种质资源鉴定、指纹图谱构建、分子辅助育种以及功能基因挖掘等研究，具有很大的科学价值与应用价值。
序列表
<110> 广西南亚热带农业科学研究所
<120> 一种蛋黄果SCoT分子标记的PCR反应体系
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Ala Ala Cys Ala Ala Thr Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Ala Gly
1 5 10 15
Cys Ala
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ala Cys
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys
1 5 10 15
Ala Thr
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Cys Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Cys Ala Ala Thr Gly Gly Cys Thr Ala Cys Cys Ala Cys Thr Gly
1 5 10 15
Gly Cys
Claims (3)
1.一种蛋黄果SCoT分子标记的PCR反应体系，其特征在于，该PCR反应体系的组成与含量如下：模板DNA为80ng，Mg2+为3mmol/L，dNTPs浓度为0.25mmol/L，引物浓度为0.6μmol/L，Taq酶浓度为2U。
所述引物为SCoT9、SCoT16、SCoT24、SCoT33、SCoT48中的任一条，其核苷酸序列如SEQID NO.1-SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的蛋黄果SCoT分子标记的PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃1min，50℃退火1min，72℃2min，进行35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
3.如权利要求1-2任一所述的蛋黄果SCoT分子标记的PCR反应体系在蛋黄果遗传多样性评价分析中的运用。
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| CN107267647A (zh) * | 2017-08-23 | 2017-10-20 | 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室 | 一种葛根SCoT分子标记的PCR反应体系 |
| CN108330162A (zh) * | 2017-05-26 | 2018-07-27 | 红河学院 | 一种利用SCoT分子标记分析草果遗传多样性的方法 |
-
2022
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 蛋黄果基因组DNA提取方法的研究;孙伟生;王松标;;安徽农业科学(第01期);157-158 * |
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