CN110079593A - 一种豚草、三裂叶豚草的鉴别方法 - Google Patents

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赵彩云
高珂晓
赵相健
李俊生
柳晓燕
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

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Abstract

本发明提供了一种简便、快捷鉴别豚草和三裂叶豚草的方法，其特征在于，通过对植株样品中DNA序列中ITS基因片段序列与基因库中的序列进行比对，即可分辨豚草与三叶豚草，属于植物鉴别领域。本发明选区植物中携带DNA片段的结构，通过PCR扩增，电泳，测序得到ITS序列，通过变异位点的比较，判别豚草与三裂叶豚草。本方法对样品的要求比传统形态分类学鉴定方法要求低，不要求植物的全株或某个器官完整，只需将待鉴定样品的的ITS基因片段序列与基因库中的序列进行比对，进行结果判定，为检验检疫带来便利。

Description

一种豚草、三裂叶豚草的鉴别方法
技术领域
本发明涉及鉴别入侵植物的方法，具体为一种鉴别豚草和三裂叶豚草的方法。
背景技术
豚草(Ambrosia artemisiifolia)和三裂叶豚草(Ambrosia trifida)是菊科豚草属一年生草本植物，原产于北美地区，是世界公认的恶性杂草。两种植物物种具有强大的适应性、繁殖力和生长力，并且具有化感作用，能够抑制其他植物生长并造成土壤贫瘠，花粉是过敏性鼻炎的主要病源，种子能够混杂于所有的作物中，传播到其他地区。豚草和三裂叶豚草先后于十九世纪三四十年代传入我国，目前已在我国东北、华东、华中及西北新疆地区大量发生，成为影响我国农业生产及生态环境的主要恶性杂草之一。由于这两种豚草属物种多成混生状态，易产生遗传变异丰富，适应性更强的杂交类型，并且针对豚草和三裂叶豚草的有效治理方法不同，因此在入侵物种的防控上对豚草和三裂叶豚草的区分具有重要意义，尤其对出入境检验检疫。
传统的植物鉴定方法主要依靠形态学对比和观察鉴定，但豚草属植物形态变异大，豚草和三裂叶豚草形态学特征很接近，难以区分，对鉴定技术力量要求较高，因此利用分子技术对两种物种进行区分对检验检疫以及防控治理有重要的现实意义。
Hebert等于2003年首次提出“DNA条形码”概念用于鉴别不同物种，即利用标准化的一个或几个DNA片段对目标物种进行序列分析，根据不同物种的核苷酸差异达到鉴定目的。目前，应用于植物物种鉴定的常用DNA条形码包括叶绿体基因片段trnH-psbA、psbK-I、atpF-H等间隔区序列，以及核基因片段核糖体内转录间隔区ITS。ITS序列是核糖体DNA内转录间隔区，包含5.8s rDNA分隔成的ITS1和ITS2的两个片段，总长度为600bp-700bp，其中5.85rDNA的长度非常保守，一般为163bp或164bp。作为18S-26S rDNA的一个组成部分，ITS在核基因组中是高度重复的，并且ITS序列具有高度变异性又有长度保守性，不仅能够为区分近缘类群提供丰富的遗传信息，又为测序带来了便利。因此，本发明采用ITS序列鉴别豚草和三裂叶豚草，确定入侵植物物种。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过ITS序列比对的方式，鉴别豚草和三裂叶豚草，改善了传统形态分类学鉴定方法要求高，需植物的全株或某个器官完整方能实现区分鉴别的问题。
通过前期的研究发现，豚草与三裂叶豚草在ITS序列的37处位点存在差异。通过对植株测序，识别ITS序列中突变位点上的碱基，并进行比对，即可鉴别豚草与三裂叶豚草。
为实现上述目的，本发明的提供的技术方案是：
步骤1：选取干燥的植物叶片，采用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提取干燥叶片DNA，以该DNA为模板，依次加入引物ITS1(5’-GAAGGATCATTGTCGAACCCT-3’)和ITS2(5’-AAACTCAGCGGGTAGTCCCG-3’)进行PCR扩增；
步骤2：PCR扩增产物经1％琼脂糖电泳检测后，进行双向测序；
步骤3：将ITS片段与ITS基因序列片段的基因库进行比对，确认其为豚草或三裂叶豚草。
其特征在于，步骤1中的扩增体系为：20μL 2×Taq PCR MasterMix，引物ITS1和ITS2各1μL，20ng·μL-1DNA模板1μL，去离子水17μL。
其特征在于，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
与现有技术相比，本发明方法对样品的要求比传统形态分类学鉴定方法要求低，传统形态分类学鉴定方法需要豚草或三裂叶豚草的全株，包括叶片、茎、花或果实，以确定其性状差异，完成鉴定。而本方法所需样品为植株上任何能获得DNA的部位，例如部分叶片或种子，不要求植物的全株或某个器官完整，只需将待鉴定样品的的ITS基因片段序列与基因库中的序列进行比对，进行结果判定，为检验检疫带来便利。
附图说明
图1：豚草与三裂叶豚草的ITS基因序列片段的基因谱比对。
具体实施方式
1、材料
选取豚草和三裂叶豚草干燥叶片，其中豚草采自18个不同地区，包括(北京、长春、汩罗、九江、泉州、黄冈、哈尔滨、青岛、抚顺、济南、马鞍山、梅州、贵州、来宾、韶关、新源、永州、牡丹江)，三裂叶豚草采自北京。
样品来源表：
2、PCR扩增：
取叶片材料适量，置于2ml离心管，加入小磁珠，使用Fastprep研磨仪中研磨成粉末，转速4.0，时间1min。采用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提取干燥叶片DNA，以该DNA为模板，依次加入引物ITS1(5’-GAAGGATCATTGTCGAACCCT-3’)和ITS2(5’-AAACTCAGCGGGTAGTCCCG-3’)进行PCR扩增。
扩增反应体系为：总体积40μL，包括20μL 2×Taq PCR MasterMix，引物ITS1和ITS2各1μL，20ng·μL-1DNA模板1μL，去离子水17μL。
扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
3、测序比对：
将上述PCR扩增产物经1％琼脂糖电泳检测，对其进行双向测序，并与ITS序列片段基因库进行比对，即可识别叶片的品种。
表1：ITS序列片段基因库
“*”代表缺失位点
通过与表1中的ITS序列片段的突变位点上的碱基进行比对，确认实验中Tri1～Tri4为三裂叶豚草，其余品种均为豚草。
以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种豚草、三裂叶豚草的鉴别方法，其特征在于，通过ITS基因序列片段的提取，识别突变位点，区分豚草与三裂叶豚草，方法包括：
步骤1：选取干燥的植物叶片，采用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提取干燥叶片DNA，以该DNA为模板，依次加入引物ITS1(5’-GAAGGATCATTGTCGAACCCT-3’)和ITS2(5’-AAACTCAGCGGGTAGTCCCG-3’)进行PCR扩增；
步骤2：PCR扩增产物经1％琼脂糖电泳检测后，进行双向测序；
步骤3：将ITS片段与ITS基因序列片段的基因库进行比对，确认其为豚草或三裂叶豚草。
2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，步骤1中的扩增体系为：20μL 2×TaqPCR MasterMix，引物ITS1和ITS2各1μL，20ng·μL-1 DNA模板1μL，去离子水17μL。
3.根据权利要求1或2任一项所述的鉴别方法，其特征在于，扩增程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
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