CN107937492A

CN107937492A - 一种大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法及应用

Info

Publication number: CN107937492A
Application number: CN201711307941.XA
Authority: CN
Inventors: 田洁; 边海燕; 钟启文; 王丽慧; 杨世鹏
Original assignee: Qinghai University; Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Current assignee: Qinghai University; Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority date: 2017-12-11
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2018-04-20
Anticipated expiration: 2037-12-11
Also published as: CN107937492B

Abstract

本发明公开一种大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法及其应用，包括如下步骤：提取大蒜叶片总RNA，qRT‑PCR法检测蔗糖1‑果糖基转移酶(1‑SST)基因和果聚糖外切水解酶(FEH)基因的表达量。该检测方法可以实现精确定量，可以看到整个扩增过程、扩增效率和溶解温度等，本发明还提供了所述方法在大蒜高糖抗逆育种中的应用。

Description

一种大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法及应用

技术领域

属于分子生物技术和基因工程领域，涉及大蒜叶片果聚糖代谢关键酶基因的实时荧光定量PCR定量检测技术。

背景技术

果聚糖是大蒜中含量最高的碳水化合物，被作为其收获产品的重要品质参数。研究证实，大蒜鳞茎中果聚糖含量极高，占其干物质质量的75～80％(Losso&Nakai,1997)。由于其聚合度大小的不同，可将果聚糖分为低聚果糖和高聚果糖。大蒜中的果聚糖以聚合度在3～9的低聚果糖为主，包括蔗果三糖、蔗果四糖、新蔗果三糖等(索慧，2010)。低聚果糖甜度高、热能低，能够促进肠道双歧杆菌增殖、抑制肠道有害细菌生长，具有极高的药用价值和保健功能(Bekers et al.,2004)。

果聚糖作为大蒜中重要的贮存性物质，其代谢过程不仅影响着大蒜的产量和品质，还能够通过渗透调节增强植株在不良环境胁迫下的抗逆性(Abebe T et al.,2003；Pilon-Smits EAH et al.,1995；Roover JD et al.,2003)。高等植物中，果聚糖的代谢受果聚糖合成酶与水解酶的共同影响(Edelman J&Jefford TG,1968)。果聚糖以蔗糖为底物，由蔗糖：蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)起始其合成(B Lasseur et al.,2009)。果聚糖的降解主要受果聚糖外切水解酶(FEH)调控，它可将果聚糖分子上的末端糖基逐渐分离，最终被降解为蔗糖或单糖。研究发现，在多种环境胁迫下，果聚糖的代谢调控是植物适应不利环境的一种重要保护机制，其合成积累能够提高植物的抗逆性(Valluru R&Van den Ende W,2008)。近年来，大量学者已在小麦(马召朋，2014)、烟草(李慧娟等，2007)等植物中证实果聚糖能够调控干旱胁迫，但目前为止，关于干旱胁迫下大蒜果聚糖代谢关键酶基因表达特征未见报道，果聚糖对干旱胁迫的响应及调控机制尚不明确。

发明内容

本发明的目的是提供一种大蒜果聚糖代谢关键酶基因表达的实时荧光定量PCR分析方法。检测大蒜果聚糖代谢关键酶基因的表达，该检测方法可以实现精确定量，可以看到整个扩增过程、扩增效率和溶解温度等，本发明还提供了所述方法在大蒜高糖抗逆育种中的应用。

一种大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法，其特征在于包括如下步骤：提取大蒜叶片总RNA，qRT-PCR法检测蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)基因和果聚糖外切水解酶(FEH)基因的表达量。

本发明还提供一种具体的大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法，其特征在于包括如下步骤：

1)大蒜叶片总RNA提取：大蒜苗高8-12cm时，剪下叶片上端，立即置于液氮中进行速冻处理形成对照样；大蒜苗不良环境胁迫6-8天后，剪下叶片上端，立即置于液氮中进行速冻处理形成待测样；分别提取对照样和待测样大蒜叶片总RNA，并合成cDNA；

2)设计蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)基因和果聚糖外切水解酶(FEH)基因的特异性引物如下：

1-SST引物对：

F:TTTTTTTTTCCGACGGCTTC(如SEQ ID NO.1所示)

R:GGTACCAATGATCGGGAATA(如SEQ ID NO.2所示)；

1-FEH引物对：

F:ATGGTCGAATGAATCGGATAG(如SEQ ID NO.3所示)

R:TGGCCATTGTACCAGAGTTT(如SEQ ID NO.4所示)；

3)选择5个大蒜基因：TUA、GAPDH、ACT、CYP和UBQ做内参基因进行扩增；

4)分别检测目的基因蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)基因和果聚糖外切水解酶(FEH)基因的差异表达：qRT-PCR分别检测对照样目的基因平均Ct值、对照样内参基因平均C值、待测样目的基因平均Ct值和待测样内参基因平均Ct值，根据△△Ct＝(△Ct待测样-△Ct对照样)＝(待测样目的基因平均Ct值-待测样内参基因平均Ct值)-(对照样目的基因平均Ct值-对照样内参基因平均Ct值)来计算目的基因的相对表达量；其中Ct值表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，设定的阈值为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

进一步的，本发明内参基因TUA的特异性引物对：

F:CCTAGAGCACGGTATTCAG(如SEQ ID NO.5所示)

R:GCGGTAAGTTCCAGTTCT(如SEQ ID NO.6所示)。

进一步的，本发明内参基因GAPDH的特异性引物对：

F:AGGCTGGTGCTGATTACG(如SEQ ID NO.7所示)

R:GGTCTGAAGTGTATGAAGTATGG(如SEQ ID NO.8所示)。

进一步的，本发明内参基因ACT的特异性引物对：

F:CAGGAGTTATGGTTGGAATGG(如SEQ ID NO.9所示)

R:AGCACGGGATGTTCTTCA(如SEQ ID NO.10所示)。

进一步的，本发明内参基因CYP的特异性引物对：

F:AAGGACGAGAACTTCATC(如SEQ ID NO.11所示)

R:TCAATATCTCTCACCACTTC(如SEQ ID NO.12所示)。

进一步的，本发明内参基因UBQ的特异性引物对：

F:AAGCCAAGATACAGGACAAG(如SEQ ID NO.13所示)

R:GCATACCACCTCTCAATCTC(如SEQ ID NO.14所示)。

本发明所述方法在大蒜高糖抗逆育种中的应用。

当不良环境胁迫7天时，蔗糖1-果糖基转移酶基因相对表达量>1.5或果聚糖外切水解酶基因相对表达量>2.5时，表示为高糖抗逆品种。

本发明所述一种大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法，通过对大蒜叶片果聚糖代谢合成关键酶蔗糖：蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)基因和降解关键酶果聚糖外切水解酶(FEH)基因表达量的检测，得到大蒜果聚糖响应干旱胁迫下的调控机制，可以此应用在大蒜高糖抗逆育种中。

本发明从大蒜叶片总RNA提取、1-SST和1-FEH基因特异性引物设计与合成、内参基因的筛选、反转录产物cDNA的制备、qRT-PCR检测以及基因相对表达量的计算等方面，公布了1-SST和1-FEH基因表达定量检测的完善体系，能够准确、快速地定量干旱胁迫下大蒜代谢关键酶基因1-SST和1-FEH的差异表达，具有重要的应用价值。

本发明的目的是提供大蒜果聚糖代谢关键酶基因表达的实时荧光定量PCR分析方法。利用实时荧光定量PCR技术，通过所得Ct值利用法计算，快速、准确地定量检测了大蒜在干旱胁迫下果聚糖代谢关键酶基因的表达量，可以看到整个扩增过程、扩增效率和溶解温度等，这些是普通PCR无法实现的，该检测方法弥补了普通PCR技术的缺陷，实现了实时监测扩增反应，具有实时、准确、快速、可靠等优点。利用本发明建立的方法，不仅测定了大蒜在干旱胁迫下果聚糖代谢关键酶基因的差异表达量，而且由于其准确度高，可为大蒜高糖抗逆育种提供准确的理论参考。分析果聚糖在响应干旱胁迫中的作用，可为大蒜高糖抗逆育种提供理论参考。

附图说明

图1：RNA质量检测结果；

图2：内参基因的PCR检测；

图3：1-SST引物通用性普通PCR检测；

图4：1-FEH引物通用性普通PCR检测；

图5：CYP引物通用性普通PCR检测；

图6：1-SST引物特异性荧光定量PCR检测；

图7：1-FEH引物特异性荧光定量PCR检测；

图8：CYP引物特异性荧光定量PCR检测；

图9：干旱胁迫下1-SST基因表达情况；

图10：干旱胁迫下1-FEH基因表达情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

以下实施例中所用的试验样品品种：乐都紫皮大蒜。

实施例1

(1)试验材料与处理

供试材料‘乐都紫皮大蒜’为青海特色高果聚糖大蒜品种，取自青海大学农林科学院园艺所资源圃，按照常规方法种植及采收。选取大小均匀、已解除休眠的大蒜鳞茎，播种于含栽培基质(草炭：珍珠岩＝1:1)的盆钵中，并置于植物光照培养箱中进行培养。培养条件：25/15℃(14/10h，白天/黑夜)，相对湿度为70％，光照强度为300μmol m^–2s^–1。培养至大蒜幼苗期，待苗高达10cm左右，进行以下处理：a.正常培养(对照，CK)：定期正常浇水至土壤湿润；b.干旱胁迫处理(DT)：通过停止浇水进行干旱胁迫处理。每处理3次重复，每重复10个盆钵，盆钵按完全随机区组设计。在干旱处理的第0、7、14、21、28、35d取大蒜叶片，对照组和干旱组各取3份样品，液氮速冻后置于-80℃保存，以便用于后续试验。

(2)总RNA的提取以及纯度、完整性检测

采用天根生化科技有限公司生产的TRNzol总RNA提取试剂(TRNzol Reagent,DP405)所提供的使用说明书提取大蒜叶片总RNA：取50-100mg新鲜叶片在液氮中充分迅速研磨，然后加入1mlTRNzol试剂，并将匀浆样品在室温下放置5min；4℃12000rpm(-13，400×g)离心10min后，将上清液放入新的离心管仲；加入200ul氯仿，盖好管盖，剧烈摇晃15s，然后在室温下放置3min；4℃12000rpm(-13，400×g)离心15min，样品会分为三层，将上层(水相层)转移到新的离心管中，并加入等体积的异丙醇，振荡混匀后在室温下放置大约30min；4℃12000rpm(-13，400×g)离心10min后，倒去上清液，但不要倒掉沉淀；加入1ml用去RNA酶水配制好的75％乙醇进行对沉淀的洗涤；4℃5000rpm(-2，300×g)离心3min后，倒出液体，但不要倒出沉淀，剩余的少量液体可进行短暂离心，然后用枪头在不吸到沉淀的情况下轻轻吸出剩余液体；室温放置大约3min左右进行晾干，然后根据实验需要，加入30-100ul(本实验加入了40ul)去RNA酶水反复进行吹打混匀，即可得到RNA。提取好的RNA可直接进行后续试验，或经液氮处理后，保存在-80℃环境下以便以后使用。

使用天根生化科技有限公司的TGem Spectrophotometer微量分光光度计(OSE-260)检测样品RNA的纯度(上样量为3ul)。然后吸取2ul样品RNA与loading buffer按1：1的比例混合后点入1％琼脂糖凝胶上样孔中进行跑胶(电压为220V，时间为20min)。将跑好的胶放入凝胶成像仪(Bio-Rad)中成像，已检测样品RNA的完整性。RNA检测结果如图1所示(共33个样品，其中包括0、7、14、21、28、35的对照处理和干旱处理样品)。

(3)cDNA合成

参照天根生化科技有限公司的FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(KR106)的使用说明书进行cDNA第一链合成。将合成的cDNA放置在-20℃冰箱进行保存以备后续试验。cDNA具体合成步骤如下：

a.将模板RNA在冰上解冻：5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RTBufer、RNase-Free ddH₂O在室温下解冻，解冻后迅速置于冰上。使用试剂之前将其进行混匀离心；(以下操作步骤需要在冰上进行。应先配制好的Mix混合液分装到每个反应管中，以保证配制的准确性。

b.按照下表1的反应体系配制混合液，并进行彻底混匀和简短离心，然后置于42℃水浴锅中，水浴3min。水浴后置于冰上放置。

表1gDNA去除反应体系

c.按照表2的反应体系进行混合液的配制。

表2反转录反应体系

d.将配制好的反转录反应中的混合液，加入步骤b所得的反应液中，充分混匀。

e.42℃，孵育15min；95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存(本试验中将cDNA放置在-20℃冰箱进行保存)。

(4)引物的设计与合成

根据已发表的大蒜1-SST(Guevara-Figueroa et al.，2015)和1-FEH(何林乾和黄雪松，2015)的基因序列，利用Primer 5.0软件设计引物。所用引物由华大基因公司合成。引物序列如表3所示。

表3实时荧光定量PCR引物序列

(5)内参基因的筛选

参考Liu等(2015)文献中的5个大蒜内参基因TUA、GAPDH、ACT、CYP和UBQ，按照表4中的信息合成引物序列。然后应用普通PCR技术，以样品cDNA为模板，分别对5个大蒜内参基因TUA、GAPDH、ACT、CYP和UBQ进行扩增。扩增产物采用1％琼脂糖凝胶检测。

表4内参基因引物序列

内参基因筛选结果如图2所示(1：TUA扩增产物；GAPDH扩增产物；ACT扩增产物；CYP扩增产物；UBQ扩增产物)。内参基因CYP扩增出的条带单一，且表达量相对其他内参基因较高，所得结果与Liu等(2015)中所述一致，故选择CYP作为本试验的内参基因。

(6)引物特异性检测

首先采用普通PCR对引物的通用性进行初步检测，然后利用实时荧光定量PCR对扩增产物进行熔解曲线分析。以cDNA为模版，分别以表1各对引物进行普通PCR引物的扩增。PCR反应体系为25μL：cDNA模板1.5μL，上、下游引物各1.0μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，ddH₂O 4μL。反应程序如下：94℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火1min(SST引物用的退火温度为60℃)，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min；结束后4℃保存。扩增产物采用1％琼脂糖凝胶检测。普通PCR引物特异性检测如图3-5所示(共33个样品，其中包括0、7、14、21、28、35的对照处理和干旱处理样品的扩增结果)。对照2000bp DNAMarker，所有样品扩增出的条带单一，且片段大小一致。说明已获得在胁迫各个时期通用的荧光定量PCR引物。

引物特异性荧光定量PCR检测如图6-8所示。经过实时荧光定量PCR后，分析其扩增产物的熔解曲线发现，三对引物均获得唯一的吸收峰(图4)，没有明显的引物二聚体出现，表明1-SST、1-FEH及CYP这三个基因的三对引物可作为实时荧光定量PCR检测拷贝数的引物。

(7)目的基因差异表达测定

利用实时荧光定量PCR对扩增产物进行熔解曲线分析和目的基因差异表达测定。参照天根生化科技有限公司的SuperReal荧光定量预混试剂—增强版试剂盒(SYBR Green,FP205)所提供的说明书，将配置好的混合液放置在Bio-Rad iQ5实时荧光定量仪中进行PCR扩增。说明书具体步骤如下：

a.在室温下溶解以下试剂：2×SuperReal PreMix Plus、模版cDNA、引物和RNase-Free ddH₂O，并进行彻底混匀。

b.按照表5的反应体系在冰上进行Real Time PCR反应液的配置：

表5实时PCR反应体系

c.盖上反应管，进行混匀和短暂离心，使所有溶液沉在管底。

d.将配置好的反应液置于实时荧光定量PCR仪中，采用二步法进行PCR反应：95℃预变性15min；(95℃变性10sec，60℃退火30sec)×40个循环。

e.根据最终结果报告的Ct值进行数据计算分析:对于Real-time QuantitativePCR增得到的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)，采用法进行目的基因相对定量分析，计算公式为△△Ct＝(△Ct待测样-△Ct对照样)＝(待测组目的基因平均Ct值-待测组内参基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct值-对照组内参基因平均Ct值)。

在本实施例中，干旱胁迫7d时，目的基因1-SST干旱处理下的平均Ct值为25.81，对照的平均Ct值为24.85；目的基因1-FEH干旱处理下的平均Ct值为26.81，对照的平均Ct值为26.62；内参基因CYP干旱处理下的平均Ct值为19.45，对照的平均Ct值为17.73。

其中，1-SST基因表达量具体计算步骤如下：

△Ct_干旱处理＝Ct_干旱处理－Ct_{干旱处理内参基因}＝25.81-19.45＝6.36

△Ct_对照＝Ct_对照－Ct_{对照内参基因}＝24.85-17.73＝7.12

﹣△△Ct＝﹣(△Ct_干旱处理－△Ct_对照)＝﹣(6.36－7.12)＝0.76

1-SST基因

即1-SST在干旱处理7d时的表达倍数相对于对照处理增加了1.69倍。

同样的方法计算可知，1-FEH在干旱处理7d时的表达倍数相对于对照处理增加了2.89倍。

干旱胁迫下1-SST和1-FEH的相对表达量变化趋势如图9-10所示。

序列表

<110> 青海大学

青海省农林科学院

<120> 一种大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法及应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttttttttc cgacggcttc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtaccaatg atcgggaata 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggtcgaat gaatcggata g 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggccattgt accagagttt 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctagagcac ggtattcag 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcggtaagtt ccagttct 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggctggtgc tgattacg 18

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtctgaagt gtatgaagta tgg 23

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggagttat ggttggaatg g 21

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcacgggat gttcttca 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaggacgaga acttcatc 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcaatatctc tcaccacttc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aagccaagat acaggacaag 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcataccacc tctcaatctc 20

Claims

1.一种大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法，其特征在于包括如下步骤：

2)设计目的基因蔗糖1-果糖基转移酶基因的特异性引物对：F:如SEQ ID NO.1所示，R:如SEQ ID NO.2所示；

设计目的基因果聚糖外切水解酶基因的特异性引物对：F:如SEQ ID NO.3所示，R:如SEQ ID NO.4所示；

4)qRT-PCR分别检测对照样目的基因平均Ct值、对照样内参基因平均Ct值、待测样目的基因平均Ct值和待测样内参基因平均Ct值，根据相对表达量＝△△Ct＝(△Ct待测样-△Ct对照样)＝(待测样目的基因平均Ct值-待测样内参基因平均Ct值)-(对照样目的基因平均Ct值-对照样内参基因平均Ct值)来计算目的基因的相对表达量；其中Ct值表示每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，设定的阈值为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

2.根据权利要求1所述的大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法，其特征在于内参基因TUA的特异性引物对：F:如SEQ ID NO.5所示，R:如SEQ ID NO.6所示。

3.根据权利要求1所述的大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法，其特征在于内参基因GAPDH的特异性引物对：F:如SEQ ID NO.7所示，R:如SEQ ID NO.8所示。

4.根据权利要求1所述的大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法，其特征在于内参基因ACT的特异性引物对：F:如SEQ ID NO.9所示，R:如SEQ ID NO.10所示。

5.根据权利要求1所述的大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法，其特征在于内参基因CYP的特异性引物对：F:如SEQ ID NO.11所示，R:如SEQ ID NO.12所示。

6.根据权利要求1所述的大蒜果聚糖代谢关键酶基因的定量检测方法，其特征在于内参基因UBQ的特异性引物对：F:如SEQ ID NO.13所示，R:如SEQ ID NO.14所示。

7.权利要求1～6任一项所述的方法在大蒜高糖抗逆育种中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于当不良环境胁迫7天时，蔗糖1-果糖基转移酶基因相对表达量>1.5或果聚糖外切水解酶基因相对表达量>2.5时，表示为高糖抗逆品种。