CN105925709A - 一种粉枝莓SCoT分子标记的PCR反应体系 - Google Patents

一种粉枝莓SCoT分子标记的PCR反应体系 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种粉枝莓SCoT分子标记的PCR反应体系，该PCR反应体系的组成和含量如下：dNTPs 0.125mmol·L‑1，Taq DNA聚合酶0.75U，引物1.0μmol·L‑1，Mg2+0.625mmol·L‑1，模板40ng，余量为水，退火温度51℃，上述总量为20.0μL。本发明还公开了一种粉枝莓SCoT分子标记的PCR反应程序。本发明所建立的粉枝莓SCoT‑PCR反应体系扩增出的条带稳定性高，清晰度高，具有很高的多态性的特点。弥补了国内对粉枝莓遗传多样性研究的不足。

Description

一种粉枝莓SCoT分子标记的PCR反应体系
技术领域
本申请属于生物技术领域，具体地说，涉及一种粉枝莓SCoT分子标记的PCR反应体系。
背景技术
粉枝莓(Rubus biflorus Buch)是蔷薇科悬钩子属植物中的一种落叶性野生果木，在西藏的分布主要集中于拉萨、林芝等地。其果实味甜，聚合浆果，橘红色，营养成分含量丰富，有机酸及铁和锌等微量元素含量均高于普通水果，蛋白质和维生素含量也远高于普通水果，除用于生食外，也可以酿酒，制作果汁、果酱等，具有较高的开发利用价值。目前，对粉枝莓的研究主要集中在资源调查、营养成分和活性成分分析方面，而关于粉枝莓遗传多样性研究未见报道。因此，开展粉枝莓遗传多样性研究，不仅在理论上有助于加深我们对粉枝莓的了解，为这一野生果树资源的应用和推广提供理论依据，使其能更广泛地应用于农业生产，而且有助于对优异基因资源进行深入的评价、挖掘和利用，提高果实产量和改善品质。
目标起始密码子多态性标记(SCoT)具有操作简单、多态性高、重复性好、引物通用性强等优点，且能有效产生和性状连锁的标记。目前，SCoT标记已广泛应用于枇杷、葡萄、龙眼等资源的种质资源、遗传多样性分析。目前，关于粉枝莓SCoT-PCR反应体系的建立尚无报道。
发明内容
有鉴于此，本申请针对上述的问题，提供了一种粉枝莓SCoT分子标记的PCR反应体系，本发明以粉枝莓为材料，建立并优化粉枝莓SCoT-PCR分子标记的反应体系，以期为粉枝莓种质资源的遗传多样性分析奠定基础。
为了解决上述技术问题，本申请公开了一种粉枝莓SCoT分子标记的PCR反应体系，该PCR反应体系的组成和含量如下：dNTPs 0.125mmol·L-1，Taq DNA聚合酶0.75U，引物1.0μmol·L-1，Mg2+0.625mmol·L-1，模板40ng，余量为水，退火温度51℃，上述总量为20.0μL。
进一步地，引物为SC2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本申请还公开了一种粉枝莓SCoT分子标记的PCR反应程序，该程序为：94℃3min，94℃30s，50-56℃退火45s，68℃1min，35个循环，68℃5min，12℃保存。
与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：
1)本发明是首次建立粉枝莓SCoT-PCR反应体系，本发明提供的粉枝莓SCoT-PCR反应体系具有操作简单、灵敏度高、重复性好等优点，能够实现对粉枝莓遗传多样性的分析，将有效弥补国内对粉枝莓遗传多样性研究的不足。
2)本发明所建立的粉枝莓SCoT-PCR反应体系扩增出的条带稳定性高，清晰度高，具有很高的多态性的特点。弥补了国内对粉枝莓遗传多样性研究的不足。
3)本发明可用于粉枝莓遗传关系、分子标记方面的研究，在粉枝莓优异基因资源评价、挖掘和利用以及提高其果实产量和改善品质方面具有很大的科学价值和应用价值。
当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是本申请粉枝莓基因组DNA电泳谱图，其中，M：DNA Marker；1～9.9份随机选取的粉枝莓材料基因组DNA；
图2是本申请粉枝莓SCoT-PCR反应体系扩增结果，其中，M：DNAMarker；1～36：粉枝莓SCoT-PCR反应体系36个处理组合；
图3是本申请8份粉枝莓样品SCoT-PCR扩增结果(引物SC35)，其中，M：DNA Marker；1～8：8份随机选取的粉枝莓材料基因组DNA。
具体实施方式
以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
材料与试剂：供试植物材料为粉枝莓，于2015年8月采自西藏自治区林芝市色季拉山。野外采集健康无病害幼嫩叶片，放于硅胶中干燥封存，运回实验室后放于-70℃冰箱保存，提取DNA备用。本试验所用SCoT引物参照(Collard B C Y,Mackill D J.Start codon targeted(SCoT)polymorphism:asimple,novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers inplants[J].Plant Mol Biol Rep,2009,27:86-93.)的报道，由华大基因科技有限公司负责合成。Taq DNA聚合酶、dNTPs混合液、10×PCR Buffer(Mg2+free)购自NEB公司。其余试剂为国产分析纯。
实施例1粉枝莓SCoT分子标记的PCR反应体系建立方法
1实验方法
1.1基因组DNA的提取与检测
粉枝莓植物基因组DNA的提取采用改良的CTAB法(李金璐,王硕,于婧,王玲,&周世良.(2013).一种改良的植物DNA提取方法.植物学报,48(1),72-78.)。DNA浓度和质量通过分光光度计测定，并取适量样品于0.8％的琼脂糖电泳检测，其余DNA样品于-20℃冰箱中保存备用。
1.2SCoT-PCR反应体系的优化
反应体系确定为20μL，先以预扩增较好的引物SC2(5′-CAACAATGGCTACCACCC-3′，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)作为粉枝莓基因组DNA扩增体系建立的初选引物，Taq酶(5U/μL)0.15μL，DNA模板40ng。以此为基础将引物、Mg2+、dNTPs、退火温度等4个影响因素进行浓度梯度设置(表1)。
表1粉枝莓SCoT-PCR扩增体系各成分优化试验设计(20μL)
1.3PCR扩增与扩增产物的检测
PCR扩增程序：94℃3min，94℃30s，(51-56)℃退火45s，68℃1min(35个循环)，68℃5min，12℃保存。PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，在凝胶成像系统成像。
2结果与分析
2.1粉枝莓基因组DNA的检测
用改良CTAB法提取粉枝莓基因组DNA的OD260/280值在1.67～1.98之间；琼脂糖电泳检测结果(图1)显示，样品DNA为一条清晰完整的条带，没有明显的拖尾，也没有RNA条带。结果说明所提的DNA纯度较高，可用于SCoT体系的优化及后续实验。
2.2粉枝莓SCoT-PCR反应体系优化结果
粉枝莓SCoT-PCR条件优化设置见表2，SCoT-PCR优化试验扩增结果见图2，36个处理中除16号处理外，其他均有谱带产生，32号和33号扩增谱带清晰、多态性高，基本符合SCoT分析的要求。最终选取33号处理作为最佳扩增体系，即：SCoT-PCR 20.0μL反应体系中，dNTPs 0.125mmol·L-1，TaqDNA聚合酶0.75U，引物1.0μmol·L-1，Mg2+0.625mmol·L-1，模板40ng，退火温度51℃。
表2粉枝莓SCoT-PCR条件优化设置
3结果与讨论
SCoT标记技术具有较高的多态性，已广泛应用于物种遗传多样性研究。但是，SCoT标记的PCR扩增结果受反应体系、物种等条件的影响较大。虽然不少学者已经对多种植物的SCoT-PCR体系进行了优化，为相应物种的遗传多样性、亲缘关系等研究提供了参考，但不同物种对其各个影响因素的浓度要求不一样，因此针对不同的物种材料，仍需对其PCR反应体系进行优化。
因此，在利用SCoT分子标记分析粉枝莓遗传多样性之前，对SCoT-PCR反应体系进行优化是非常必要的。该研究从引物、dNTPs、Mg2+浓度以及退火温度4个因素，对SCoT-PCR反应体系进行了优化。最终确定：SCoT-PCR20.0μL最佳反应体系中，dNTPs 0.125mmol·L-1，Taq DNA聚合酶0.75U，引物1.0μmol·L-1，Mg2+0.625mmol·L-1，模板40ng，退火温度51℃。
实施例2粉枝莓SCoT分子标记的的PCR反应体系的应用例
以最佳SCoT-PCR反应体系为基础，采用SC35(5′-CATGGCTACCACCGGCCC-3′，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)引物对8份随机选择的粉枝莓样品进行扩增。
通过对8份随机选择的粉枝莓样品进行扩增，结果(图3)显示，8份样品均得到有效扩增，扩增所得条带清晰，即所建立的粉枝莓SCoT-PCR反应体系稳定。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种粉枝莓SCoT分子标记的PCR反应体系，其特征在于，该PCR反应体系的组成和含量如下：dNTPs 0.125mmol·L-1，Taq DNA聚合酶0.75U，引物1.0μmol·L-1，Mg2+0.625mmol·L-1，模板40ng，余量为水，退火温度51℃，上述总量为20.0μL。
2.根据权利要求1所述的粉枝莓SCoT分子标记的PCR反应体系，其特征在于，所述引物为SC2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种粉枝莓SCoT分子标记的PCR反应程序，其特征在于，该程序为：94℃3min，94℃30s，51-56℃退火45s，68℃1min，35个循环，68℃5min，12℃保存。
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